Summary
Qui, presentiamo un protocollo di microarrays della proteina extracellulare dello schermo per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando romanzo in elevato throughput. Inoltre descriviamo un metodo per migliorare la rilevazione delle interazioni proteina-proteina transitoria utilizzando complessi proteina-Microperlina.
Abstract
Fattori secreti, recettori di membrana-tethered e loro interattori sono regolatori principali di comunicazione cellulare e l'inizio della cascata di segnalazione durante l'omeostasi e la malattia e come tali rappresentano bersagli terapeutici privilegiate. Nonostante la loro rilevanza, queste reti di interazione rimangono notevolmente sottorappresentate nei database correnti; di conseguenza, più proteine extracellulari non hanno documentato associazione partner. Questa discrepanza è principalmente dovuto le sfide connesse con lo studio delle proteine extracellulari, compreso l'espressione di proteine funzionali e la debole, bassa affinità, interazioni della proteina spesso stabiliti tra recettori di superficie. Lo scopo di questo metodo è di descrivere la stampa di una libreria di proteine extracellulari in un formato di microarray per lo screening delle interazioni proteina-proteina. Per attivare il rilevamento delle interazioni deboli, è descritto un metodo basato sul multimerization della proteina query in fase di studio. Accoppiato a questo approccio basato su Microperlina multimerization per maggiore multivalenza, il microarray di proteine permette di rilevamento affidabile delle interazioni proteina-proteina transitoria in elevato throughput. Questo metodo offre un campione rapidi e a basso consumo-approccio per l'identificazione di nuove interazioni applicabile a qualsiasi proteina extracellulare. Stampa di microarray della proteina ed il protocollo di screening sono descritti. Questa tecnologia sarà utile per gli investigatori che cercano un metodo affidabile per la scoperta delle interazioni della proteina nello spazio extracellulare.
Introduction
Il metodo Recensito qui descrive la stampa di un insieme di proteine extracellulari in un formato di microarray, seguita da un metodo per lo screening di un target di interesse nei confronti di questa libreria. Abbiamo identificato multimerization proteina come un passo fondamentale per il rilevamento delle interazioni caratterizzate da affinità di legame basso. Per migliorare la rilevazione di queste interazioni, descriviamo un protocollo basato su multimerization della proteina di interesse utilizzando microsfere query.
Secreto e superficie-espresse proteine della cellula (collettivamente denominate proteine extracellulari) insieme ai loro partner interagenti sono regolatori chiave della comunicazione cellulare, di segnalazione e di interazione con il microambiente. Essi sono, pertanto, essenziale nella regolazione di molti processi fisiologici e patologici. Circa un quarto del genoma umano (≈5, 000 proteine) codifica per proteine extracellulari, che, dato il loro significato e accessibilità ai farmaci sistematicamente consegnati, rappresentano obiettivi chiave per droga sviluppo1. Di conseguenza, proteine extracellulari rappresentano oltre il 70% degli obiettivi della proteina con azione farmacologica nota per farmaci approvati sul mercato, conosciuto come il "proteoma trattabili". Nonostante la loro importanza e l'abbondanza, le reti di interazione (ePPI) extracellulare della proteina-proteina rimangono notevolmente sottorappresentate nei database disponibili. Questo è fondamentalmente a causa della natura complessa biochimica delle proteine extracellulari, che preclude loro caratterizzazione utilizzando tecnologie più disponibile2. In primo luogo, le proteine di membrana sono difficili da solubilizzare, un processo che coinvolge spesso condizioni di lavaggio difficili e detergenti; in secondo luogo, le proteine extracellulari spesso mancano rilevanti modificazioni post-traduzionali come glicosilazione che sono assenti quando queste proteine sono espresse in comunemente utilizzati sistemi eterologhi. Infine, interazioni tra recettori, quali co-recettori espressi sulle cellule immuni, sono spesso transitori e caratterizzate da bassissima affinità (KD nel μM ~ 1 a > 100 gamma μM). Complessivamente, la natura di queste proteine e la loro associazione partner di rendering più ampiamente utilizzate tecnologie quali la spettrometria di massa/purificazione di affinità (AP/MS) o lievito-due-ibrido, inadatto per il rilevamento delle interazioni nello spazio extracellulare 2 , 3.
Nel tentativo di superare queste sfide tecniche e accelerare la scoperta di nuove interazioni per proteine extracellulari, abbiamo sviluppato una copertura alta proteina extracellulare microarray4,5. I microarrays offrono il vantaggio di generare superfici ad alta densità con piccole quantità di campione e sono generalmente favorevoli agli studi elevato throughput. Studi basati su microarray di proteine precedentemente hanno fornito le comprensioni pertinenti in interazioni proteina per diversi organismi di modello, pur concentrandosi principalmente su interazioni citosolici o proteina specifica famiglie6,7, 8. Al contrario, limitati del lavoro è stato fatto per indagare le interazioni proteina extracellulare utilizzando questa tecnologia. Abbiamo sviluppato un metodo di microarray della proteina per attivare studi di ePPIs con la costruzione di una biblioteca completa e altamente diversificata di proteine secrete purificate e singola transmembrana (STM) recettori espressi come ricombinante domini extracellulari (ECD) fusi a comune tag per purificazione di affinità4. Il successo delle schermate di microarray di proteine si basa molto sull'istituzione di una biblioteca di proteine di alta qualità. Per l'espressione della proteina la biblioteca e la query, cellule di mammiferi o cellule di insetto preferenzialmente furono scelti come sistemi di espressione eterologa, per garantire la corretta aggiunta di modifiche post-traduzionali quali obbligazioni glicosilazione o bisolfuro. SDS-PAGE, cromatografia di esclusione di formato e diffusione della luce laser multi-angolo sono tecniche comunemente utilizzate per valutare la qualità delle proteine ricombinanti. La libreria di proteina è quindi individuata sui vetrini epoxysilane e conservata a-20 ° C per uso a lungo termine. Le concentrazioni di proteina di sopra di 0,4 mg/mL sono raccomandate per il protocollo descritto di seguito. Pertanto, basso-esprimere proteine possono richiedere un passaggio di concentrazione prima della stampa del campione e deposito. Tuttavia, un vantaggio principale di questa tecnica è la bassa quantità di proteina necessaria (50 μg di proteina è sufficiente effettuare > 2.000 schermi), al fianco di consumo di proteine minimo query (20-25 μg / schermo duplicati). Utilizzando il protocollo e le apparecchiature descritte qui, e purché le librerie siano disponibili, possono essere generati risultati per proteine singole query entro un giorno lavorativo.
Una sfida importante nella rilevazione di interazioni della proteina nell'ambiente extracellulare nasce dalla loro natura tipicamente transitoria o debole, che preclude l'identificazione di metodologie più comunemente utilizzati. Aumentando notevolmente l'avidità di legame, migliora la sensibilità per la rilevazione di proteine deboli interazioni9,10,11. Basato su questo principio abbiamo sviluppato un metodo per multimerize le proteine di query (espresse come fusione Fc) utilizzando proteine perline rivestite su A4,5. Per evitare qualsiasi potenziale inattivazione della proteina query di contrassegno casuale, abbiamo invece etichettare un'immunoglobulina umana irrilevante G con Cy5 e aggiungerlo insieme con la proteina di query per le perle di proteina A, eliminando così eventuali artefatti a causa la coniugazione diretta di un colorante per la proteina di interesse. Dato le affinità micromolari di diverse coppie di co-recettore, i complessi multivalenti migliorare notevolmente il rapporto segnale-rumore, rispetto alle proteine di query Fc-fusione proiettati come proteine solubili4.
In sintesi, l'obiettivo del presente protocollo è di descrivere la preparazione dei vetrini di microarray contenente una libreria di proteina extracellulare pre-esistenti per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando. Esaminiamo i passaggi per slide stampa, seguita da un protocollo per lo screening di una proteina di interesse contro la libreria di proteina extracellulare. Inoltre, descriviamo un metodo per migliorare il rilevamento di ePPIs basato su microsfere per raggiungere una maggiore avidità della proteina in esame. La tecnologia di microarray della proteina extracellulare qui descritta rappresenta un approccio veloce, affidabile ed efficace per lo screening e la rilevazione ePPI romanzo con bassi rapporti di falsi positivi e utilizzando solo quantità di microgrammo della proteina query sotto indagine. Questa tecnologia ha alimentato gli studi multipli che hanno fornito le comprensioni pertinenti in funzioni cellulari precedentemente sconosciute e vie di segnalazione per una varietà di recettori12,13, inclusi virali immunoregulators14, e possono essere utilizzate per-orphanize qualsiasi extracellulare della proteina di interesse.
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Protocol
1. generazione di una libreria di proteine umane extracellulare
- Compilare un elenco di recettori di superficie o proteine secrete di interesse per generare la libreria di microarray della proteina. Le famiglie di proteine specifiche (ad esempio, superfamiglia delle immunoglobuline) o proteine selettivamente espresso in particolare cella tipi possono essere selezionati per lo studio.
- Per recettori di superficie, è necessario determinare i limiti del dominio extracellulare (ECD) identificando il peptide segnale e regioni transmembrane utilizzando strumenti software. Alcuni dei pertinenti strumenti, disponibile gratuitamente on-line, si fa riferimento nella Tabella materiali15,16,17,18.
- Sintetizzare l'ECD per i geni di interesse e clone nel vettore pertinente. Proteine secrete o i recettori di ECD di STM fusi ad un numero di tag comuni affinità possono essere purificati da media condizionati delle cellule transfected con il vettore appropriato o da sistemi di espressione di baculovirus-insetto cella.
Nota: Sistemi basati su cellule mammiferi (ad esempio HEK/293 o cellule CHO) sono raccomandati per massimizzare la probabilità di corretto folding e aggiunta di rilevanti modifiche di posttranslational come glicosilazione. - Purificare le proteine con metodi di purificazione di affinità standard. Gli sforzi precedenti hanno descritto le procedure automatiche o semi-automatiche adatte per purificazione di centinaia di proteine, che possono essere scalate per generare l'insieme delle proteine di interesse9,19,20, 21.
Nota: SDS-PAGE, cromatografia di esclusione di formato (S) o multi-angolo laser light scattering (centri commerciali) si raccomanda di valutare qualsiasi aggregazione non-covalente e di controllo per la qualità complessiva delle preparazioni della proteina. - Proteine a 200 o 400 μg/mL quando possibile, di regolare e diluire scorte con 80% glicerolo per immagazzinaggio a lungo termine in fiale criogeniche a-20 ° C. Questi rappresentano gli stock master e devono essere accessibili solo quando necessario.
- Trasferire le aliquote di ogni proteina (100 μL) per piastre da 96 pozzetti (magazzino Piastre), sigillare con pellicola adesiva e conservare a-20 ° C fino alla preparazione del vetrino di microarray. Piastre di magazzino vengono generati per ridurre i cicli di gelo-disgelo e garantire stabilità proteica.
2. extracellulare della proteina Microarray stampa
- Utilizzare un microarrayer standard per la stampa di diapositive. Lo strumento utilizzato per il protocollo descritto qui ha una capacità di 57 diapositive/Esegui e utilizza una testina di stampa che tiene 48 perni spotting. Questi perni generare macchie di ~ 100 μm di diametro separati da una distanza di spot a spot di ~ 350 μm e disegna 0.25 μL per carico. In questa configurazione, si può ospitare fino a 8.000 punti per ogni diapositiva.
- Generare lavoro piastre (384 pozzetti, 10 μL di campione/pozzetto) dalle piastre stock. Eseguire questa operazione manualmente prima della stampa di diapositive utilizzando il microarrayer. Quindi, individuare proteine con perni spotting quill-tipo sui vetrini epoxysilane al 60% di umidità (per prevenire la disidratazione dei punti della proteina).
Nota: Cy3-labeled albumina di siero bovino (BSA) può essere individuato in duplicati tra ogni campione di proteina (5 μg/mL nei PBS/40% glicerolo) per visualizzare la matrice per maschera montaggio (Vedi sezione 4). Sebbene sia consigliato, questo passaggio è facoltativo. - A seguito di stampa, rimuovere le diapositive di microarray della proteina dall'ambiente umidificato e bloccarli durante la notte con 5% di latte in PBST per inattivare la superficie.
Nota: L'approccio consigliato è utilizzare un nebulizzatore ad ultrasuoni per generare una foschia fine di bloccare la soluzione che si deposita sulla superficie del vetrino. - Conservare gli scivoli a-20 ° C in glicerolo al 50% per evitare il congelamento.
3. preparazione di complessi multivalenti esca
Nota: Interazioni tra proteine extracellulari sono spesso caratterizzate da bassa affinità. Per abilitare il rilevamento di queste interazioni aumentando avidità di legame, un approccio multivalente basato sulla cattura la proteina query, espressa come Fc-etichetta ECD, era sviluppato4proteina rivestite con A microsfere.
- Etichettare il vettore utilizzato per il rilevamento con Cy5 monoreactive colorante IgG e separare il colorante libero utilizzo di colonne di dissalazione. Determinare la tintura ai rapporti di proteina misurando ultravioletta assorbanza a 280 e 650 nm.
Nota: I rapporti di proteina-tintura tra 2.0 e 4.0 sono normalmente utilizzati. Si raccomanda di far girare i coniugati di Cy5 a 100.000 x g per 15 min rimuovere potenziali aggregati solubili a causa del processo di etichettatura. - Determinare il rapporto ottimale della microperla / proteine mediante titolazione di proteina A contro una quantità costante della proteina di query. Il volume minimo saturante di perline dove nessuna proteina Fc-etichetta libera rimane, come misurato usando un'analisi competitiva determinata dalla biolayer interferometria, è usato per lo screening.
- Formare i complessi della microperla-proteina incubando la query Fc-etichettate e Cy5-IgG con proteina A microsfere e mescolare in un rotatore del tubo in PBS per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
- Per formare questi complessi, è possibile utilizzare la proteina query ad una concentrazione finale di 20 μg/mL. Per calcolare il rapporto molare della proteina query e Cy5-IgG, dividere il peso molecolare della proteina query dal peso molecolare del IgG (Da 150.000) e moltiplicare per 40 μg/mL per determinare la concentrazione di Cy5-IgG necessari.
- Supplemento campioni con proteina solubile A (1 mg/mL), immediatamente prima dell'incubazione con il microarray diapositive (vedere sezione 4.2) per impedire l'associazione di qualsiasi proteina libera A perline per le proteine di fusione Fc che possono essere presenti nell'array.
Nota: Il volume di reazione finale variano a seconda della camera di ibridazione stazione o incubazione utilizzata. La strumentazione descritta in Tabella materiali permette di incubazione del campione usando i volumi relativamente piccole (~ 200 µ l per vetrino).
4. extracellulare della proteina Microarray di Screening e di elaborazione.
Nota: Ci sono un numero di produttori che offrono piattaforme di elaborazione automatica. Se una stazione di ibridazione non è disponibile, la procedura seguente può essere eseguita manualmente, assicurando che ci sia un volume sufficiente di tampone per mantenere le diapositive sommersa in ogni momento.
- Scaldare i vetrini a temperatura ambiente e sciacquare con PBS/0.1% Tween 20 (PBST) per rimuovere il residuo glicerolo prima del caricamento sulla stazione di ibridazione.
- Utilizzare il seguente protocollo di screening:
- Lavare con PBST per 1 min.
- Caricare 200 μL di proteina di 1 mg/mL A in PBS/5% latte e incubare per 30 min evitare uncomplexed proteina un microsfere di legarsi alle proteine Fc-Tag che possono essere presenti nel microarray.
- Lavare 5 volte con PBST per 1 min.
- Caricare 200 μL di query: microsfere di complesse in presenza di proteina di 1 mg/mL A ed incubare per 30 min.
- Lavare con PBST per 1 min.
- Dopo l'ibridazione, sciacquare i vetrini con acqua, posto in singole provette coniche da 50 mL e a secco di filatura a 900 x g per 5 min.
- Infine, la scansione le diapositive con un microarray scanner appropriato per rilevare Cy3 (se è stato stampato BSA-Cy3) e Cy5 fluorescenza eccitando a 532 e 635 nm, rispettivamente.
- Eseguire analisi di dati utilizzando l'analisi di dati di microarray accompagnamento. L'elenco di matrice pertinente (come file. GAL) viene caricato nel software di estrazione dati. In questa fase, è necessario utilizzare i punti di Cy3-BSA per trovare blocchi e utilizzare le opzioni di adattamento automatico del software, seguita da allineamento manuale delle caratteristiche quando necessario. Salvare i file come file di .gpr per ulteriori analisi.
5. analisi dei dati
- Salvare i dati come file GPR e processo in R utilizzando il pacchetto limma, comunemente utilizzato per l'analisi di microarray dati4,5.
- Per la pre-elaborazione, sfondo correzione e normalizzazione all'interno della diapositiva. Poiché ogni proteina è stampata in punti duplicati, combinare entrambi replicando la determinazione per creare un unico punteggio per quella proteina nella libreria.
- Calcolare i punteggi per ogni diapositiva e analizzare i risultati per l'intersezione dei candidati ad alto punteggio tra le diapositive.
- Utilizzare microarray duplicati da stampa-cicli separati per controllo per variabilità di diapositiva e trame di intersezione che rappresenta dati di entrambi gli schermi per chiamare hits finale.
- Infine, eseguire un ulteriore livello di filtraggio per escludere promiscue proteine all'interno della matrice. Tali leganti non specifici sono identificati come proteine superiore a una soglia specifica frequenza di accessi come definito dall'utente attraverso schermi indipendenti.
Nota: Questo protocollo è descritto in dettaglio in Tom et al 20135. Nel nostro caso il raccoglitore non specifica chiamata si basa sulla determinazione del cumulativo preda tasso di successo, e viene utilizzata una soglia di eliminazione basate sui dati del 5%.
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Representative Results
Uno schema del flusso di lavoro per la tecnologia di microarray della proteina extracellulare è illustrato nella Figura 1. Una volta che le diapositive di microarray contenente la libreria di proteina extracellulare sono disponibili, lo screening della proteina di interesse e analisi dei dati può essere completato entro un giorno. Fisiologicamente rilevanti molte interazioni tra recettori di membrana incorporato sono caratterizzati da punti di forza molto debole associazione (KD nella gamma micromolar). Per migliorare la rilevazione di tali interazioni, è stato sviluppato un metodo basato sulla query multimerization di proteina (espressa come fusione Fc) su proteina A-microsfere. Questo protocollo è descritto nel testo, e un esempio rappresentativo della performance di questo approccio per migliorare il rilevamento di PPI è illustrato nella Figura 2.
Un esempio rappresentativo di una schermata di microarray della proteina è presentato nella Figura 3. Nell'esempio riportato, una proteina di immunomodulatori orfani adenovirus umano è schermata per le interazioni contro una libreria costituita da più di 1.500 recettore ECD o secernuto proteine14. Come descritto, l'ECD della proteina virale è recombinantly espresso come una proteina di fusione Fc e quindi incubata con microsfere rivestite con A di proteine per formare complessi multivalenti. I complessi della proteina sono stati selezionati usando una stazione di ibridazione per ridurre al minimo le operazioni manuali, tuttavia, schermi simili possono essere eseguiti utilizzando una camera di ibridazione o dispositivi simili. Si consiglia di eseguire duplicati schermi utilizzando diapositive stampate in cicli separati spotting per controllare qualsiasi variabilità durante la tiratura. La figura mostra le trame di intersezione risultante dagli schermi duplicati, indipendente. Interazioni positive e generale sfondo della diapositiva sono visualizzati prontamente su scansione delle piastre (Cy5 fluorescenza), facilitando la chiamata hit. Si noti che è consigliabile individuare ogni recettore nella biblioteca di duplicati in modo da aumentare la fiducia del colpo. Per la maggior parte delle proteine di query, nessuno, uno o pochi colpi sono osservati, dimostrando la specificità del metodo per il rilevamento degli IPP.
Alcune proteine di query Visualizza alta priorità bassa come rilevato dall'associazione di un numero insolitamente elevato di proteine all'interno della matrice e/o alla diapositiva. Nella nostra esperienza, tale fondo è osservato per solo un piccolo numero di proteine. Diversi fattori relativi alla natura della proteina potrebbero influenzare le interazioni non specifiche, quali il riconoscimento di motivi di glicosilazione. Figura 3 Mostra un esempio di una proteina virale proiettato contro la libreria di microarray che ha mostrato di alta priorità bassa, precludendo l'identificazione dei risultati specifici. Mentre piccole modifiche nel protocollo possono essere considerate per diminuire background (ad esempio aumento sale o concentrazione detergente), in questi casi si consiglia di esplorare metodi alternativi per la deorphanization della proteina in esame.
Figura 1: microarrays della proteina extracellulare per l'identificazione rapida e robusta di interazioni recettore-ligando. (Passaggio 1) Una libreria di proteine extracellulari di interesse viene compilata. (Passaggio 2) Le proteine purificate sono stampate su epoxysilane diapositive utilizzando una stampante di microarray e conservate a-20 ° C. (Passaggio 3) La proteina di query di interesse è multimerized su microsfere per maggiore avidità e rilevamento delle interazioni proteina-proteina transitoria. Un IgG fluorescente è complessato con la query: microsfere come veicolo inerte con etichetta. (Passaggio 4) Screening per partner di legame di una proteina di query. La proteina fluorescente query complessa è schermata contro il microarray di proteine extracellulari utilizzando una stazione di ibridazione per l'elaborazione automatizzata diapositiva. (Passo 5) Diapositive vengono quindi visualizzati utilizzando uno scanner di microarray. Le macchie di BSA-Cy3 possono essere osservate nel canale 535 nm e i successi che hanno reso dalla schermata possono essere osservati come duplicati macchie a 635 nm. Analisi dei dati per la chiamata hit viene eseguito creando trame di intersezione dei due esperimenti indipendenti. Colpi sono chiamati base su reciprocamente punteggi sopra priorità bassa, come descritto nella sezione protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: migliorata del segnale attraverso la formazione di complessi multivalenti per la proteina di query. (A) Multimerization delle proteine di query. Proteine di query sono espresse come ricombinante Fc fusioni e accoppiati alle microperle A proteine per formare complessi multimerized. (B) alta-avidità conduce al rilevamento delle interazioni di bassa affinità. L'avidità offerto dai risultati della proteina di multimerized query nella stabilizzazione delle interazioni deboli sul microarray di proteine, portando a più alto segnale rumore rapporti e avanzata chiamata hit. Trame Mostra risultati di vagliatura per CD200, proiettato in una Microperlina complesso, o di una proteina solubile direttamente marcati con Cy5 colorante abilitare la visualizzazione dei successi. Multimerization (barre rosse) permette di rilevare robusto il partner di associazione di bassa affinità CD200R1, presente in libreria di microarray della proteina, con rapporto segnale/rumore significativo in confronto con la stessa proteina proiettata come un prodotto solubile (barre blu). Barre grigie indicano non specifici leganti. Solo le top 10 interazioni sono state rappresentate nella trama. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: tecnologia di microarray della proteina per l'identificazione delle interazioni virus-ospite di romanzo recettore-recettore. (A) Risultati individuazione esemplare del ricevitore per una proteina di orfani adenoviral immunomodulatori. Le immagini rappresentano microarray in scansioni, mostrando risultati da proteine avvistati in duplicati (rosso). Le analisi vengono eseguite in duplicati di controllo per qualsiasi diapositiva variabilità e risultati rappresentati come trame di intersezione. Nelle trame, i puntini rossi e blu rappresentano hit chiamate solo su una matrice di replica, mentre puntini neri rappresentano intersecanti hits da entrambi i funzionamenti indipendenti. La biblioteca di microarray intero viene stampata su due slitte per facilità d'uso, dato il numero di proteine presenti nella raccolta e per garantire la separazione netta e sufficiente per ogni proteina individuo avvistato sulla matrice. (B) schermo di proteina virale che esibiscono un'elevato background che preclude colpita chiamata. Alcune proteine di query possono visualizzare alta priorità bassa, come rilevato dal legame con proteine multiple e/o le diapositive, pertanto ponendo sfide per l'identificazione dei successi di punteggi alti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un numero significativo di recettori orfani rimanga nel genoma umano, e nuovi interattori continuano ad emergere per proteine extracellulari con ligandi precedentemente caratterizzati. Definizione delle interazioni recettore-ligando in umani e organismi modello è essenziale per comprendere i meccanismi che determinano la comunicazione cellulare durante l'omeostasi, come pure la disregolazione che conducono alla malattia e quindi informare nuovi o migliorati opzioni terapeutiche. Tuttavia, rilevamento delle interazioni proteina extracellulare di tecnologie ampiamente utilizzate ha rappresentato un ostacolo significativo principalmente a causa delle sfide tecniche connesse per la biochimica dei recettori cellulari e loro interattori. In questo rapporto, descriviamo l'uso di un microarray di proteine extracellulari per lo screening di proteine di query di interesse, con enfasi sull'utilizzazione dei complessi della microperla per migliorare il rilevamento degli IPP.
Probing interazioni recettore-recettore è particolarmente impegnativo, come molte coppie fisiologicamente rilevanti sono caratterizzate da molto debole interazione con affinità di associazione nella gamma micromolar2,3. Potenziamento di avidità attraverso multimerization ha dimostrato di essere una strategia utile per aumentare la sensibilità per rilevazione di bassa affinità PPIs. Abbiamo sviluppato un metodo basato su proteine di fusione Fc, per la formazione efficiente di multivalenti Microperlina-proteina query complessi4. Multimerization della proteina query è un passo fondamentale per rilevazione di bassa affinità PPIs. Come mostrato nell'esempio in Figura 2, questo metodo migliora significativamente il segnale in confronto con la stessa proteina di query proiettata come un analita (non complessato) solubile, pur mantenendo il fondo minimo. In alternativa, le schermate di microarray della proteina possono essere eseguite con la proteina solubile Cy5-labeled query, un approccio che è compatibile con qualsiasi tag di fusione e che può essere sufficiente per l'identificazione delle interazioni più stabile, più alta affinità, come quelli tra alcuni ligandi solubili e dei loro recettori. Si noti che poiché l'avidità è aumentato attraverso multimerization della query su microsfere, il segnale di microarray non è una misura quantitativa della forza di interazione. Piuttosto, affinità di associazione dovrebbe essere calcolata con le versioni monomeriche delle proteine in corso di valutazione. Inoltre, è altamente consigliabile che riscontri identificati attraverso la tecnologia microarray sono convalidati mediante metodi indipendenti. Usiamo ordinariamente risonanza plasmonica di superficie come un metodo biofisico di gold standard per gli studi PPI e misura della cinetica di legame.
Anche se fuori l'ambito della presente relazione, si deve osservare che il successo di qualsiasi sforzo di selezione utilizzando la tecnologia microarray pesantemente si basa sulla selezione e la disponibilità di una biblioteca di proteine di alta qualità. Criteri pertinenti per la selezione di proteine extracellulari sono stati precedentemente pubblicati4,22. Una serie di strumenti utili per la stima delle caratteristiche rilevanti della proteina (come eliche transmembrane o peptidi di segnale) è liberamente disponibile online, tra cui i seguenti server: SignalP15, TMHMM16, Phobious17e TOPCONS 18. Metodi eccellenti documenti che descrivono i metodi di purificazione di affinità sono disponibili altrove. Va anche ricordato che la generazione di biblioteca di microarray della proteina si basa sulla produzione di proteina ECDs come solubili prodotti ricombinanti, e pertanto questo approccio permette di studi di tipo I, tipo II e GPI ancorate delle cellule recettori di superficie e secreto proteine, ma non è generalmente adatto per multitransmembrane contenenti proteine quali recettori accoppiati a proteine G. La purificazione di centinaia di proteine come proteine ricombinanti solubile richiede notevoli sforzi logistici e può essere molto risorse - e che richiede tempo. Tuttavia, con la diminuzione dei costi di sintesi di geni e un maggiore rendimento dei sistemi di purificazione della proteina, generazione della libreria è ora relativamente più veloce e più conveniente. In alternativa, fonti commerciali offrono purificate proteine extracellulari che possono essere acquistate in quantità microgrammi, che sono sufficienti per la generazione di una libreria di microarray della proteina durevole data i piccoli requisiti per la stampa di diapositive. Queste limitazioni in deroga, la tecnologia microarray offre grandi vantaggi come minimo consumo di reagenti di proteina, letture veloce (PPIs nuovo può essere identificato all'interno di un giorno) e la strumentazione a prezzi accessibili. Inoltre, dopo aver definite i costrutti e le condizioni di purificazione, purificazioni su piccola scala possono produrre abbastanza materiale per preparare migliaia di matrici.
Infine, in alcuni casi, è osservata relativamente elevato background, apparendo come associazione a molte proteine sulla libreria di microarray. Ci sono molteplici fattori che possano influenzare il legame non specifico. Ad esempio, alcune proteine possono essere altamente addebitati, o interagiscono con carboidrati, pari al fondo tramite il riconoscimento di motivi comuni. Allo stesso modo, legame non specifico può anche essere a causa della natura della proteina query, come ad esempio il riconoscimento di motivi di acido sialico, trovato in più altre proteine. Come espandono le librerie di microarray, è più probabile che che un elenco comune di leganti non specifici potrebbe essere presente. Tali leganti non specifici possono essere identificati dal loro comportamento di rilevamento su vari schermi contro le proteine di query non correlate. Si consiglia di generare un elenco dei leganti non specifici attraverso schermi, per migliorare la specifica vocazione di colpo. Nel nostro caso, abbiamo trovato che l'applicazione di un taglio del 5% (cioè, una proteina è contrassegnata come non specifici se rilevato come legante è 5% o più degli schermi di proteina query indipendenti) è importante per ridurre i falsi positivi. Si noti che se lo scopo principale dei saggi è quello di eseguire solo alcune schermate selezionati, non può essere utile per sviluppare un'analisi statistica. In questo caso, potrebbe non essere fattibile per rilevare falsi positivi a causa di un set di dati limitato, e pertanto si consiglia che la particolare enfasi è posta sulla conferma dei successi utilizzando metodi alternativi.
Anticipiamo che i microarrays della proteina extracellulare, specialmente in combinazione con multimerization metodi per il rilevamento delle interazioni recettore-ligando transitoria, continuerà ad offrire una piattaforma unica per l'identificazione rapida e robusta di romanzo PPI in lo spazio extracellulare.
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Disclosures
B.H., Santini-R e n. m-M. sono dipendenti di Genentech e azioni proprie nel gruppo Genentech Inc/Roche.
Acknowledgments
Ringraziamo Philamer Calses e Kobe Yuen per leggere criticamente il manoscritto. Siamo grati a Randy Yen per la consulenza tecnica eccellente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
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