Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.
Abstract
Sezernierten Faktoren, Membran-angebunden-Rezeptoren und ihren Interaktionspartnern sind wichtigsten Regulatoren des Mobilfunkes und Einleitung der Signalisierung Kaskaden während der Homöostase und Krankheit, und als solche therapeutischen Ziele dar. Trotz ihrer Relevanz bleiben diese Interaktion Netze deutlich unterrepräsentiert in aktuellen Datenbanken; Daher müssen die extrazellulären Proteine keine dokumentierten Bindungspartner. Diese Diskrepanz ist vor allem auf die Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Studium der extrazellulären Proteine, einschließlich Ausdruck Funktionsproteine und der schwachen, niedrige Affinität, Protein-Interaktionen, die oft zwischen Zellrezeptoren Oberfläche hergestellt. Diese Methode dient zum Drucken einer Bibliothek von extrazellulären Proteinen in einem Microarray-Format für das Screening von Protein-Protein-Wechselwirkungen beschreiben. Zur Erkennung der schwachen Wechselwirkungen zu ermöglichen, wird eine Methode basiert auf Multimerization des Proteins Abfrage unter Studie beschrieben. Dabei Microbead-basierte Multimerization für erhöhte Multivalenz gekoppelt, ermöglicht die Protein-Microarray robuste Erkennung von transienten Protein-Protein-Interaktionen in hohem Durchsatz. Diese Methode bietet einen schnellen und niedrigen Probe verbraucht-Ansatz zur Identifizierung von jedem extrazelluläre Protein für neue Interaktionen. Protein-Microarray-Druck und screening-Protokoll werden beschrieben. Diese Technologie wird für die Ermittler suchen eine robuste Methode zur Entdeckung von Protein-Interaktionen in den Extrazellulärraum nützlich sein.
Introduction
Die Methode überprüft hier beschreibt das Drucken aus einer Sammlung von extrazellulären Proteine in einem Microarray-Format, gefolgt von einer Methode für das Screening eines Ziels des Interesses gegen diese Bibliothek. Wir haben als ein entscheidender Schritt für die Erkennung von Interaktionen gekennzeichnet durch niedrige verbindliche Affinitäten Protein Multimerization identifiziert. Zur Erkennung dieser Interaktionen zu verbessern, beschreiben wir ein Protokoll basiert auf Multimerization der Abfrage-Proteins des Interesses mit Microbeads.
Sezerniert und Oberfläche ausgedrückt Zellproteinen (kollektiv extrazellulären Proteine genannt) zusammen mit ihren Interaktionspartnern sind wichtige Regulatoren des Mobilfunkes, Signalisierung und Interaktion mit der Mikroumgebung. Sie sind daher unerlässlich bei der Regulierung der vielen physiologischer und pathologischer Prozessen. Etwa ein Viertel des menschlichen Genoms (≈5, 000 Proteine) für extrazelluläre Proteine kodiert, die aufgrund ihrer Bedeutung und Zugänglichkeit systematisch gelieferten Medikamente, wesentliche Ziele für Droge-Entwicklung-1vertreten. Folglich stellen extrazellulären Proteine mehr als 70 % der Protein-Targets mit bekannten pharmakologischen Wirkung für zugelassene Medikamente auf dem Markt, bekannt als das "druggable Proteom". Trotz ihrer Bedeutung und Fülle bleiben die extrazelluläre Protein-Protein Interaktion (ePPI) Netze auffallend unterrepräsentiert in den verfügbaren Datenbanken. Dies ist grundsätzlich aufgrund der komplexen biochemischen Natur der extrazellulären Proteine, die deren Charakterisierung mit den meisten verfügbaren Technologien2ausschließt. Erstens sind Membranproteine schwer zu lösen, einen Prozess, der oft harten waschen Bedingungen und Reinigungsmittel beinhaltet; Zweitens fehlt extrazellulären Proteine häufig relevanten post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung, die fehlen, wenn diese Proteine in allgemein ausgedrückt werden heterologe Systemen verwendet. Schließlich, Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren, wie Co-Rezeptoren auf Immunzellen, ausgedrückt sind oft vorübergehend und zeichnet sich durch sehr niedrige Affinitäten (K-D in ~ 1 μM bis > 100 μM-Bereich). Insgesamt verwendet die Natur dieser Proteine und deren Bindung, die am weitesten verbreitete Partner erbringen Technologien wie Affinität Reinigung/Massenspektrometrie (AP/MS) oder Hefe-zwei-Hybrid, ungeeignet für die Erkennung von Interaktionen in den Extrazellulärraum 2 , 3.
In dem Bemühen, diese technische Herausforderungen zu meistern und beschleunigen die Entdeckung neuartiger Interaktionen für extrazelluläre Proteine entwickelten wir eine hohe Abdeckung extrazelluläre Protein Microarray4,5. Microarrays bieten den Vorteil hoher Dichte Oberflächen mit kleinen Probenmengen zu erzeugen und sind in der Regel für Hochdurchsatz Studien zugänglich. Protein Microarray-basierte Studien haben bereits relevante Einblicke in Protein-Interaktionen für mehrere Modellorganismen vorgesehen, allerdings mit Schwerpunkt vor allem auf cytosolischen Interaktionen oder spezifisches Protein Familien6,7, 8. Im Gegensatz dazu hat begrenzte gearbeitet um extrazelluläre Protein-Interaktionen mit dieser Technologie zu untersuchen. Haben wir eine Protein Microarray Methode zum Studium der ePPIs ermöglichen durch den Aufbau einer umfassenden und vielseitigen Bibliothek der gereinigten sekretierten Proteine und einzelne transmembrane (STM) Rezeptoren ausgedrückt als rekombinante extrazelluläre Domänen (ECD) verschmolzen häufige Tags für Affinität Reinigung4. Der Erfolg der Protein-Microarray-Bildschirme stützt sich auf die Schaffung einer qualitativ hochwertigen Protein-Bibliothek. Für den Ausdruck von der Bibliothek und die Abfrage Protein wurden Säugerzellen oder Insektenzellen bevorzugt als heterologe Expressionssysteme gewählt um richtige Zugabe von post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung oder umgeformt Anleihen sicherzustellen. SDS-PAGE, Größe Ausgrenzung Chromatographie und Laser Multiwinkel Lichtstreuung sind Techniken häufig genutzt, um rekombinante Proteinqualität zu bewerten. Die Protein-Bibliothek ist dann auf Epoxysilane Dias gesichtet und bei-20 ° C für die langfristige Nutzung gespeichert. Proteinkonzentrationen oberhalb von 0,4 mg/mL sind für die nachfolgend beschriebenen Protokoll empfohlen. Daher erfordern niedrig exprimierenden Proteine einen Konzentration Schritt vor der Probe drucken und speichern. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik ist jedoch das geringe Volumen des Proteins erforderlich (50 μg des Proteins ist ausreichend, um ausführen > 2.000 Bildschirme), neben minimalen Abfrage Proteinkonsum (20-25 μg pro Duplikate Bildschirm). Mit dem Protokoll und Ausrüstung hier beschrieben und Bibliotheken zur Verfügung gestellt, können Ergebnisse für Einzelabfrage Proteine erzeugt werden, innerhalb eines Arbeitstages.
Eine große Herausforderung bei der Aufdeckung von Protein-Interaktionen in der extrazellulären Umgebung ergibt sich aus ihrer charakteristisch schwach oder vorübergehender Natur, die Identifizierung durch die am häufigsten verwendeten Methoden ausschließt. Erhöhung der verbindlichen Avidity stark verbessert Empfindlichkeit zur Erkennung von schwachen Protein Interaktionen9,10,11. Basierend auf diesem Prinzip wir entwickelten eine Methode, um Multimerize die Abfrage-Proteine (ausgedrückt als Fc Fusion) mit Protein A-beschichtete Perlen4,5. Um jede mögliche Inaktivierung des Abfrage-Proteins durch zufällige Kennzeichnung zu vermeiden, wir stattdessen eine irrelevante menschliche Immunglobulin G mit Cy5 beschriften und fügen Sie es zusammen mit dem Abfrage-Protein Protein A-Perlen, wodurch Artefakte aufgrund der direkten Konjugation von einem Färben Sie, das Protein des Interesses. Angesichts der mikromolaren Affinitäten von mehreren Paaren Ko-Rezeptor, verbessern die multivalente Anlagen stark Signal-Rausch-Verhältnis, im Vergleich zu Fc-Abfrage Fusionsproteine als lösliche Proteine4gezeigt.
Zusammenfassend lässt sich sagen ist das Ziel dieses Protokolls, die Vorbereitung der Microarray-Folien mit einer vorbestehenden extrazelluläre Protein Bibliothek zur Identifizierung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu beschreiben. Wir überprüfen die Schritte für die Folie drucken, gefolgt von einem Protokoll für das Screening von einem Protein des Interesses gegen die extrazelluläre Protein-Bibliothek. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode für die erweiterte Erkennung von ePPIs basierend auf Microbeads erhöhte Avidität des Proteins unter Studie zu erreichen. Die hier beschriebenen extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie stellt einen schnellen, robusten und effektiven Ansatz für screening und Erkennung von neuartigen ePPI mit niedrige False-Positive-Verhältnisse und durch die einzige Mikrogramm Mengen des Proteins Abfrage unter Verwendung Untersuchung. Diese Technologie hat mehrere Studien angeheizt, die relevante Einblicke in bisher unbekannte Zellfunktionen und Signalwege für eine Vielzahl von Rezeptoren12,13, darunter virale Immunoregulators14zur Verfügung gestellt haben, und kann genutzt werden, um eine extrazelluläre Protein des Interesses de-orphanize.
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Protocol
1. Generation aus einer Bibliothek von extrazellulären menschliche Proteine
- Stellen Sie eine Liste der Zelle Oberfläche Rezeptoren oder sekretierten Proteine des Interesses, die Protein-Microarray-Bibliothek zu bauen. Bestimmte Proteinfamilien (z. B. der Immunglobulin-Superfamilie) oder Proteine selektiv ausgedrückt insbesondere Zelle Arten für die Studie ausgewählt werden können.
- Bestimmen Sie für Oberfläche Zellrezeptoren die Domänengrenzen der extrazellulären (ECD) durch Ermittlung der Signalpeptid und transmembranen Regionen mit Software-Tools. Einige der einschlägigen Werkzeuge, online frei verfügbar, sind in der Tabelle der Materialien15,16,17,18verwiesen.
- ECD für die Gene von Interesse und Klon in den relevanten Vektor zu synthetisieren. Sekretierten Proteine oder die ECD STM-Rezeptoren verschmolzen zu einer Reihe von gemeinsamen Affinität-Tags können von den konditionierten Medien mit den entsprechenden Vektor transfected Zellen oder Baculovirus-Insekt Zelle Expressionssysteme gereinigt werden.
Hinweis: Säugetier-Zelle-basierten Systemen (z. B. HEK/293 oder CHO-Zellen) werden empfohlen, um die Wahrscheinlichkeit der richtigen Proteinfalte und Zugabe von relevanten posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung zu maximieren. - Reinigen Sie die Proteine durch standard Affinität Reinigungsverfahren. Frühere Bemühungen haben geeignet für die Reinigung von Hunderten von Proteinen, automatische oder halbautomatische Verfahren beschrieben, die skaliert werden kann, um die Menge der Proteine des Interesses9,19,20zu generieren, 21.
Hinweis: SDS-PAGE, Größe Ausgrenzung Chromatographie (S) oder Multi-Angle-Laser Licht Streuung (MALLS) sind empfehlenswert, nicht-kovalente Aggregation zu bewerten und für die Gesamtqualität der Protein-Vorbereitungen zu kontrollieren. - Proteine, 200 oder 400 μg/mL wann immer möglich, anpassen und verdünnen Sie Aktien mit 80 % Glycerin für die Langzeitlagerung in kryogenen Fläschchen bei-20 ° C. Diese Meister Aktien und sollte nur bei Bedarf abgerufen werden.
- Aliquote jedes Proteins (100 μl) auf 96-Well-Platten (Lager-Platten) übertragen, versiegeln mit Klebefolie und bei-20 ° C bis zur Microarray Folie Vorbereitung lagern. Lager-Platten werden generiert, um Frost-Tau-Wechseln zu minimieren und Proteinstabilität zu gewährleisten.
(2) extrazelluläre Protein Microarray drucken
- Verwenden Sie ein standard Microarrayer für Folie drucken. Das Instrument für das hier beschriebene Protokoll verwendet hat eine Kapazität von 57 Folien/Lauf und nutzt einen Druckkopf 48 spotting Stifte halten. Diese Pins generieren Spots von ~ 100 μm Durchmesser eine Punkt-zu-Punkt-Abstand von ~ 350 μm und zieht 0,25 μl pro Ladung. Bei dieser Konfiguration können bis zu 8.000 Punkte pro Folie untergebracht werden.
- Generieren Sie Arbeits-Platten (384 well-Platten, 10 μl Probe/Brunnen) von den Lager-Platten. Führen Sie diesen Schritt manuell vor dem Folie drucken mit der Microarrayer. Vor Ort dann Proteine mit Feder-Typ spotting Pins auf Epoxysilane Folien bei 60 % Luftfeuchtigkeit (um Austrocknung der Proteinspots zu verhindern).
Hinweis: Cy3 beschriftet Rinderserumalbumin (BSA) kann in Duplikate zwischen jedes Protein Sample (5 μg/mL in PBS/40% Glycerin) gesichtet werden, um das Array für Maske passend (siehe Abschnitt 4) zu visualisieren. Obwohl empfohlen wird, ist dieser Schritt optional. - Im Anschluss an drucken, entfernen Sie die Protein-Microarray-Folien aus der feuchte Umgebung und blockieren sie über Nacht mit 5 % Milch in PBST, die Oberfläche zu inaktivieren.
Hinweis: Der bevorzugte Ansatz ist mit einem Ultraschall Nebelmaschine erzeugen einen feinen Nebel blockiert Lösung, die auf der Folie Oberfläche ablagern. - Speichern Sie Folien bei-20 ° C in 50 % Glycerin, Einfrieren zu verhindern.
3. Vorbereitung der multivalente Köder-komplexe
Hinweis: Interaktionen zwischen extrazellulären Proteinen zeichnen sich oft durch niedrige Affinitäten. Zur Erkennung dieser Interaktionen zu ermöglichen, durch die Erhöhung der Bindung Avidität, einen multivalente Ansatz basiert auf der Erfassung der Abfrage Proteins, ausgedrückt als Fc-Tags ECD wurde auf Protein A-beschichtete Microbeads entwickelten4.
- Beschriften des Trägers IgG für die Erkennung mit Cy5 Monoreactive Farbstoff eingesetzt und den freien Farbstoff mit Entsalzung Spalten zu trennen. Bestimmen Sie den Farbstoff zu Protein-Verhältnis durch UV Absorption bei 280 bis 650 nm messen.
Hinweis: Protein-Farbstoff Verhältnisse zwischen 2.0 und 4.0 werden normalerweise verwendet. Es empfiehlt sich, drehen Sie die Cy5 Konjugate bei 100.000 x g für 15 min, potenzielle lösliche Aggregate aufgrund der Kennzeichnung zu entfernen. - Bestimmen Sie die optimale Microbead-Protein-Verhältnis durch Titration von Protein A gegen eine konstante Menge des Proteins Abfrage. Minimal ist Sättigung von Perlen, wo keine kostenlosen Fc-markierte Protein bleibt, gemessen mit einem wettbewerbsfähigen Assay durch Biolayer Interferometrie, bestimmt für das Screening verwendet.
- Bilden Sie das Microbead-Protein-komplexe durch Inkubation der Fc-Tags Abfrage und Cy5-IgG mit Protein A Microbeads und Mischung auf ein Rohr-Rotator mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt werden.
- Um diese komplexe bilden, verwenden Sie das Abfrage-Protein eine Endkonzentration von 20 μg/mL. Um das molare Verhältnis von Abfrage-Protein und Cy5-IgG zu berechnen, teilen Sie das Molekulargewicht des Abfrage-Proteins durch das Molekulargewicht der IgG (150.000 Da) und multiplizieren Sie mit 40 μg/mL zur Bestimmung der Konzentration von Cy5-IgG benötigt.
- Ergänzen Sie Proben mit lösliche Protein eine (1 mg/mL) unmittelbar vor der Inkubation mit dem Microarray (siehe Abschnitt 4.2) gleitet nach Bindung von jeder freie Protein A Perlen der Fc Fusionsproteine zu verhindern, die auf das Array vorhanden sein können.
Hinweis: Die endgültige Reaktionsvolumen variieren je nach der Hybridisierung Station oder Inkubation Kammer genutzt. Die Instrumentation in der Tabelle der Materialien beschrieben können Probe Inkubation mit relativ kleinen Mengen (~ 200 μL pro Folie).
(4) extrazelluläre Protein Microarray Screening und Verarbeitung.
Hinweis: Es gibt eine Reihe von Herstellern, die automatische Verarbeitungsplattformen bereitstellen. Wenn eine Hybridisierung-Station nicht verfügbar ist, können die folgenden Schritte manuell durchgeführt werden, sicherstellen, dass Sie ausreichendes Volumen des Puffers, die Folien halten zu allen Zeiten eingetaucht.
- Die Folien bei Raumtemperatur erwärmen und Spülen mit PBS/0.1% Tween 20 (PBST), restliche Glycerin vor der Verladung auf die Hybridisierung Station zu entfernen.
- Verwenden Sie das folgende Screening-Protokoll:
- Für 1 min mit PBST waschen.
- Laden Sie 200 μL von 1 mg/mL Protein A in PBS/5% Milch und inkubieren Sie für 30 min, Uncomplexed Protein zu verhindern ein Microbeads aus der Bindung an Fc-markierten Proteine, die möglicherweise in der Microarray vorhanden.
- Waschen Sie fünf Mal für 1 min mit PBST.
- Laden Sie 200 μL der Abfrage: Microbeads Komplex in Anwesenheit von 1 mg/mL Protein A und 30 min inkubieren.
- Für 1 min mit PBST waschen.
- Legen Sie nach Hybridisierung in 50 mL konische Einzelrohre Folien mit Wasser spülen und Trocknen von Spinnen bei 900 X g für 5 min.
- Schließlich Scannen der Dias mit einem Microarray Scanner angebracht, Cy3 erkennen (Wenn BSA-Cy3 gedruckt wurde) und Cy5 Fluoreszenz durch spannende bei 532 und 635 nm bzw..
- Datenanalyse mit den begleitenden Microarray-Datenanalyse. Die entsprechenden Array-Liste (als .gal Datei) wird in den Daten-Extraktion-Software geladen. Nutzen Sie in dieser Phase die Cy3-BSA-Spots um Blöcke zu finden und verwenden Sie die Auto-Montage-Optionen in der Software, gefolgt von manuelle Ausrichtung der Funktionen bei Bedarf. Speichern Sie die Dateien als .gpr-Dateien für die weitere Analyse.
(5) Datenanalyse
- Speichern Sie Daten als GPR-Dateien und einen Prozess mit dem Limma-Paket, allgemein verwendet für die Analyse von Microarray Daten4,5R.
- Für die Vorverarbeitung, Hintergrund-Korrektur und in Folie Normalisierung. Da jedes Protein in doppelte Punkte gedruckt wird, kombinieren Sie beide wiederholte Messungen, um eine einzelne Partitur für das Protein in der Bibliothek zu erstellen.
- Berechnen Sie Noten für jede Folie zu und analysieren Sie die Ergebnisse für die Kreuzung von High-scoring Kandidaten zwischen den Folien.
- Verwenden Sie doppelte Microarrays aus separaten Auflagen zu steuern für Folie Variabilität und Kreuzung Grundstücke Darstellung von Daten aus beiden Bildschirmen letzten Hits zu nennen.
- Schließlich führen Sie ein zusätzliches Maß an Filtern um promiscuous Proteine innerhalb des Arrays auszuschließen. Solche unspezifischen Bindemittel werden identifiziert, wie Proteine, die einen bestimmten Schwellenwert überschreiten Häufigkeit getroffen, als unabhängige Monitoren vom Benutzer definiert.
Hinweis: Dieses Protokoll ist in Tom Et Al. 20135ausführlich beschrieben. In unserem Fall das unspezifische Bindemittel Aufruf basiert auf der Bestimmung von der kumulativen Beute Trefferquote und eine datenbasierte Beseitigung Schwelle von 5 % verwendet.
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Representative Results
Eine schematische Darstellung des Workflows für die extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie ist in Abbildung 1dargestellt. Sobald die Microarray-Folien mit der extrazelluläre Protein-Bibliothek zur Verfügung stehen, kann das Screening des Proteins des Interesses und Datenanalyse innerhalb eines Tages abgeschlossen werden. Viele physiologisch relevante Wechselwirkungen zwischen Membran eingebettet Rezeptoren zeichnen sich durch sehr schwache Bindung stärken (KD im Bereich von mikromolaren). Um die Erkennung solcher Wechselwirkungen zu verbessern, wurde eine Methode basierend auf Abfrage Protein (ausgedrückt als Fc Fusion) Multimerization auf Protein A-Microbeads entwickelt. Dieses Protokoll wird im Text beschrieben, und ein repräsentatives Beispiel für die Leistung dieses Ansatzes für die erweiterte Erkennung von PPI ist in Abbildung 2dargestellt.
Ein repräsentatives Beispiel für einen Protein-Microarray-Bildschirm ist in Abbildung 3dargestellt. Im gezeigten Beispiel eine verwaistes menschlichen Adenovirus immunmodulatorische Protein ist geschirmt für Interaktionen gegen eine Bibliothek, bestehend aus mehr als 1.500 Rezeptor ECD oder sezerniert Proteine14. Wie beschrieben, ist die ECD das virale Protein rekombinant ausgedrückt als ein Fc-Fusionsprotein, und dann mit Protein A-beschichtete Microbeads inkubiert, um multivalente komplexe bilden. Die Proteinkomplexe liefen mit einer Hybridisierung Station, um manuelle Eingriffe zu minimieren, jedoch können ähnliche Bildschirme durchgeführt werden, mit einer Hybridisierung Kammer oder ähnliche Geräte. Es ist ratsam, doppelte Bildschirme mit Folien gedruckt in separaten spotting läuft um Steuerung für jede Variabilität während der Auflage zu laufen. Die Abbildung zeigt die resultierende Kreuzung Grundstücke von doppelten, unabhängigen Bildschirmen. Positive Interaktionen und insgesamt Folienhintergrund sind leicht beim Scannen der Platten (Cy5 Fluoreszenz), Erleichterung der hit Berufung visualisiert. Beachten Sie, dass es empfohlen wird, jeder Rezeptor in der Bibliothek in Duplikate um hit Vertrauen stärken vor Ort. Für die meisten Abfrage Proteine, keine, werden eine oder wenige Treffer eingehalten, demonstriert die Spezifität der Methode zur Erkennung von PPI.
Bestimmte Abfrage Proteine zeigen hohe Hintergrund erkannt durch die Bindung an eine ungewöhnlich hohe Anzahl von Proteinen innerhalb des Arrays und/oder auf die Folie. Nach unserer Erfahrung wird solche unspezifischen Hintergrund für nur eine kleine Anzahl von Proteinen beobachtet. Verschiedene Faktoren in Bezug auf die Art des Proteins könnten unspezifische Wechselwirkungen, wie z. B. Anerkennung der Glykosylierung Motive beeinflussen. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für ein virales Protein, abgeschirmt gegen die Microarray-Bibliothek, die hohen Hintergrund zeigte Identifizierung von spezifischen Treffern auszuschließen. Während kleinere Änderungen im Protokoll angesehen werden können, um Hintergrund (z. B. erhöhte Salz- oder Waschmittel Konzentration), in diesen Fällen zu verringern, empfiehlt es sich, alternative Methoden zur Deorphanization des Proteins unter Studie zu erkunden.
Abbildung 1: extrazelluläre Protein Microarrays für schnelle und robuste Identifizierung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen. (Schritt 1) Eine Bibliothek von extrazellulären Proteine des Interesses wird kompiliert. (Schritt 2) Der gereinigten Proteine sind auf Epoxysilane Dias mit einem Microarray-Drucker gedruckt und bei-20 ° c gelagert (Schritt 3) Die Abfrage-Protein des Interesses ist Multimerized auf Microbeads für erhöhte Avidität und Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen. Eine fluoreszierende IgG ist als inerte beschrifteten Träger komplexiert mit der Abfrage: Microbeads. (Schritt 4) Screening für Bindungspartner eines Abfrage-Proteins. Die fluoreszierende Abfrage-Protein-Komplex wird gegen die extrazelluläre Protein-Microarray mit einer Hybridisierung-Station für die automatisierte Folie Verarbeitung gesiebt. (Schritt 5) Folien sind mit einem Microarray Scanner dann visualisiert. Die BSA-Cy3 Flecken beobachtet werden, im Kanal 535 nm und die Treffer ergab vom Bildschirm beobachtet werden, als doppelte Punkte bei 635 nm. Datenanalyse für hit Berufung erfolgt durch Kreuzung Grundstücke von zwei unabhängigen Experimenten zu schaffen. Treffer werden basierend auf gegenseitig Highscores über Hintergrund, genannt, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: verstärkte Signal durch Bildung von multivalente Anlagen für die Abfrage-Protein. (A) Multimerization Abfrage Proteine. Abfrage-Proteine sind ausgedrückt als rekombinante Fc Fusionen und gekoppelt an Protein A Microbeads zur Form Multimerized komplexe. (B) hohe Avidität führt zur Erkennung von geringe Affinität Interaktionen. Die Avidität gewährten die Multimerized Protein Abfrageergebnisse in der Stabilisierung der schwachen Wechselwirkungen auf die Protein-Microarray, führt zu höheren Signal-Rausch-Verhältnis und verbesserte hit Berufung. Grundstücke zeigt Screeningergebnisse für CD200, gezeigt als eine komplexe, Microbead oder ein lösliches Protein direkt beschriftet mit Cy5 Farbstoff Visualisierung der Hits zu ermöglichen. Multimerization (roter Balken) ermöglicht robuste Erkennung von geringe Affinität Bindungspartner CD200R1, vorhanden in der Protein-Microarray-Bibliothek mit bedeutenden Signal-/Rauschverhältnis gegenüber das gleiche Protein als ein lösliches Produkt (blaue Balken) gezeigt. Grauen Balken zeigen unspezifische Bindemittel. Nur die Top 10 Interaktionen sind in der Handlung vertreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Protein-Microarray Technologie zur Identifizierung von neuartigen Rezeptor-Rezeptor Virus-Wirt Interaktionen. (A) vorbildlich Rezeptor Ermittlungsergebnisse für ein verwaistes adenoviralen immunmodulatorische Protein. Bilder stellen tatsächliche Microarray-Scans, zeige Treffer von Proteinen in Duplikate (rot) gesichtet. Assays werden Duplikate zu steuern für jede Folie Variabilität und Ergebnisse dargestellt als Schnittpunkt Grundstücke durchgeführt. In den Parzellen repräsentieren die roten und blauen Punkte Treffer nur fordert ein Array replizieren, während schwarze Punkte sich überschneidenden Hits aus beiden unabhängigen Testläufen darstellen. Die gesamte Microarray-Bibliothek ist auf zwei Folien für Benutzerfreundlichkeit angesichts der Zahl von Proteinen in der Auflistung und um genügend Trennung für jedes einzelne Protein entdeckt auf dem Array gedruckt. (B) Viral Protein Bildschirm ausstellen hohen Hintergrund, der ausschließt getroffen Berufung. Bestimmte Proteine Abfrage möglicherweise hohen Hintergrund wie erkannt durch die Bindung an mehreren Proteinen und/oder die Folien daher vor Herausforderungen für die Identifizierung von hohe scoring Treffern angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Eine beträchtliche Anzahl von Orphan Rezeptoren bleiben im menschlichen Genom und neuartige interagierenden Partner weiterhin für die extrazellulären Proteine mit bisher charakterisierten Liganden entstehen. Festlegung der Rezeptor-Ligand-Interaktionen in der Human- und Modellorganismen ist wichtig zum Verständnis der Mechanismen, die zelluläre Kommunikation während der Homöostase sowie Dysregulation führt zu Krankheit zu bestimmen, und daher zu informieren, neue oder verbesserte therapeutische Optionen. Erkennung von extrazellulären Proteininteraktionen von weit verbreiteten Technologien hat jedoch ein erhebliches Hindernis vor allem auf die technischen Herausforderungen, die Biochemie des zellulären Rezeptoren und ihren Interaktionspartnern vertreten. In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung von eine extrazelluläre Protein-Microarray für das Screening der Abfrage Proteine des Interesses, mit Schwerpunkt auf der Nutzung der Microbead-komplexe für die erweiterte Erkennung von PPI.
Sondieren Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen ist besonders anspruchsvoll, da viele physiologisch relevanten Paare durch sehr schwache Wechselwirkung gekennzeichnet sind mit verbindlichen Affinitäten in mikromolaren Palette2,3. Avidität Verbesserung durch Multimerization erweist sich eine sinnvolle Strategie, Empfindlichkeit zur Erkennung von geringe Affinität PPI zu erhöhen. Wir haben eine Methode basierend auf Fc Fusionsproteine für effiziente Bildung von multivalente Microbead-Protein Abfrage komplexe4entwickelt. Multimerization von der Abfrage-Protein ist ein wichtiger Schritt zur Erkennung von geringe Affinität PPI. Wie im Beispiel in Abbildung 2gezeigt, verbessert diese Methode erheblich Signal im Vergleich zu der gleichen Abfrage Protein als eine lösliche (nicht komplexiert) Analyten unter Beibehaltung minimalen Hintergrund gezeigt. Alternativ können die Protein-Microarray-Bildschirme durchgeführt werden mit löslichen Cy5-Label Abfrage Protein, ein Ansatz mit jeder Fusion Tag kompatibel ist und das kann zur Identifizierung von stabiler, höhere Affinität Interaktionen, wie jene zwischen ausreichen einige löslichen Liganden und ihre Rezeptoren. Es sei darauf hingewiesen, dass weil die Gier durch Multimerization der Abfrage auf Microbeads erhöht wird, die Microarray-Signal kein quantitatives Maß für die Stärke der Interaktion ist. Vielmehr sollten verbindliche Affinitäten mit den Monomeren Versionen der Proteine in der Bewertungsphase berechnet werden. Darüber hinaus ist es sehr ratsam, dass keine Treffer durch die Microarray-Technologie identifiziert durch unabhängige Methoden validiert werden. Wir verwenden routinemäßig Oberflächenplasmonenresonanz als Goldstandard biophysikalischen Methode für PPI Studien und Messung der verbindliche Kinetik.
Obwohl aus den Rahmen dieses Berichts, ist darauf hinzuweisen, dass der Erfolg jeder Screening-Bemühungen mit der Microarray-Technologie stark von Auswahl und Verfügbarkeit von einem hochwertigen Protein-Bibliothek abhängt. Relevante Kriterien für die Auswahl der extrazellulären Proteine wurden zuvor veröffentlichten4,22. Eine Reihe von nützlichen Tools für die Vorhersage von relevanten Protein-Funktionen (z. B. transmembranen Helices oder Signal-Peptide) sind frei online verfügbar, darunter die folgenden Server: SignalP15, TMHMM16, Phobious17und TOPCONS 18. ausgezeichnete Methoden Papiere beschreiben Affinität Reinigungsverfahren sind an anderer Stelle zur Verfügung. Es sollte auch erwähnt werden, dass die Microarray-Protein-Bibliothek-Generation stützt sich auf die Produktion des Proteins ECDs als lösliche rekombinante Produkte, und daher mit diesem Ansatz Studien können vom Typ I, Typ II und GPI-verankerte Zelle Oberfläche Rezeptoren und abgesondert Proteine, aber ist in der Regel nicht geeignet für multitransmembrane-haltige Proteine wie G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Die Reinigung von Hunderten von Proteinen als rekombinante lösliche Proteine erfordert erhebliche logistische Anstrengungen und kann sehr Ressourcen- und zeitintensiv. Dennoch ist mit der verringerten Kosten der Gensynthese und erhöhter Durchsatz von Protein-Reinigung-Systeme, Bibliothek Generation jetzt relativ schneller und günstiger. Alternativ bieten kommerzielle Quellen gereinigten extrazellulären Proteine, die in Mikrogramm Mengen erworben werden können, die für eine dauerhafte Protein-Microarray-Bibliothek angesichts der kleinen Anforderungen für Folie drucken-Generation ausreichen. Diese Einschränkungen ungeachtet, bietet Microarray-Technologie große Vorteile wie minimaler Verbrauch an Protein Reagenzien, schnelle Ablesung (neue PPI können innerhalb eines Tages identifiziert werden) und erschwinglichen Instrumentierung. Sobald die Konstrukte und Reinigung Bedingungen festgelegt wurden, produzieren kleine Reinigungen darüber hinaus genügend Stoff, um Tausende von Arrays vorzubereiten.
Schließlich wird in einigen Fällen relativ hoher Hintergrund beobachtet, erscheint als Bindung an viele Proteine auf der Microarray-Bibliothek. Es gibt mehrere Faktoren, die unspezifische Bindung beeinflussen könnte. Z. B. einige Proteine hoch erhoben werden, oder interagieren mit Kohlenhydraten, Bilanzierung von unspezifischen Hintergrund über Anerkennung der gemeinsame Motive. Ebenso kann unspezifischen Bindung auch aufgrund der Beschaffenheit des Abfrage-Proteins, wie z. B. Anerkennung von Sialinsäure Säure Motive, in mehrere andere Proteine gefunden werden. Da die Microarray-Bibliotheken zu erweitern, ist es wahrscheinlicher, dass eine gemeinsame Liste der unspezifischen Bindemittel vorhanden sein könnten. Solche unspezifischen Bindemittel können durch tracking ihr Verhalten auf verschiedenen Bildschirmen gegen unabhängige Abfrage Proteine identifiziert werden. Es ist ratsam, eine Liste der nicht-spezifischen Bindemittel auf Bildschirmen, um bestimmte hit Berufung zu verbessern zu generieren. In unserem Fall haben wir gefunden, dass die Anwendung eine 5 % Abschlag (d. h. , die ein Protein als unspezifische gekennzeichnet ist, wird erkannt, wie Binder 5 % oder mehr unabhängige Abfrage Protein Bildschirme ist) wichtig, Fehlalarme zu reduzieren. Es sei darauf hingewiesen, dass wenn der Hauptzweck der Assays ist nur ein paar ausgewählte Screens laufen, kann es nicht lohnenswert, eine statistische Analyse zu entwickeln sein. In diesem Fall es möglicherweise nicht durchführbar, Fehlalarme aufgrund einer begrenzten Dataset zu erkennen, und daher empfehlen wir, dass besonderes Augenmerk auf Bestätigung der Hits mit alternativen Methoden.
Wir gehen davon aus, dass die extrazelluläre Protein Microarrays, insbesondere in Kombination mit Multimerization Methoden zur Erkennung von transienten Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen, weiterhin bieten eine einzigartige Plattform für schnelle und robuste Identifizierung von neuartigen PPI in der Extrazellulärraum.
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Disclosures
B.h., S.R-R und nm-M. sind Mitarbeiter von Genentech und eigene Aktien im Genentech Inc./Roche-Konzern.
Acknowledgments
Wir danken Philamer Calses und Kobe Yuen kritisch das Manuskript zu lesen. Wir sind dankbar für Randy Yen für gute technische Beratung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
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