Summary
在这里, 我们提出了一个方案来筛选细胞外蛋白微阵列, 以识别新的受体配体相互作用在高通量。我们还描述了一种利用蛋白质微珠复合物来增强瞬态蛋白相互作用的检测方法。
Abstract
分泌因子、膜相连受体及其相互作用的伙伴是细胞通信的主要调节器, 并在稳态和疾病期间启动信号级联, 因此是主要的治疗靶点。尽管这些互动网络具有相关性, 但在现有数据库中的代表性仍然严重不足;因此, 大多数细胞外蛋白没有记录的结合伙伴。这种差异主要是由于与细胞外蛋白的研究相关的挑战, 包括功能蛋白的表达, 以及细胞表面受体之间经常建立的弱、低亲和力、蛋白质相互作用。这种方法的目的是描述打印细胞外蛋白库的微阵列格式, 以筛选蛋白质-蛋白质相互作用。为了能够检测弱相互作用, 描述了一种基于查询蛋白多化的方法。结合这种基于微珠的多聚化方法, 提高多价, 蛋白质微阵列允许在高吞吐量下对瞬态蛋白-蛋白质相互作用进行可靠的检测。这种方法提供了一种快速和低样本的方法, 用于识别适用于任何细胞外蛋白的新相互作用。介绍了蛋白质微阵列的制备和筛选方案。这项技术将有助于研究人员寻求一种可靠的方法来发现细胞外空间中的蛋白质相互作用。
Introduction
本文回顾的方法描述了以微阵列格式打印细胞外蛋白的方法, 然后是针对该库筛选感兴趣的目标的方法。我们已经确定蛋白质多化是检测以低结合亲和力为特征的相互作用的关键一步。为了加强对这些相互作用的检测, 我们描述了一种基于使用微珠对感兴趣的查询蛋白进行多聚合的协议。
分泌和细胞表面表达的蛋白质 (统称为细胞外蛋白) 及其相互作用的伙伴是细胞通信、信号传递和与微环境相互作用的关键调节剂。因此, 它们对于调节许多生理和病理过程至关重要。大约四分之一的人类基因组 (5, 000 蛋白质) 编码细胞外蛋白, 鉴于其对系统交付药物的重要性和可获得性, 是药物开发的关键目标1。因此, 细胞外蛋白占市场上已知的药物药理作用的蛋白质靶点的70% 以上, 被称为 "可吸毒蛋白质组"。尽管细胞外蛋白-蛋白质相互作用 (eppi) 网络的重要性和丰富性, 但在现有数据库中的代表性仍然明显不足。这从根本上说是由于细胞外蛋白的复杂生化性质, 从而使其无法使用最可用的技术进行表征2。首先, 膜蛋白很难溶解, 这一过程通常涉及苛刻的洗涤条件和洗涤剂;其次, 细胞外蛋白往往缺乏相关的翻译后修饰, 如糖基化, 当这些蛋白质表达在常用的异源系统中时, 糖基化是不存在的。最后, 受体之间的相互作用, 如在免疫细胞上表达的共同受体, 往往是短暂的, 并具有非常低的亲和力 (kd 在~ 1μm 到 & gt;100 μm 范围) 的特点。总之, 这些蛋白质的性质及其结合伙伴提供了最广泛使用的技术, 如亲和力净化/质谱 (ap/ms) 或酵母-双杂交, 不适合检测细胞外空间中的相互作用2,(三)有什么问题吗？
为了克服这些技术挑战, 加速发现细胞外蛋白的新相互作用, 我们开发了一个高覆盖率的细胞外蛋白微阵列 4,5。微阵列具有用少量样品生成高密度表面的优势, 通常适合进行高吞吐量研究。基于蛋白质微阵列的研究先前为几种模型生物的蛋白质相互作用提供了相关的见解, 尽管主要集中在细胞质相互作用或特定的蛋白质家族6,7, 8。相反, 利用这项技术研究细胞外蛋白相互作用的工作有限。我们开发了一种蛋白质微阵列方法, 通过构建一个全面和高度多样化的纯化分泌蛋白和单个跨膜 (stm) 受体库, 将其作为重组细胞外域 (ecd) 融合, 从而能够对 eppi 进行研究。常见的亲和纯化标签 4。蛋白质微阵列屏幕的成功在很大程度上取决于高质量蛋白质库的建立。对于培养蛋白和查询蛋白的表达, 优先选择哺乳动物细胞或昆虫细胞作为异源表达系统, 以确保正确添加翻译后修饰, 如糖基化或二硫化键。sds-page、尺寸排除色谱和多角度激光散射是评估重组蛋白质量的常用技术。然后, 蛋白质库被发现在环氧硅烷幻灯片上, 并存储在-20°c, 供长期使用。下面所述的协议建议蛋白质浓度超过 0.4 mgml。因此, 低表达的蛋白质可能需要在样品打印和储存之前采取浓缩步骤。然而, 这种技术的一个主要优点是所需的蛋白质体积小 (50 微克的蛋白质足以执行和 gt;2,000 屏幕), 同时只需极少的查询蛋白消耗 (每个重复屏幕20-25 微克)。使用此处描述的协议和设备, 并在库可用的情况下, 可以在一个工作日内生成单个查询蛋白的结果。
检测细胞外环境中蛋白质相互作用的一个主要挑战来自于它们的典型弱或瞬态性质, 这使得最常用的方法无法识别。提高结合亲和力大大提高了检测弱蛋白相互作用的灵敏度9,10, 11.基于这一原理, 我们开发了一种使用蛋白质 a 包覆珠子 4,5对查询蛋白 (表示为 fc 融合) 进行多聚化的方法。为了避免任何潜在的失活查询蛋白的随机标记, 我们改为标记一个不相关的人类免疫球蛋白 g 与 cy5, 并将其与查询蛋白一起添加到蛋白质 a 珠子, 从而消除任何伪影, 由于直接共轭的染料的蛋白质的利益。考虑到几个共受体对的微孔亲和力, 与筛选为可溶性蛋白的 fc 融合查询蛋白相比, 多价复合物大大提高了信噪比 4.
总之, 该协议的目标是描述微阵列幻灯片的制备, 其中包含预先存在的细胞外蛋白库, 用于识别受体配体相互作用。我们回顾了幻灯片打印的步骤, 然后是一个针对细胞外蛋白库筛选感兴趣的蛋白质的协议。此外, 我们还介绍了一种基于微珠的增强 eppi 检测方法, 以提高所研究的蛋白质的亲和力。这里描述的细胞外蛋白微阵列技术为筛选和检测低假阳性比的新型 eppi 提供了一种快速、可靠和有效的方法, 并且仅利用了查询蛋白的微克量。调查。这项技术推动了多项研究, 这些研究为以前未知的细胞功能和各种受体的信号通路提供了相关的见解, 包括病毒免疫调节剂14,可以用来去孤儿任何细胞外蛋白质的利益。
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Protocol
1. 细胞外人类蛋白质库的生成
- 编制一份细胞表面受体或感兴趣的分泌蛋白列表, 以建立蛋白质微阵列库。特定的蛋白质家族 (例如, 免疫球蛋白超家族) 或在特定细胞类型中选择性表达的蛋白质可以选择进行研究。
- 对于细胞表面受体, 通过使用软件工具识别信号肽和跨膜区域来确定细胞外域 (ecd) 边界。一些在网上免费提供的相关工具, 在材料表 15、16、17、18 中有所提及.
- 综合相关基因的 ecd, 克隆到相关载体中。分泌的蛋白质或 stm 受体的 ecd 融合到一些常见的亲和力标签可以从通过适当载体转染的细胞的条件培养基中纯化, 也可以从 baculovirus-虫细胞表达系统中纯化。
注: 建议使用哺乳动物细胞基系统 (如 hek/293 或 cho 细胞), 以最大限度地提高适当的蛋白质折叠和添加相关的翻译后修饰 (如糖基化) 的可能性。 - 采用标准的亲和纯化方法对蛋白质进行纯化。以前的努力描述了适用于纯化数百种蛋白质的自动化或半自动程序, 这些蛋白质可以缩放以生成感兴趣的蛋白质集 9、19、20、 21岁
注: 建议使用 sds-page、尺寸排除色谱 (s) 或多角度激光光散射 (malls) 来评估任何非共价聚集, 并控制蛋白质制剂的整体质量。 - 尽可能将蛋白质调整到200或 400μgml, 并将含有80% 甘油的库存稀释, 以便在-20°c 的低温小瓶中长期储存。这些代表主库存, 只有在必要时才应访问。
- 将每种蛋白质 (100μl) 的等价物转移到96孔板 (板), 用粘合箔密封, 并储存在-20°c, 直到微阵列幻灯片制备。生成库存板是为了最大限度地减少冻融循环并确保蛋白质的稳定性。
2. 细胞外蛋白微阵列印刷
- 使用标准的微阵列进行幻灯片打印。用于此处描述的协议的仪器具有57个幻灯片运行的容量, 并使用一个打印头, 其中包含48个发现引脚。这些引脚产生的点直径约为 100μm, 由点点到点的距离隔开 ~ 350 微米, 并且每个负载的点与点距离为0.25 微米。在此配置下, 每张幻灯片最多可容纳 8, 000个位置。
- 从库存板中生成工作板 (384个井板, 10μl samplewell)。在使用微阵列进行幻灯片打印之前, 请手动执行此步骤。然后, 在60% 的湿度下, 用填充型斑点针发现蛋白质滑落到环氧硅烷上 (以防止蛋白质斑点脱水)。
注: 可在每个蛋白质样本之间的重复物中发现有 cy3 标记的牛血清白蛋白 (bsa) (pbs% 甘油中的 5μg/ml), 以显示面膜拟合阵列 (见第4节)。虽然建议使用此步骤是可选的。 - 打印后, 从加湿环境中取出蛋白质微阵列幻灯片, 并在 pbst 中用5% 的牛奶将其在夜间阻止, 以使表面失活。
注意: 首选的方法是使用超声波雾雾产生一个细雾的阻塞溶液, 沉淀在幻灯片表面。 - 将幻灯片存放在-20°c 的50% 甘油中, 以防止结冰。
3. 多价诱饵配合物的制备
注意: 细胞外蛋白之间的相互作用通常具有低亲和力的特点。为了通过提高结合亲和力来检测这些相互作用, 开发了一种基于捕获查询蛋白 (以 fc 标记 ecd 表示) 的多价方法, 该方法位于 a 型蛋白质涂层微珠上4。
- 标记用于用 cy5 单反应染料检测的载体 igg, 并使用脱盐柱分离游离染料。通过测量280和650纳米的紫外线吸收率来确定染料与蛋白质的比率。
注意: 通常使用2.0 和4.0 之间的蛋白质-染料比率。建议将 cy5 共轭在 100, 000 x 克处旋转 15分钟, 以去除由于标记过程而产生的潜在可溶性聚集体。 - 通过对恒定数量的查询蛋白滴定蛋白 a 来确定最佳的微珠-蛋白质比。在没有游离 fc 标记蛋白残留的珠子的最小饱和体积中, 使用生物层干涉法确定的竞争性测定, 用于筛选。
- 通过孵育 fc 标记查询和带有蛋白质 a 的 cy5-igg, 在室温下在 pbs 中混合 30分钟, 形成微珠蛋白复合物。
- 要形成这些复合物, 请在最终浓度为20μgml 的情况下使用查询蛋白。为了计算查询蛋白和 cy5-igg 的摩尔比, 将查询蛋白的分子量除以 igg 的分子量 (150, 000 da), 乘以 40μgml, 以确定所需的 cy5-igg 浓度。
- 在与微阵列切片孵育之前, 用可溶性蛋白 a (1 mg/ml) 补充样品 (见下文第4.2 节), 以防止任何游离蛋白 a 珠与阵列上可能存在的 fc 融合蛋白结合。
注: 最终反应量可能因使用的杂交站或培养室而异。材料表中描述的仪器允许使用相对较小的体积 (每张幻灯片约 200μl) 进行样品孵育。
4. 细胞外蛋白微阵列筛选和处理。
注意: 有许多制造商提供自动处理平台。如果混合站不可用, 则可以手动执行以下步骤, 以确保有足够的缓冲区量, 使幻灯片始终处于浸没。
- 在室温下加热滑块, 用 pbs.1. 1% 补间 20 (pbst) 冲洗, 在装载到杂交站之前去除残留的甘油。
- 使用以下筛选协议:
- 用 pbst 清洗1分钟。
- 在 pbs% 的牛奶中装入200μl 的 1 mg/ml 蛋白 a, 孵育 30分钟, 以防止未络合的蛋白质 a 微珠与微阵列中可能存在的 fc 标记蛋白结合。
- 用 pbst 清洗 5次, 1分钟。
- 加载200μl 的查询: 微珠复合物在存在 1 mg/ml 蛋白 a 和孵育30分钟。
- 用 pbst 清洗1分钟。
- 杂交后, 用水冲洗滑梯, 放置在单个50毫升锥形管中, 以 900 x 克的速度旋转5分钟。
- 最后, 用适合检测 cy3 (如果已打印 bsa-cy3) 和 cy5 荧光的微阵列扫描仪扫描幻灯片, 在532和 635 nm 处进行激发。
- 使用随附的微阵列数据分析执行数据分析。相关的阵列列表 (作为. gal 文件) 被加载到数据提取软件中。在此阶段, 利用 cy3-bsa 点查找块, 并在软件中使用自动拟合选项, 然后在必要时手动对齐功能。将文件另存为. gpr 文件以供进一步分析。
5. 数据分析
- 将数据另存为 rpr 文件, 并使用 limma 封装在 r 中处理, 常用于分析微阵列数据4,5。
- 对于预处理, 请进行背景校正和幻灯片内规范化。由于每个蛋白质都是在重复的位置打印的, 因此将两个复制测量结果结合起来, 为库中的该蛋白质创建一个分数。
- 计算每张幻灯片的分数, 并分析高得分候选项在幻灯片之间的交集结果。
- 使用来自不同打印运行的重复微阵列来控制幻灯片的可变性, 并使用表示两个屏幕上的数据的交点图调用最终命中。
- 最后, 执行额外的过滤级别, 以排除阵列中的杂乱蛋白质。这类非特异性粘合剂被确定为超过用户在独立屏幕上定义的特定阈值命中频率的蛋白质。
注: tom等人2013年5对该协议作了详细介绍。在我们的例子中, 非特定的活页夹调用是基于对累积猎物命中率的确定, 并使用5% 的数据驱动消除阈值。
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Representative Results
细胞外蛋白微阵列技术的工作流程示意图如图 1所示。一旦含有细胞外蛋白库的微阵列幻灯片可用, 即可在一天内完成感兴趣的蛋白质筛选和数据分析。膜内化受体之间许多生理上相关的相互作用的特点是非常弱的结合强度 (kd在微摩尔范围内)。为了提高对这种相互作用的检测能力, 提出了一种基于查询蛋白 (以 fc 融合表示) 的方法, 该方法对 a-微珠蛋白进行了多聚化。本文介绍了此协议,图 2显示了此增强检测 ppi 的方法性能的一个代表性示例。
图 3给出了一个蛋白质微阵列屏幕的典型示例。在所示的例子中, 对一个孤儿人类腺病毒免疫调节蛋白进行筛选, 以便与一个由 1, 500多个受体 ecd 或分泌蛋白14组成的文库进行相互作用.如上所述, 病毒蛋白的 ecd 被重组表达为 fc 融合蛋白, 然后与 a 蛋白涂层微珠孵育, 形成多价复合物。使用杂交站对蛋白质复合物进行筛选, 以最大限度地减少人工操作, 但类似的筛选可以使用杂交室或类似的设备进行。建议使用在单独的 "发现" 运行中打印的幻灯片运行重复的屏幕, 以便在打印运行过程中控制任何变化。该图显示了来自重复的独立屏幕的交集图。在扫描板材时, 可以很容易地看到正相互作用和整体滑动背景 (cy5 荧光), 从而方便命中呼叫。请注意, 建议在副本中发现库中的每个受体, 以增加命中信心。对于大多数查询蛋白, 没有观察到, 一个, 或很少命中, 证明了检测 ppi 的方法的特殊性。
某些查询蛋白显示了通过与阵列内异常多的蛋白质结合或与幻灯片结合而检测到的高背景。根据我们的经验, 这种非特异性的背景只观察到少量的蛋白质。与蛋白质性质相关的不同因素可能会影响非特异性相互作用, 例如糖基化图案的识别。图 3显示了一个病毒蛋白的示例, 该病毒蛋白在微阵列库中筛选出来, 该库的背景较高, 无法识别特定的命中。虽然对协议的一些小修改可以被认为是为了减少背景 (如增加盐或洗涤剂浓度), 但在这些情况下, 建议探索替代方法, 对正在研究的蛋白质进行脱非化。
图 1: 细胞外蛋白微阵列, 用于快速、可靠地识别受体配体相互作用.(第1步)一个感兴趣的细胞外蛋白库被编译出来。(第2步)纯化后的蛋白质使用微阵列打印机打印在环氧硅烷幻灯片上, 并存储在-20°c。(第3步)在微珠上对感兴趣的查询蛋白进行了多聚化处理, 以提高其亲和力和检测瞬态蛋白-蛋白质相互作用。荧光 igg 与查询相结合: 微珠作为惰性标记载体。(第4步)筛选查询蛋白的绑定伙伴。荧光查询蛋白复合体与细胞外蛋白微阵列进行筛选, 利用杂交站进行自动滑动处理。(第5步)然后使用微阵列扫描仪对幻灯片进行可视化。在 535 nm 通道中可以观察到 bsa-cy3 点, 从屏幕上产生的命中可以在 635 nm 处作为重复的点观察到。命中呼叫的数据分析是通过创建两个独立实验的交点图来实现的。点击是根据背景以上的相互高分调用的, 如协议部分所述。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 通过为查询蛋白形成多价复合物来增强信号。(a)查询蛋白的多化.查询蛋白以重组 fc 融合的形式表达, 并与蛋白 a 微珠耦合, 形成多重复合物。(b)高亲和力导致低亲和力相互作用的检测。多聚查询蛋白提供的亲和力导致蛋白质微阵列上弱相互作用的稳定, 从而提高信噪比和命中呼叫。图显示 cd200 的筛选结果, 筛选为微珠复合物, 或直接标记为 cy5 染料的可溶性蛋白质, 以便对命中进行可视化。多化 (红条) 可以可靠地检测低亲和力结合伙伴 cd200r1, 存在于蛋白质微阵列库中, 与筛选为可溶性产物 (蓝条) 的同一蛋白质相比, 具有显著的信噪比。灰色条形图表示非特定的粘合剂。剧情中只代表了前 1 0名的互动。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 蛋白质微阵列技术, 用于识别新的受体-受体-病毒-宿主相互作用。(a)一种孤立腺病毒免疫调节蛋白的典型受体发现结果。图像表示实际的微阵列扫描, 显示从重复 (红色) 中发现的蛋白质的命中。检测是在重复项中执行的, 以控制任何幻灯片的可变性, 并将结果表示为交集图。在图中, 红色和蓝色点表示仅在一个数组复制上调用的命中, 而黑点表示两个独立运行的相交命中。鉴于集合中存在的蛋白质数量, 整个微阵列库打印在两张幻灯片上, 便于使用, 并确保阵列上发现的每个蛋白质有足够的分离。(b)病毒蛋白屏幕显示高背景, 排除命中呼叫。某些查询蛋白可能会显示较高的背景, 通过与多个蛋白质和/或幻灯片结合检测到, 因此对识别高得分命中提出了挑战。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
大量的孤立受体仍然存在于人类基因组中, 新的相互作用的伙伴继续出现的细胞外蛋白与以前的特征配体。定义人类和模型生物中的受体配体相互作用对于了解在稳态过程中决定细胞通信的机制以及导致疾病的失调至关重要, 因此为新的或改进的机制提供信息治疗方案。然而, 广泛使用的技术检测细胞外蛋白相互作用是一个重要的障碍, 主要原因是与细胞受体及其相互作用伙伴的生物化学相关的技术挑战。在本报告中, 我们描述了使用细胞外蛋白微阵列筛选感兴趣的查询蛋白, 重点是利用微珠复合物增强检测 ppi。
探针受体相互作用是特别具有挑战性的, 因为许多生理相关的对的特点是非常弱的相互作用与结合亲和力在微摩尔范围2,3。通过多聚化增强亲和力已被证明是提高低亲和力 ppi 检测灵敏度的有用策略。我们开发了一种基于 fc 融合蛋白的方法, 用于高效形成多价微珠蛋白查询复合物4。查询蛋白的多化是检测低亲和力 ppi 的关键步骤。如图 2中的示例所示, 与筛选为可溶性 (非络合) 分析物的同一查询蛋白相比, 该方法显著增强了信号, 同时保留了最小的背景。或者, 蛋白质微阵列屏幕可以使用可溶性 cy5 标记的查询蛋白进行, 这种方法与任何融合标记兼容, 足以识别更稳定、更高亲和力的相互作用, 例如一些可溶性配体和它们的受体。需要注意的是, 由于微珠查询的多聚化提高了满意度, 微阵列信号不是对相互作用强度的定量测量。相反, 结合亲和力应该计算与正在评估的蛋白质的单体版本。此外, 通过微阵列技术识别的任何命中都应通过独立的方法进行验证, 这也是非常可取的。我们经常使用表面等离子体共振作为黄金标准的生物物理方法进行 ppi 研究和结合动力学的测量。
虽然不属于本报告的范围, 但应当指出, 使用微阵列技术的任何筛选工作的成功在很大程度上取决于高质量蛋白质库的选择和提供。选择细胞外蛋白的相关标准已在4,22之前发表。一些用于预测相关蛋白质特征 (如跨膜螺旋或信号肽) 的有用工具可在网上免费获得, 其中包括以下服务器: signalp15、tmhmm16、Phobious17和 topcons18. 其他地方都有描述亲和力净化方法的优秀方法文件。还应该提到的是, 微阵列蛋白库的产生依赖于蛋白质 ecd 作为可溶性重组产物的生产, 因此这种方法允许研究 i 型、ii 型和 gpi 锚定细胞表面受体和分泌物蛋白质, 但一般不适合含有多膜的蛋白质, 如 g 蛋白偶联受体。将数百种蛋白质纯化为重组可溶性蛋白质需要大量的逻辑努力, 并且可能非常资源和耗时。然而, 随着基因合成成本的降低和蛋白质纯化系统吞吐量的增加, 图书馆的生成现在相对更快、更实惠。或者, 商业来源提供纯化的细胞外蛋白, 可以购买微克量, 这足以生成一个持久的蛋白质微阵列库, 因为对幻灯片打印的要求很小。尽管存在这些限制, 微阵列技术提供了巨大的优势, 如蛋白质试剂的消耗最小、快速读数 (新的 ppi 可以在一天内确定) 和负担得起的仪器。此外, 一旦建立了建造和净化条件, 小规模的净化就能产生足够的材料来制备数千个阵列。
最后, 在某些情况下, 观察到相对较高的背景, 显示为与微阵列库上的许多蛋白质结合。有多种因素可能会影响非特定绑定。例如, 某些蛋白质可能具有很高的电荷, 或与碳水化合物相互作用, 通过识别常见的图案来考虑非特定的背景。同样, 非特异性结合也可能是由于查询蛋白的性质, 例如, 在多个其他蛋白质中发现的唾液酸图案的识别。随着微阵列库的扩展, 可能会出现一个非特定绑定器的通用列表。这种非特异性粘合剂可以通过跟踪它们在不同屏幕上针对不相关的查询蛋白的行为来识别。建议在屏幕上生成一个非特定绑定器列表, 以改进特定的命中调用。在我们的案例中, 我们发现, 应用5% 的截止时间 (即,如果检测到一种蛋白质为5% 或更多不相关的查询蛋白屏幕, 则将其标记为非特定) 对于减少误报非常重要。需要注意的是, 如果检测的主要目的是只运行几个选定的屏幕, 可能不值得进行统计分析。在这种情况下, 由于数据集有限而检测误报可能不可行, 因此我们建议特别强调使用替代方法确认命中。
我们预计, 细胞外蛋白微阵列, 特别是结合多聚化方法检测瞬态受体配体相互作用, 将继续提供一个独特的平台, 快速和可靠地识别新的 ppi细胞外空间。
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Disclosures
b. h.、s. r-r 和 n. m-m。是 genentech 的员工, 并拥有 genentech inc./roche 集团的股份。
Acknowledgments
我们感谢菲拉默·卡尔和神户圆对手稿的批判性阅读。我们感谢任志刚提供的优秀技术咨询。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
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