Summary
यहां, हम उच्च प्रवाह में उपंयास रिसेप्टर ligand बातचीत की पहचान के लिए स्क्रीन extracellular प्रोटीन microarrays के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम भी प्रोटीन-microbead परिसरों का उपयोग करके क्षणिक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का पता लगाने को बढ़ाने के लिए एक विधि का वर्णन ।
Abstract
स्रावित कारकों, झिल्ली सीमित रिसेप्टर्स, और उनके बातचीत भागीदारों सेलुलर संचार और homeostasis और रोग के दौरान कैस्केडिंग संकेत की दीक्षा के मुख्य नियामकों हैं, और इस तरह के रूप में प्रधानमंत्री चिकित्सीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं. उनकी प्रासंगिकता के बावजूद, इन संपर्क नेटवर्क मौजूदा डेटाबेस में काफी प्रतिनिधित्व रह; इसलिए, सबसे extracellular प्रोटीन कोई प्रलेखित बाध्यकारी भागीदार है । यह विसंगति मुख्य रूप से कार्यात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति सहित extracellular प्रोटीन के अध्ययन के साथ जुड़े चुनौतियों के कारण है, और कमजोर, कम अपनत्व, प्रोटीन बातचीत अक्सर सेल सतह रिसेप्टर्स के बीच स्थापित. इस पद्धति का उद्देश्य प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की स्क्रीनिंग के लिए microarray स्वरूप में extracellular प्रोटीन्स की एक लाइब्रेरी की छपाई का वर्णन करना है. कमजोर बातचीत का पता लगाने को सक्षम करने के लिए, एक अध्ययन के तहत क्वेरी प्रोटीन के multimerization पर आधारित विधि वर्णित है । वृद्धि हुई multivalency के लिए इस microbead आधारित multimerization दृष्टिकोण के लिए युग्मित, प्रोटीन microarray उच्च प्रवाह में क्षणिक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का मजबूत पता लगाने की अनुमति देता है । इस विधि किसी भी extracellular प्रोटीन के लिए लागू नए बातचीत की पहचान के लिए एक तेजी से और कम नमूना लेने-दृष्टिकोण प्रदान करता है. प्रोटीन microarray प्रिंटिंग और स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल बताए गए हैं । यह तकनीक extracellular अंतरिक्ष में प्रोटीन इंटरैक्शन की खोज के लिए एक दमदार विधि की मांग करने वाले जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होगी ।
Introduction
इस विधि की समीक्षा यहां एक microarray प्रारूप में extracellular प्रोटीन का एक संग्रह के मुद्रण का वर्णन करता है, इस पुस्तकालय के खिलाफ ब्याज की एक लक्ष्य की स्क्रीनिंग के लिए एक विधि द्वारा पीछा किया । हम कम बाध्यकारी समानताएं द्वारा विशेषता बातचीत का पता लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में प्रोटीन multimerization की पहचान की है । इन बातचीत का पता लगाने को बढ़ाने के लिए, हम एक microbeads का उपयोग ब्याज की क्वेरी प्रोटीन के multimerization के आधार पर प्रोटोकॉल का वर्णन ।
गुप्त और कोशिका की सतह-व्यक्त प्रोटीन (सामूहिक रूप से extracellular प्रोटीन) के साथ साथ उनके बातचीत भागीदारों सेलुलर संचार के प्रमुख नियामकों हैं, संकेतन और microenvironment के साथ बातचीत । वे कर रहे हैं, इसलिए, कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को विनियमित करने में आवश्यक. मानव जीनोम के लगभग एक चौथाई (≈ ५,००० प्रोटीन) extracellular प्रोटीन है, जो, उनके महत्व और व्यवस्थित दवाओं के लिए पहुंच दिया, दवा के विकास के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करने के लिए encodes1। नतीजतन, extracellular प्रोटीन बाजार पर अनुमोदित दवाओं के लिए ज्ञात औषधीय कार्रवाई के साथ प्रोटीन लक्ष्य के ७०% से अधिक प्रतिनिधित्व करते हैं, "druggable proteome" के रूप में जाना जाता है । उनके महत्व और बहुतायत के बावजूद, extracellular प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन (एपपि ने) नेटवर्क उपलब्ध डेटाबेस में उल्लेखनीय रूप से प्रतिनिधित्व करते रहते हैं । यह मौलिक extracellular प्रोटीन है, जो सबसे उपलब्ध प्रौद्योगिकियों2का उपयोग कर अपने लक्षण वर्णन precludes के जटिल जैव रासायनिक प्रकृति के कारण है । सबसे पहले, झिल्ली प्रोटीन solubilize, एक प्रक्रिया है कि अक्सर कठोर धोने की स्थिति और डिटर्जेंट शामिल करने के लिए मुश्किल है; दूसरे, extracellular प्रोटीन अक्सर ऐसे glycosylation के रूप में प्रासंगिक पोस्ट अनुवाद संशोधनों की कमी है कि अनुपस्थित रहे है जब इन प्रोटीन आमतौर पर इस्तेमाल किया heterologous प्रणालियों में व्यक्त कर रहे हैं । अंत में, रिसेप्टर्स के बीच बातचीत, जैसे सह के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर व्यक्त रिसेप्टर्स, अक्सर क्षणिक होते हैं और बहुत कम समानताएं द्वारा विशेषता (KD में ~ 1 माइक्रोन के लिए > 100 माइक्रोन रेंज). कुल मिलाकर, इन प्रोटीन और उनके बाध्यकारी भागीदारों की प्रकृति इस तरह के संबंध शुद्धि के रूप में सबसे व्यापक रूप से उपयोग प्रौद्योगिकियों, रेंडर/मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी/MS) या खमीर-दो-संकर, extracellular अंतरिक्ष में बातचीत का पता लगाने के लिए अनुपयुक्त 2 , 3.
इन तकनीकी चुनौतियों को दूर करने और extracellular प्रोटीन के लिए उपंयास बातचीत की खोज में तेजी लाने के प्रयास में, हम एक उच्च कवरेज extracellular प्रोटीन microarray4,5विकसित किया है । Microarrays नमूना की छोटी मात्रा के साथ उच्च घनत्व सतहों पैदा करने का लाभ प्रदान करते हैं, और आम तौर पर उच्च प्रवाह अध्ययन के लिए उत्तरदायी हैं । प्रोटीन microarray आधारित अध्ययन पहले कई मॉडल जीवों के लिए प्रोटीन बातचीत में प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है, हालांकि मुख्य रूप से cytosolic बातचीत या विशिष्ट प्रोटीन परिवारों पर ध्यान केंद्रित6,7, 8. इसके विपरीत इस तकनीक का इस्तेमाल करते हुए extracellular प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए सीमित काम किया गया है । हम एक प्रोटीन microarray विधि विकसित की है एक व्यापक और अत्यधिक विविध पुस्तकालय के निर्माण द्वारा ePPIs के अध्ययन को सक्षम शुद्ध स्रावित प्रोटीन और एकल transmembrane (STM) रिसेप्टर्स रिकॉमबिनेंट extracellular डोमेन (ECD) के रूप में व्यक्त करने के लिए जुड़े समानता शुद्धि के लिए आम टैग4. प्रोटीन microarray स्क्रीन की सफलता एक उच्च गुणवत्ता प्रोटीन पुस्तकालय की स्थापना पर भारी निर्भर करता है । पुस्तकालय और क्वेरी प्रोटीन दोनों की अभिव्यक्ति के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं या कीट कोशिकाओं को तरजीही रूप से heterologous एक्सप्रेशन सिस्टम के रूप में चुना गया था, glycosylation या disulphide बांड जैसे पोस्ट-शोधों संशोधनों के उचित अतिरिक्त सुनिश्चित करने के लिए. एसडीएस-पृष्ठ, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी और बहु कोण लेजर प्रकाश कैटरिंग तकनीक सामांयतः रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रोटीन पुस्तकालय तो epoxysilane स्लाइड पर देखा जाता है और लंबी अवधि के उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । ०.४ मिलीग्राम/एमएल के ऊपर प्रोटीन सांद्रता नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के लिए सिफारिश की है । इसलिए, कम व्यक्त प्रोटीन एक एकाग्रता कदम से पहले नमूना मुद्रण और भंडारण की आवश्यकता हो सकती है । फिर भी, इस तकनीक का एक मुख्य लाभ की आवश्यकता प्रोटीन की छोटी मात्रा है (५० प्रोटीन की μg > 2000 स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है), न्यूनतम क्वेरी प्रोटीन की खपत के साथ (20-25 μg प्रति डुप्लिकेट स्क्रीन). प्रोटोकॉल और उपकरणों का उपयोग यहां वर्णित है, और प्रदान की पुस्तकालयों उपलब्ध हैं, व्यक्तिगत क्वेरी प्रोटीन के लिए परिणाम एक कार्य दिवस के भीतर उत्पंन किया जा सकता है ।
extracellular वातावरण में प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में एक प्रमुख चुनौती उनके विशिष्ट रूप से कमजोर या क्षणिक प्रकृति है, जो सबसे अधिक इस्तेमाल के तरीके से precludes पहचान से उठता है । बाध्यकारी avid बहुत कमजोर प्रोटीन बातचीत9,10,11का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि. इस सिद्धांत के आधार पर हम क्वेरी प्रोटीन multimerize करने के लिए एक विधि विकसित (एफसी फ्यूजन के रूप में व्यक्त) प्रोटीन a-लेपित मोती4,5का उपयोग कर । यादृच्छिक लेबलिंग द्वारा क्वेरी प्रोटीन की किसी भी संभावित निष्क्रियता से बचने के लिए, हम बजाय Cy5 के साथ एक अप्रासंगिक मानव immunoglobulin जी लेबल और यह प्रोटीन एक मोतियों के लिए क्वेरी प्रोटीन के साथ जोड़ने के लिए, इस प्रकार के प्रत्यक्ष विकार के कारण किसी भी कलाकृतियों को नष्ट करने प् याज के प्रोटीन को डाई करें । कई सह रिसेप्टर जोड़े के micromolar समानताएं को देखते हुए, multivalent परिसरों बहुत शोर अनुपात करने के लिए संकेत को बढ़ाने, एफसी-फ्यूजन क्वेरी प्रोटीन घुलनशील प्रोटीन के रूप में जांच की तुलना में4.
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य रिसेप्टर-ligand बातचीत की पहचान के लिए एक पूर्व मौजूदा extracellular प्रोटीन पुस्तकालय युक्त microarray स्लाइड की तैयारी का वर्णन करने के लिए है. हम स्लाइड मुद्रण, extracellular प्रोटीन पुस्तकालय के खिलाफ ब्याज की एक प्रोटीन की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल के बाद के लिए चरणों की समीक्षा करें । इसके अलावा, हम अध्ययन के तहत प्रोटीन की वृद्धि की शौकीनता को प्राप्त करने के लिए microbeads के आधार पर ePPIs के बढ़ाया पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन । extracellular प्रोटीन microarray प्रौद्योगिकी यहां वर्णित एक तेज, मजबूत और प्रभावी जांच और कम झूठी सकारात्मक अनुपात के साथ उपंयास एपपि ने का पता लगाने के लिए दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, और क्वेरी प्रोटीन के तहत केवल माइक्रोग्राम मात्रा का उपयोग करके जांच. इस प्रौद्योगिकी के कई अध्ययनों है कि पहले से अज्ञात सेलुलर कार्यों में प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है ईंधन है और12,13वायरल immunoregulators14सहित रिसेप्टर्स की एक किस्म के लिए संकेत रास्ते, और de-orphanize ब्याज की किसी भी extracellular प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Extracellular मानव प्रोटीन की एक पुस्तकालय की पीढ़ी
- सेल सतह रिसेप्टर्स या ब्याज की गुप्त प्रोटीन की एक सूची के लिए प्रोटीन microarray पुस्तकालय का निर्माण संकलित करें । विशिष्ट प्रोटीन परिवारों (उदाहरण के लिए, immunoglobulin superfamily) या प्रोटीन चुनिंदा विशेष रूप से कोशिका प्रकार में व्यक्त अध्ययन के लिए चुना जा सकता है ।
- सेल सतह रिसेप्टर्स के लिए, extracellular डोमेन (ECD) सीमाओं के संकेत पेप्टाइड और transmembrane सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग क्षेत्रों की पहचान करके निर्धारित करते हैं । प्रासंगिक उपकरणों में से कुछ, आज़ादी से उपलब्ध ऑनलाइन, सामग्री की तालिकामें संदर्भित कर रहे हैं15,16,17,18.
- संबंधित वेक्टर में ब्याज और क्लोन के जीन के लिए ECD को संश्लेषित करना । स्रावित प्रोटीन या STM रिसेप्टर्स के ECD आम संबध टैग की एक संख्या से जुड़े हुए कोशिकाओं की कंडीशन्ड मीडिया से शुद्ध किया जा सकता है transfected उपयुक्त सदिश के साथ, या baculovirus-कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली से.
नोट: स्तनधारी सेल-आधारित सिस्टम (जैसे HEK/293 या चो cells) उचित प्रोटीन तह और glycosylation जैसे प्रासंगिक posttranslational संशोधनों के अलावा की संभावना को अधिकतम करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । - मानक अपनत्व शोधन विधियों द्वारा प्रोटीन शुद्ध । पिछले प्रयासों स्वचालित या अर्द्ध स्वचालित प्रक्रियाओं प्रोटीन के सैकड़ों के शुद्धिकरण के लिए उपयुक्त वर्णित है, जो ब्याज9,19,20के प्रोटीन का सेट उत्पन्न करने के लिए स्केल किया जा सकता, 21. शी.
नोट: एसडीएस-पृष्ठ, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (ओं), या बहु कोण लेजर लाइट कैटरिंग (मॉल) किसी भी गैर आबंध एकत्रीकरण का आकलन करने के लिए और प्रोटीन की तैयारी की समग्र गुणवत्ता के लिए नियंत्रित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । - २०० या ४०० μg/एमएल के लिए प्रोटीन समायोजित करें जब भी संभव हो, और ८०% ग्लिसरॉल के साथ शेयरों को कम-20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोजेनिक शीशियों में लंबी अवधि के भंडारण के लिए । इन मास्टर शेयरों का प्रतिनिधित्व करते है और केवल जब आवश्यक तक पहुंचा जाना चाहिए ।
- प्रत्येक प्रोटीन के aliquots स्थानांतरण (१०० μL) ९६ करने के लिए-well प्लेट्स (स्टॉक प्लेट्स), चिपकने वाला पंनी के साथ सील, और स्टोर पर-20 ° c जब तक microarray स्लाइड तैयारी । स्टॉक प्लेटें फ्रीज-गल चक्र को कम करने और प्रोटीन स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए उत्पंन कर रहे हैं ।
2. Extracellular प्रोटीन Microarray छपाई
- स्लाइड मुद्रण के लिए किसी मानक microarrayer का उपयोग करें । यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किया गया साधन ५७ स्लाइड की क्षमता है/भागो और एक printhead होल्डिंग का उपयोग करता है ४८ खोलना पिन । ये पिन के धब्बे उत्पंन ~ १०० माइक्रोन के स्थान से अलग व्यास ~ ३५० माइक्रोन के स्थान की दूरी और ड्रॉ प्रति लोड ०.२५ μL । इस विंयास के तहत, स्लाइड प्रति ८,००० धब्बे को समायोजित किया जा सकता है ।
- काम प्लेटें जनरेट करें (३८४ अच्छी तरह से प्लेटें, 10 μL नमूना/ microarrayer का उपयोग करके स्लाइड मुद्रण से पहले यह चरण मैंयुअली निष्पादित करें । फिर, कलम के साथ स्पॉट प्रोटीन प्रकार ६०% आर्द्रता पर epoxysilane स्लाइड पर पिंस खोलना (प्रोटीन स्पॉट के निर्जलीकरण को रोकने के लिए) ।
नोट: Cy3-लेबल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) प्रत्येक प्रोटीन नमूने के बीच डुप्लिकेट में देखा जा सकता है (5 μg/एमएल में पंजाब/मास्क फिटिंग के लिए सरणी कल्पना करने के लिए (अनुभाग 4 देखें) । हालांकि अनुशंसित, यह चरण वैकल्पिक है । - मुद्रण के बाद, humidified वातावरण से प्रोटीन microarray स्लाइड को हटाने और सतह को निष्क्रिय करने के लिए PBST में 5% दूध के साथ उन्हें रातोंरात ब्लॉक.
नोट: पसंदीदा तरीका एक अल्ट्रासोनिक fogger का उपयोग करने के लिए स्लाइड सतह पर बसा समाधान अवरुद्ध की एक ठीक धुंध उत्पंन करने के लिए है । - ठंड को रोकने के लिए ५०% ग्लिसरॉल में-20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान ।
3. Multivalent चारा परिसरों की तैयारी
नोट: extracellular प्रोटीन के बीच बातचीत अक्सर कम समानताएं की विशेषता है । के लिए बाध्यकारी शौकीनता, एक multivalent क्वेरी प्रोटीन पर कब्जा करने के आधार पर दृष्टिकोण बढ़ाने के द्वारा इन बातचीत का पता लगाने के सक्षम, एफसी के रूप में व्यक्त-ECD टैग, प्रोटीन पर एक लेपित microbeads4विकसित किया गया था ।
- लेबल वाहक आईजीजी Cy5 monoreactive डाई के साथ का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया और अलग से मुक्त रंग स्तंभों का उपयोग कर डाई । २८० और ६५० एनएम पर पराबैंगनी अवशोषण को मापने के द्वारा प्रोटीन अनुपात करने के लिए डाई का निर्धारण ।
नोट: २.० और ४.० के बीच प्रोटीन-डाई अनुपात आम तौर पर इस्तेमाल किया जाता है । यह 15 मिनट के लिए १००,००० x g पर Cy5 conjugates स्पिन लेबलिंग प्रक्रिया के कारण संभावित घुलनशील समुच्चय को दूर करने के लिए सिफारिश की है । - इष्टतम microbead-to-प्रोटीन अनुपात का निर्धारण प्रोटीन के अनुमापन द्वारा एक निरंतर राशि के खिलाफ क्वेरी प्रोटीन । मोतियों की न्यूनतम संतृप्ति मात्रा जहां कोई मुक्त एफसी-टैग प्रोटीन रहता है, के रूप में एक प्रतिस्पर्धी interferometry द्वारा निर्धारित परख का उपयोग कर मापा, स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है ।
- एफसी-टैग की गई क्वेरी और Cy5-आईजीजी के साथ एक microbeads और पंजाब में 30 मिनट के लिए प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर एक ट्यूब रोटेटर पर मिश्रण के साथ microbead-प्रोटीन परिसरों फार्म ।
- इन परिसरों के रूप में, 20 μg/एमएल के अंतिम एकाग्रता में क्वेरी प्रोटीन का उपयोग करें । क्वेरी प्रोटीन और Cy5-आईजीजी के दाढ़ अनुपात की गणना करने के लिए, आईजीजी के आणविक भार (१५०,००० दा) द्वारा क्वेरी प्रोटीन का आणविक भार विभाजित और μg की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए ४० Cy5/एमएल द्वारा गुणा-आईजीजी की जरूरत है ।
- घुलनशील प्रोटीन एक (1 मिलीग्राम/एमएल के साथ नमूनों के पूरक) तुरंत microarray स्लाइड के साथ मशीन से पहले (४.२ नीचे अनुभाग देखें) किसी भी मुक्त प्रोटीन के बंधन एफसी फ्यूजन प्रोटीन है कि सरणी पर मौजूद हो सकता है के लिए बाध्यकारी रोकने के लिए ।
नोट: अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा संकरण स्टेशन या उपयोग की मशीन चैंबर के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. सामग्री की तालिका में वर्णित उपकरण नमूना गर्मी अपेक्षाकृत छोटे संस्करणों (~ २०० μL प्रति स्लाइड) का उपयोग करने की अनुमति देता है ।
4. Extracellular प्रोटीन Microarray स्क्रीनिंग और प्रोसेसिंग ।
नोट: स्वचालित संसाधन प्लेटफ़ॉर्म प्रदान करने वाले निर्माताओं की संख्या है । यदि कोई संकरण स्टेशन उपलब्ध नहीं है, तो निंन चरणों का पालन मैंयुअल रूप से किया जा सकता है, यह सुनिश्चित करना कि स्लाइडों को हर समय जलमग्न रखने के लिए पर्याप्त मात्रा में बफ़र हो ।
- कमरे के तापमान पर स्लाइड गर्म और पंजाब के साथ कुल्ला/0.1% के बीच 20 (PBST) संकरण स्टेशन पर लोड करने से पहले अवशिष्ट ग्लिसरॉल को दूर करने के लिए ।
- निंन जांच प्रोटोकॉल का उपयोग करें:
- 1 मिनट के लिए PBST से धो लें ।
- लोड २०० 1 मिलीग्राम/μL में एक प्रोटीन//5% दूध और 30 मिनट के लिए एक जटिल प्रोटीन एफसी-टैग प्रोटीन है कि microarray में मौजूद हो सकता है के लिए बाध्यकारी से एक microbeads को रोकने के लिए मशीन ।
- 1 मिनट के लिए PBST के साथ पांच बार धो लें ।
- लोड २०० क्वेरी के μL: 1 मिलीग्राम की उपस्थिति में microbeads परिसर/एमएल प्रोटीन एक और 30 मिनट के लिए मशीन ।
- 1 मिनट के लिए PBST से धो लें ।
- संकरण के बाद, पानी के साथ स्लाइड कुल्ला, व्यक्तिगत ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में जगह है, और 5 मिनट के लिए ९०० x g पर कताई द्वारा सूखी ।
- अंत में, Cy3 का पता लगाने के लिए उपयुक्त एक microarray स्कैनर के साथ स्लाइड स्कैन (यदि BSA-Cy3 मुद्रित किया गया है) और Cy5 ५३२ और ६३५ एनएम, क्रमशः पर रोमांचक द्वारा प्रतिदीप्ति ।
- साथ microarray डेटा विश्लेषण का उपयोग करते हुए डेटा विश्लेषण करें । संबंधित सरणी सूची (एक. gal फ़ाइल के रूप में) डेटा निष्कर्षण सॉफ़्टवेयर में लोड है । इस स्तर पर, Cy3-BSA स्थलों का उपयोग करने के लिए ब्लॉक खोजने के लिए और सॉफ्टवेयर में ऑटो फिटिंग विकल्प का उपयोग करें, जब आवश्यक सुविधाओं के मैनुअल संरेखण द्वारा पीछा किया । आगे के विश्लेषण के लिए फ़ाइलें. gpr फ़ाइलों के रूप में सहेजें ।
5. डेटा विश्लेषण
- GPR फ़ाइलें और limma पैकेज का उपयोग कर R में प्रक्रिया, सामांयतः microarray डेटा4,5के विश्लेषण के लिए उपयोग के रूप में डेटा सहेजें ।
- प्रक्रिया के लिए, पृष्ठभूमि सुधार और भीतर-स्लाइड सामांयीकरण करते हैं । प्रत्येक प्रोटीन के बाद से डुप्लिकेट स्पॉट में छपा है, दोनों को दोहराने माप पुस्तकालय में है कि प्रोटीन के लिए एक एकल स्कोर बनाने के लिए गठबंधन ।
- प्रत्येक स्लाइड के लिए स्कोर परिकलित करें और स्लाइड्स के बीच उच्च स्कोरिंग वाले उंमीदवारों के प्रतिच्छेदन के लिए परिणामों का विश्लेषण करे ।
- स्लाइड परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रण करने के लिए पृथक मुद्रण-रन से डुप्लिकेट microarrays का उपयोग करें और अंतिम हिट कॉल करने के लिए दोनों स्क्रीन से डेटा का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रतिच्छेदन भूखंड का उपयोग करें ।
- अंत में, सरणी के भीतर संकीर्ण प्रोटीन को बाहर करने के लिए फ़िल्टरिंग के एक अतिरिक्त स्तर प्रदर्शन करते हैं । इस तरह के गैर विशिष्ट binders स्वतंत्र स्क्रीन भर में उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित के रूप में एक विशिष्ट सीमा हिट आवृत्ति से अधिक प्रोटीन के रूप में पहचाने जाते हैं ।
नोट: इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित है टॉम एट अल. २०१३5। हमारे मामले में गैर-विशिष्ट बांधने की मशीन कॉल संचई शिकार हिट दर के निर्धारण पर आधारित है, और 5% की एक डेटा-चालित उंमूलन थ्रेशोल्ड का उपयोग किया जाता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
extracellular प्रोटीन microarray प्रौद्योगिकी के लिए कार्यप्रवाह का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है । एक बार extracellular प्रोटीन पुस्तकालय युक्त microarray स्लाइड उपलब्ध हैं, ब्याज और डेटा विश्लेषण के प्रोटीन की स्क्रीनिंग एक दिन के भीतर पूरा किया जा सकता है । झिल्ली एंबेडेड रिसेप्टर्स के बीच कई शारीरिक प्रासंगिक बातचीत बहुत कमजोर बाध्यकारी ताकत (micromolar रेंज में कश्मीरडी ) की विशेषता है । इस तरह की बातचीत का पता लगाने में सुधार करने के लिए, एक क्वेरी प्रोटीन पर आधारित विधि (एफसी फ्यूजन के रूप में व्यक्त) प्रोटीन a-microbeads पर multimerization विकसित किया गया था । इस प्रोटोकॉल पाठ में वर्णित है, और पीपीआई की वृद्धि का पता लगाने के लिए इस दृष्टिकोण के प्रदर्शन का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 2में दिखाया गया है ।
एक प्रोटीन microarray स्क्रीन का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 3में प्रस्तुत किया है । दिखाया उदाहरण में, एक अनाथ मानव एडीनोवायरस इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रोटीन से अधिक १,५०० रिसेप्टर ECD या स्रावित प्रोटीन14से मिलकर एक पुस्तकालय के खिलाफ बातचीत के लिए जांच की है. के रूप में वर्णित है, वायरल प्रोटीन के ECD एक एफसी फ्यूजन प्रोटीन के रूप में व्यक्त recombinantly है, और फिर प्रोटीन एक लेपित microbeads के साथ मशीन के लिए multivalent परिसरों के रूप में । प्रोटीन परिसरों मैनुअल आपरेशनों को कम करने के लिए एक संकरण स्टेशन का उपयोग कर जांच की गई, तथापि, समान स्क्रीन एक संकरण कक्ष या इसी तरह के उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है । यह प्रिंट चलाने के दौरान किसी भी परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करने के क्रम में अलग खोलना रन में छपी स्लाइड का उपयोग कर डुप्लिकेट स्क्रीन चलाने के लिए सलाह दी जाती है । आंकड़ा डुप्लिकेट, स्वतंत्र स्क्रीन से परिणामी चौराहे भूखंडों से पता चलता है । सकारात्मक बातचीत और समग्र स्लाइड पृष्ठभूमि आसानी से प्लेटों की स्कैनिंग पर कल्पना कर रहे हैं (Cy5 प्रतिदीप्ति), हिट कॉलिंग की सुविधा. ध्यान दें कि यह करने के लिए डुप्लिकेट में पुस्तकालय में प्रत्येक रिसेप्टर हाजिर ताकि हिट आत्मविश्वास बढ़ाने के लिए सिफारिश की है । सबसे क्वेरी प्रोटीन के लिए, कोई नहीं, एक, या कुछ हिट, PPIs का पता लगाने के लिए विधि की विशिष्टता का प्रदर्शन मनाया जाता है ।
कुछ क्वेरी प्रोटीन उच्च पृष्ठभूमि के रूप में सरणी और/या स्लाइड के भीतर प्रोटीन की एक असामांय रूप से उच्च संख्या के लिए बाध्यकारी द्वारा पता चलता है । हमारे अनुभव में, इस तरह के गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि प्रोटीन की केवल एक छोटी संख्या के लिए मनाया जाता है । प्रोटीन की प्रकृति से संबंधित विभिंन कारकों glycosylation रूपांकनों की मांयता के रूप में गैर विशिष्ट बातचीत, को प्रभावित कर सकता है । चित्रा 3 एक वायरल microarray पुस्तकालय है कि उच्च पृष्ठभूमि दिखाया, विशिष्ट हिट की precluding पहचान के खिलाफ दिखलाई प्रोटीन का एक उदाहरण से पता चलता है । जबकि प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों के लिए पृष्ठभूमि कम माना जा सकता है (जैसे नमक या डिटर्जेंट एकाग्रता में वृद्धि के रूप में), इन उदाहरणों में यह अध्ययन के तहत प्रोटीन के deorphanization के लिए वैकल्पिक तरीकों का पता लगाने की सिफारिश की है ।
चित्रा 1: रिसेप्टर-ligand बातचीत के तेजी से और मजबूत पहचान के लिए Extracellular प्रोटीन microarrays. (चरण 1) ब्याज की extracellular प्रोटीन की एक पुस्तकालय संकलित है । (चरण 2) शुद्ध प्रोटीन एक microarray प्रिंटर का उपयोग कर epoxysilane स्लाइड पर मुद्रित और-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित कर रहे हैं । (चरण 3) ब्याज की क्वेरी प्रोटीन वृद्धि की शौकीनता और क्षणिक प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए microbeads पर multimerized है । एक फ्लोरोसेंट आईजीजी क्वेरी के साथ जटिल है: microbeads के रूप में निष्क्रिय लेबल वाहक । (चरण 4) एक क्वेरी प्रोटीन के बंधन भागीदारों के लिए स्क्रीनिंग । फ्लोरोसेंट क्वेरी प्रोटीन परिसर स्वचालित स्लाइड प्रोसेसिंग के लिए एक संकरण स्टेशन का उपयोग कर extracellular प्रोटीन microarray के खिलाफ जांच की है । (चरण 5) स्लाइड तो एक microarray स्कैनर का उपयोग कर visualized हैं । BSA-Cy3 स्पॉट ५३५ एनएम चैनल में मनाया जा सकता है और स्क्रीन से प्राप्त हिट ६३५ एनएम पर डुप्लिकेट स्पॉट के रूप में मनाया जा सकता है । हिट कॉलिंग के लिए डेटा विश्लेषण दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिच्छेदन भूखंड बनाकर किया जाता है. हिट्स को पृष्ठभूमि के ऊपर पारस्परिक रूप से उच्च स्कोर के आधार पर कहा जाता है, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: क्वेरी प्रोटीन के लिए multivalent परिसरों के गठन के माध्यम से बढ़ाया संकेत । (क) वेरी प्रोटीन्स का Multimerization. क्वेरी प्रोटीन रिकॉमबिनेंट एफसी फ्यूजन के रूप में व्यक्त कर रहे है और प्रोटीन एक microbeads multimerized परिसरों के रूप में युग्मित । (ख) उच्च शौकीनता कम संबंध बातचीत का पता लगाने की ओर जाता है । इस शौकीन चावला प्रोटीन microarray पर कमजोर बातचीत के स्थिरीकरण में multimerized क्वेरी प्रोटीन परिणाम द्वारा afforded, शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकेत करने के लिए अग्रणी और बढ़ाया हिट कॉलिंग । भूखंडों CD200 के लिए स्क्रीनिंग परिणाम दिखाता है, एक microbead परिसर के रूप में दिखलाई, या एक घुलनशील प्रोटीन सीधे Cy5 डाई के साथ लेबल को हिट का दृश्य सक्षम करें । Multimerization (लाल सलाखों) कम संबंध बाध्यकारी साथी CD200R1, प्रोटीन microarray पुस्तकालय में वर्तमान के मजबूत का पता लगाने की अनुमति देता है, एक ही प्रोटीन के साथ तुलना में महत्वपूर्ण संकेत/शोर अनुपात के साथ एक घुलनशील उत्पाद (नीली सलाखों) के रूप में दिखलाई । धूसर पट्टियां गैर-विशिष्ट बाइंड करने वाले संकेत देती हैं । केवल शीर्ष 10 बातचीत साजिश में प्रतिनिधित्व किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: उपंयास रिसेप्टर रिसेप्टर वायरस की पहचान के लिए प्रोटीन microarray प्रौद्योगिकी-मेजबान बातचीत । (क) एक अनाथ adenoviral इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रोटीन के लिए अनुकरणीय रिसेप्टर डिस्कवरी परिणाम । छवियां वास्तविक microarray स्कैन दर्शाती हैं, जो डुप्लिकेट (लाल) में देखे गए प्रोटीन से हिट दिखाती हैं । परख डुप्लिकेट में प्रदर्शन के लिए किसी भी स्लाइड परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित कर रहे हैं, और परिणाम चौराहे भूखंड के रूप में प्रतिनिधित्व किया । भूखंडों में, लाल और नीले डॉट्स केवल एक सरणी दोहराने पर बुलाया हिट का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि काले डॉट्स दोनों स्वतंत्र रन से पारस्परिक हिट का प्रतिनिधित्व करते हैं । संपूर्ण microarray पुस्तकालय संग्रह में मौजूद प्रोटीन की संख्या को देखते हुए उपयोग में आसानी के लिए दो स्लाइड पर मुद्रित किया जाता है, और सरणी पर देखा प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन के लिए पर्याप्त जुदाई सुनिश्चित करने के लिए । (ख) वायरल प्रोटीन स्क्रीन का प्रदर्शन उच्च पृष्ठभूमि है कि precludes फोन मारा । कुछ क्वेरी प्रोटीन उच्च पृष्ठभूमि प्रदर्शित कर सकते हैं, के रूप में कई प्रोटीन और/या स्लाइड के लिए बाध्यकारी द्वारा पता चला, इसलिए उच्च स्कोरिंग हिट की पहचान के लिए चुनौतियां प्रस्तुत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
अनाथ रिसेप्टर्स की एक महत्वपूर्ण संख्या मानव जीनोम में रहते हैं, और उपंयास बातचीत भागीदारों के लिए पहले से लाइगैंडों विशेषता के साथ extracellular प्रोटीन के लिए उभरने के लिए जारी है । मानव और मॉडल जीवों में रिसेप्टर ligand बातचीत को परिभाषित करने के लिए तंत्र है कि homeostasis के दौरान सेलुलर संचार हुक्म, साथ ही dysregulation रोग के लिए अग्रणी समझने के लिए आवश्यक है, और इसलिए नए या बेहतर सूचित चिकित्सीय विकल्प । फिर भी, व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रौद्योगिकियों द्वारा extracellular प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के मुख्य रूप से तकनीकी सेलुलर रिसेप्टर्स और उनके बातचीत भागीदारों के जैव रसायन से संबंधित चुनौतियों के कारण एक महत्वपूर्ण बाधा का प्रतिनिधित्व किया है । इस रिपोर्ट में हम PPIs का पता लगाने के लिए microbead परिसरों के उपयोग पर जोर देने के साथ, ब्याज की क्वेरी प्रोटीन की स्क्रीनिंग के लिए एक extracellular प्रोटीन microarray के उपयोग का वर्णन ।
जांच रिसेप्टर रिसेप्टर बातचीत विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है, के रूप में कई शारीरिक रूप से प्रासंगिक जोड़े micromolar रेंज2,3में बाध्यकारी समानताएं के साथ बहुत कमजोर बातचीत की विशेषता है । multimerization के माध्यम से avid वृद्धि कम अपनत्व PPIs का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए एक उपयोगी रणनीति साबित हो गया है. हम एक एफसी फ्यूजन प्रोटीन के आधार पर विधि विकसित की है, multivalent microbead के कुशल गठन के लिए-प्रोटीन क्वेरी परिसरों4। वेरी प्रोटीन का Multimerization कम अपनत्व PPIs का पता लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । के रूप में चित्र 2में उदाहरण में दिखाया गया है, इस विधि काफी एक ही प्रश्न प्रोटीन के साथ तुलना में संकेत को बढ़ाता है एक घुलनशील (गैर जटिल) analyte के रूप में दिखलाई, जबकि ंयूनतम पृष्ठभूमि को बनाए रखने । वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन microarray स्क्रीन घुलनशील Cy5 के साथ किया जा सकता है-क्वेरी प्रोटीन लेबल, एक दृष्टिकोण है कि किसी भी संलयन टैग के साथ संगत है और वह अधिक स्थिर की पहचान के लिए पर्याप्त हो सकता है, उच्च संबंध बातचीत, के रूप में उन लोगों के बीच कुछ घुलनशील लाइगैंडों और उनकी रिसेप्टर्स. यह ध्यान देने योग्य है कि क्योंकि microbeads पर क्वेरी के multimerization के माध्यम से शौकीनता बढ़ जाती है, microarray संकेत संपर्क शक्ति का एक मात्रात्मक उपाय नहीं है । बल्कि, बाध्यकारी समानताएं मूल्यांकन के तहत प्रोटीन के monomeric संस्करणों के साथ गणना की जानी चाहिए । इसके अलावा, यह बेहद उचित है कि किसी भी microarray प्रौद्योगिकी के माध्यम से पहचान की हिट स्वतंत्र तरीकों के माध्यम से मांय हैं । हम नियमित रूप से पीपीआई अध्ययन और बाध्यकारी कैनेटीक्स की माप के लिए एक सोने के मानक के रूप में plasmon अनुनाद सतह का उपयोग करें ।
हालांकि इस रिपोर्ट के दायरे से बाहर है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि किसी भी स्क्रीनिंग microarray प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के प्रयासों की सफलता भारी चयन और एक उच्च गुणवत्ता प्रोटीन पुस्तकालय की उपलब्धता पर निर्भर करता है । extracellular प्रोटीन के चयन के लिए प्रासंगिक मानदंड पहले4,22प्रकाशित किया गया है । प्रासंगिक प्रोटीन सुविधाओं की भविष्यवाणी के लिए उपयोगी उपकरणों की एक संख्या (जैसे transmembrane helices या संकेत पेप्टाइड्स) के रूप में नि: शुल्क ऑनलाइन उपलब्ध हैं, निम्नलिखित सर्वर सहित, SignalP15, TMHMM16, Phobious17, और TOPCONS 18. उत्कृष्ट तरीकों संबध शुद्धि तरीकों का वर्णन कागजात कहीं उपलब्ध हैं । यह भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि microarray प्रोटीन पुस्तकालय पीढ़ी घुलनशील रिकॉमबिनेंट उत्पादों के रूप में प्रोटीन ECDs के उत्पादन पर निर्भर करता है, और इसलिए इस दृष्टिकोण प्रकार मैं, प्रकार द्वितीय और जीपीआई-लंगर सेल सतह रिसेप्टर्स और स्रावित के अध्ययन की अनुमति देता है प्रोटीन, लेकिन आम तौर पर multitransmembrane से युक्त प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं है जैसे जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स । रिकॉमबिनेंट घुलनशील प्रोटीन के रूप में प्रोटीन के सैकड़ों की शुद्धि महत्वपूर्ण रसद प्रयासों की मांग और बहुत संसाधन और समय लेने वाली हो सकता है । फिर भी, जीन संश्लेषण की घटी हुई लागत और प्रोटीन शोधन प्रणालियों की वृद्धि का प्रवाह के साथ, पुस्तकालय पीढ़ी अब अपेक्षाकृत तेजी से और अधिक किफायती है । वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक सूत्रों की पेशकश शुद्ध extracellular प्रोटीन कि माइक्रोग्राम मात्रा में खरीदा जा सकता है, जो एक टिकाऊ प्रोटीन microarray स्लाइड छपाई के लिए छोटी आवश्यकताओं को देखते हुए पुस्तकालय की पीढ़ी के लिए पर्याप्त । इन सीमाओं के बावजूद, microarray प्रौद्योगिकी ऐसे प्रोटीन रिएजेंट की ंयूनतम खपत के रूप में महान लाभ प्रदान करता है, तेजी से readouts (नई PPIs एक दिन के भीतर की पहचान की जा सकती है) और सस्ती उपकरण । इसके अलावा, एक बार के निर्माण और शोधन की स्थिति स्थापित किया गया है, छोटे पैमाने पर शुद्धीकरण के लिए पर्याप्त सामग्री का उत्पादन कर सकते है arrays के हजारों तैयार ।
अंत में, कुछ उदाहरणों में, अपेक्षाकृत उच्च पृष्ठभूमि microarray पुस्तकालय पर कई प्रोटीन के लिए बाध्यकारी के रूप में प्रदर्शित होने, मनाया जाता है । गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को प्रभावित कर सकते है जो कई कारक हैं । उदाहरण के लिए, कुछ प्रोटीन अत्यधिक शुल्क लिया जा सकता है, या कार्बोहाइड्रेट के साथ बातचीत, सामांय रूपांकनों की मांयता के माध्यम गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि के लिए लेखांकन । इसी तरह, गैर विशिष्ट बाध्यकारी भी क्वेरी प्रोटीन की प्रकृति के कारण हो सकता है, जैसे sialic एसिड रूपांकनों की मांयता उदाहरण के लिए, कई अंय प्रोटीन में पाया । microarray लायब्रेरीज़ का विस्तार करें, के रूप में यह है कि गैर-विशिष्ट binders की एक सामांय सूची मौजूद हो सकता है कि अधिक संभावना है । इस तरह के गैर विशिष्ट binders असंबंधित क्वेरी प्रोटीन के खिलाफ विभिंन स्क्रीन भर में उनके व्यवहार पर नज़र रखने से पहचाना जा सकता है । यह विशिष्ट हिट कॉलिंग में सुधार करने के लिए, स्क्रीन भर में गैर-विशिष्ट binders की एक सूची उत्पन्न करने के लिए सलाह दी जाती है । हमारे मामले में, हमने पाया है कि एक 5% cutoff आवेदन (यानी, एक प्रोटीन गैर के रूप में ध्वजांकित है अगर बांधने की मशीन के रूप में पाया जाता है 5% या असंबंधित क्वेरी प्रोटीन स्क्रीन के अधिक है) के लिए झूठी सकारात्मक कम महत्वपूर्ण है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यदि परख का मुख्य उद्देश्य केवल कुछ चुनिंदा स्क्रीन चलाने के लिए है, यह एक सांख्यिकीय विश्लेषण विकसित करने के लिए सार्थक नहीं हो सकता है । इस मामले में, यह एक सीमित डेटासेट के कारण झूठी सकारात्मक का पता लगाने के लिए व्यवहार्य नहीं हो सकता है, और इसलिए हम अनुशंसा करते हैं कि विशेष बल वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर हिट की पुष्टि पर रखा गया है.
हम extracellular प्रोटीन microarrays, विशेष रूप से क्षणिक रिसेप्टर-ligand बातचीत का पता लगाने के लिए multimerization तरीकों के साथ संयोजन में आशा है, में उपंयास पीपीआई की तेजी से और मजबूत पहचान के लिए एक अनूठा मंच की पेशकश करने के लिए जारी रहेगा extracellular अंतरिक्ष ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.H., एस. आर-आर और एन. एम-एम. Genentech कर्मचारियों और Genentech इंक/Roche समूह में खुद के शेयर कर रहे हैं ।
Acknowledgments
हम गंभीर पांडुलिपि पढ़ने के लिए Philamer cals और कोबे यूएन धंयवाद । हम उत्कृष्ट तकनीकी सलाह के लिए रेंडी येन के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
