Summary
Здесь мы представляем протокол для экрана внеклеточный протеин microarrays для идентификации Роман рецептор лиганд взаимодействий в высокой пропускной способности. Мы также описывают метод для улучшения обнаружения переходных белок белковых взаимодействий с помощью белка microbead комплексов.
Abstract
Выделяется факторы, мембрана привязанный рецепторов и их взаимодействия партнеров являются основными регуляторами сотовой связи и начало сигнальные каскады во время гомеостаза и болезней и как таковые представляют собой премьер терапевтических целей. Несмотря на их актуальности эти сети взаимодействия по-прежнему значительно недопредставлены в текущих базах данных; Таким образом наиболее внеклеточных белков у партнера не документированы привязки. Это расхождение обусловлено прежде всего проблемы, связанные с изучением внеклеточных белков, включая выражение функциональных белков и слабый, низкий сродство, взаимодействий протеина, часто создаваемых между поверхности рецепторы клеток. Этот метод предназначен для описания печать библиотеки внеклеточных белков в формате microarray для скрининга белок белковых взаимодействий. Чтобы включить обнаружение слабых взаимодействий, описан метод, основанный на multimerization белка запроса под исследование. Связан этот подход на основе microbead multimerization для увеличения поливалентность, microarray протеина позволяет надежного обнаружения переходных белок белковых взаимодействий в высокой пропускной способности. Этот метод предлагает пример быстрого и низкого потребления подход для идентификации новых взаимодействий, применимым к любой внеклеточных белков. Описаны протеина microarray печати и скрининга протокол. Эта технология будет полезным для следователей, ищущих надежный метод для обнаружения белковых взаимодействий в внеклеточного пространства.
Introduction
Метод, рассмотрели здесь описывает печать коллекции внеклеточных белков в формате microarray дна, а затем с помощью метода для проверки целевого интерес против этой библиотеки. Мы выявили белок multimerization как решающий шаг для обнаружения взаимодействий, характеризуются низкой привязки сродства. Для улучшения обнаружения этих взаимодействий, мы описываем протокол, основанный на multimerization запроса протеина интереса, используя микрошарики.
Выделяется и клеток выражена поверхности белки (собирательно именуются внеклеточные белки) наряду с их взаимодействия партнеров являются ключевые регуляторы сотовой связи, сигнализации и взаимодействия с микроокружения. Таким образом, они имеют важное значение в регуляции многих физиологических и патологических процессов. Около четверти генома человека (≈5, 000 белки) кодирует внеклеточных белков, который, учитывая их важность и доступность для систематически поставляемых наркотиков, представляют собой ключевые цели развития наркотиков1. Следовательно внеклеточные белки представляют более чем 70% белковых мишеней с известных фармакологических действий для утвержденных лекарств на рынке, известный как «druggable протеом». Несмотря на их важность и изобилия внеклеточный протеин взаимодействия (ePPI) сетей по-прежнему удивительно недопредставлены в доступных баз данных. Это принципиально ввиду сложных биохимических внеклеточных белков, который исключает их характеристик с помощью самых доступных технологий2. Во-первых мембранные белки трудны для того солюбилизировать последнего, процесс, который часто включает в себя тяжелые Стиральная условий и моющих средств; Во-вторых внеклеточные белки часто не хватает соответствующих столб-поступательные изменения таких как гликозилирования, отсутствуют когда эти белки выражаются в часто используемые гетерологичных систем. Наконец, взаимодействие между рецепторов, таких как сопредседатель рецепторов, выраженные на иммунные клетки, часто переходных и характеризуется очень низкой работоспособностью (D K в ~ 1 мкм для > 100 мкм диапазон). В общей сложности характер этих белков и их привязки, которые партнеры оказывают наиболее широко используемых технологий, таких как сродства очищения/масс-спектрометрии (AP/МС) или дрожжи 2 гибрида, непригодных для обнаружения взаимодействий в пространстве внеклеточного 2 , 3.
В попытке преодолеть эти технические проблемы и ускорить открытие новых взаимодействий для внеклеточных белков мы разработали высокий охват внеклеточный протеин microarray дна4,5. Microarrays предлагают преимущество создания высокой плотности поверхности с небольшим количеством образца и обычно поддаются исследования высокой пропускной способности. Исследования на основе microarray протеина ранее предоставили соответствующие понимание взаимодействия протеина для нескольких модельных организмов, хотя главным образом на цитозольной взаимодействия или на конкретных белка семьи6,7, 8. В отличие от ограниченных была проделана расследовать внеклеточный протеин взаимодействия с использованием этой технологии. Мы разработали метод microarray протеина для включения исследований ePPIs путем создания всеобъемлющего и весьма разнообразных библиотека очищенного секретируемые белки и одного трансмембранные рецепторы (СТМ) выражена как рекомбинантной внеклеточных доменов (ECD) сливается с общие теги для очищения сродства4. Успех на экранах microarray протеина опирается на создание высокого качества белка библиотеки. Для выражения запроса, так и библиотека белка mammalian клетки или клетки, насекомых преференциально были выбраны как гетерологичных выражение системы, для обеспечения правильного сложения столб-поступательные изменения таких облигаций гликозилирования или дисульфида. SDS-PAGE, размер гель-проникающей хроматографии и мульти-угол лазерного рассеяния света являются методы обычно используются для оценки качества рекомбинантных белков. Белка библиотека затем увидел на epoxysilane слайды и температуре-20 ° C для долгосрочного использования. Концентрация белка выше 0,4 мг/мл рекомендуются для протокола, описанных ниже. Таким образом низкий выражая белков может потребовать концентрации шаг до печати выборки и хранения. Тем не менее, основным преимуществом этого метода является небольшой объем белка требуется (50 мкг белка достаточно выполнить > 2000 экраны), наряду с минимальным запроса потребление белка (20-25 мкг за дубликаты экран). С использованием протокола и оборудования описано здесь, и если имеются библиотеки, результаты для отдельных запросов белки могут быть получены в течение одного рабочего дня.
Одной из основных задач при выявлении взаимодействий протеина в внеклеточных среды вытекает из их характерно слабое или временный характер, что исключает возможность идентификации, наиболее часто используемых методологий. Расширения привязки алчность значительно улучшает чувствительность для обнаружения слабых белковых взаимодействий9,10,11. Основываясь на этом принципе, мы разработали метод multimerize запроса белки (выражается как ФК fusion) с помощью белка A-покрытием бусины4,5. Чтобы избежать любой потенциальной инактивации белка запроса путем случайных маркировки, мы вместо этого метка не значения человеческого иммуноглобулина G с Cy5 и добавить его вместе с запроса белка белка А бусы, таким образом устраняя любые артефакты из-за прямого сопряжения краситель для протеина интереса. С учетом всех сходство несколько пар ко-рецептор, разносторонним комплексы значительно повысить соотношение сигнал-шум, по сравнению с Fc фьюжн запросов белки показан как растворимые белки4.
Таким образом цель настоящего Протокола является описать подготовку microarray слайды, содержащий существующие библиотеки внеклеточный протеин для идентификации рецептор лиганд взаимодействий. Мы рассмотрим шаги, необходимые для печати, а затем протокол для скрининга протеина интереса против внеклеточных белков библиотеки слайдов. Кроме того мы описываем метод расширения обнаружения ePPIs на основании микрошарики для достижения увеличения алчность белка изучается. Описанная здесь технология microarray внеклеточный протеин представляет собой быстрый, надежный и эффективный подход для скрининга и выявления роман ePPI с низким коэффициентом ложно положительных и, используя только микрограмм количеств белка запроса под расследование. Эта технология подпитывается несколько исследований, которые предоставили соответствующие взглянуть на ранее неизвестных клеточных функций и сигнальных путей для различных рецепторов12,13, включая вирусный immunoregulators14, и может быть использован для снятия orphanize любой внеклеточный протеин интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация библиотеки внеклеточных белков человека
- Составить список поверхности рецепторы клеток или секретируемые белки, представляющие интерес для построения библиотеки microarray протеина. Конкретные белка семьи (например, Иммуноглобулин надсемейства) или белки выборочно выразил в частности ячейки, выбранные типы для изучения.
- Для поверхности рецепторы клеток определите границы внеклеточного домена (ECD) путем выявления сигнала пептида и трансмембранного регионов с использованием программных средств. Некоторые из соответствующие инструменты, свободно доступны онлайн, на которые имеются ссылки в Таблице материалов15,16,17,18.
- Синтезировать РДРВ для гены интереса и клонов в соответствующий вектор. Секретируемые белки или ECD STM рецепторов, склеенный ряда общих теги сродства могут быть очищены от кондиционером СМИ с соответствующим вектором transfected клеток, или от клеток бакуловирусы насекомое выражение систем.
Примечание: Mammalian клеток на основе систем (например, ГЭС/293 или Чо клетки) рекомендуется увеличить вероятность надлежащего белка складчатости и добавления соответствующих Посттрансляционная модификации, такие как гликозилирования. - Очищайте протеины стандартных сродства очищения методами. Предыдущие усилия описал автоматических или полуавтоматических процедур подходит для очистки сотни протеинов, которые можно масштабировать для создания набора белков интерес9,19,20, 21.
Примечание: Рекомендуется SDS-PAGE, размер гель-проникающей хроматографии (S) или Multi-угол лазерного рассеяния света (центры) для оценки любой non ковалентные агрегирования и управления для общего качества белковых препаратов. - Отрегулируйте белки до 200 или 400 мкг/мл, когда это возможно и разбавленных запасов с 80% глицерином для длительного хранения в криогенных флаконов при-20 ° C. Они представляют собой главные запасы и должны быть доступны только при необходимости.
- Передавать аликвоты каждого белка (100 мкл) 96-луночных пластины (фондовых пластины), печать с клей фольги и хранить при температуре от-20 ° C до подготовки слайд microarray. Складе пластины создаются к минимуму циклов замораживания оттаивания и обеспечить стабильность белков.
2. внеклеточный протеин Microarray печати
- Используйте стандартный microarrayer для печати слайдов. Инструмент используется для протокола, описанные здесь имеет мощность 57 слайды/запуск и использует печатающей головки, проведение 48 пятнистость выводов. Эти контакты генерировать пятна диаметром ~ 100 мкм, spot спот расстояние ~ 350 мкм и рисует 0,25 мкл за нагрузки. В этой конфигурации до 8000 пятен на слайд могут быть размещены.
- Создавать рабочие пластины (384 хорошо пластины, 10 мкл пример/хорошо) из запасов пластины. Выполните этот шаг вручную до печати слайдов с помощью microarrayer. Затем место белки с перо тип кровянистые выделения булавками на epoxysilane слайды на 60% влажности (для предотвращения обезвоживания пятна протеина).
Примечание: Cy3-меченых бычьим сывороточным альбумином (БСА) может быть выставлен в дубликаты между каждый образец протеина (5 мкг/мл в PBS/40% глицерола) для визуализации в массив допольнительных маска (см. раздел 4). Хотя рекомендуется, этот шаг является необязательным. - После печати, удалите слайды microarray протеина из среды увлажненные и блокировать их на ночь с 5% молока в PBST для инактивации поверхности.
Примечание: Рекомендуется использовать ультразвуковые фоггер для генерации штраф туман блокирования решения, которое оседает на поверхности скольжения. - Хранить слайды при температуре-20 ° C 50% глицерина для предотвращения замерзания.
3. Подготовка многовалентных приманки комплексов
Примечание: Взаимодействие между внеклеточные белки часто характеризуются низкой работоспособностью. Чтобы включить обнаружение этих взаимодействий, увеличивая привязки алчность, разносторонним подход, основанный на захват запроса белка, выраженный в виде Fc тегами РДРВ, белок А-покрытием микрошарики был разработаны4.
- Ярлык перевозчик IgG, используется для обнаружения с Cy5 monoreactive красителя и отдельные бесплатно краска с использованием опреснительной столбцов. Определите красителя соотношения белков путем измерения поглощения ультрафиолетового 280 и 650 Нм.
Примечание: Обычно используются соотношения белков краситель 2.0 и 4.0. Рекомендуется для спина Cy5 конъюгатов на 100,000 x g 15 мин для удаления потенциальных растворимых агрегатов из-за процесса маркировки. - Определите оптимальное соотношение microbead белка, титрование белка против постоянное количество белка запроса. Минимальный объем насыщения бусы, где нет свободного Fc тегами белка остается, как измеряется с помощью конкурентных пробирного определяется biolayer интерферометрии, используется для проверки.
- Форма microbead белковых комплексов по инкубации Cy5-IgG с белком А микрошарики и смеси на трубку ротатора в PBS на 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света и Fc тегами запроса.
- Для формирования этих комплексов, используйте запрос белка в конечной концентрации 20 мкг/мл. Чтобы вычислить молярное соотношение белка запроса и Cy5-IgG, разделите молекулярная масса белка запроса, молекулярная масса IgG (150000 Da) и умножить на 40 мкг/мл для определения концентрации Cy5-IgG необходимы.
- Дополняют образцы с растворимого белка (1 мг/мл) немедленно до инкубации с microarray слайды (см. ниже раздел 4.2) для предотвращения привязки любой свободный белок А бисера ФК синтез белков, которые могут присутствовать в массиве.
Примечание: Объем окончательной реакции может варьироваться в зависимости от гибридизации станции или инкубации камеры используются. Приборостроение, описанные в Таблица материалов позволяет инкубации образца с помощью относительно небольших объемах (~ 200 мкл каждого слайда).
4. внеклеточный протеин Microarray проверки и обработки.
Примечание: Существует ряд производителей, которые обеспечивают автоматическую обработку. Если гибридизации станция не доступна, следующие действия могут выполняться вручную, обеспечение достаточного объема буфера держать слайды погруженной во все времена.
- Теплый слайды при комнатной температуре и сполосните анимации PBS/0.1% 20 (PBST) для удаления остаточных глицерин перед загрузкой на станции гибридизации.
- Используйте следующий протокол проверки:
- Вымойте с PBST за 1 мин.
- Загрузка 200 мкл 1 мг/мл белок в молоке PBS/5% и Инкубируйте 30 мин для предотвращения uncomplexed белка микрошарики от привязки к Fc тегами белков, которые могут присутствовать в microarray.
- Пять раз промыть PBST за 1 мин.
- Загрузка 200 мкл комплекс присутствии 1 мг/мл протеин A запроса: микрошарики и Инкубируйте 30 мин.
- Вымойте с PBST за 1 мин.
- После гибридизации промойте слайды с водой, место в отдельных 50 мл конические трубы и сухой, спиннинг на 900 x g за 5 мин.
- Наконец сканируйте слайды с microarray сканера необходимо обнаружить Cy3 (если BSA-Cy3 был напечатан) и Cy5 флуоресценции, захватывающие 532 и 635 нм, соответственно.
- Выполните анализ данных с помощью сопутствующих microarray анализ данных. Список соответствующих массивов (в виде файла .gal) загружается в программное обеспечение извлечения данных. На этой стадии используют Cy3-BSA пятна найти блоков и использовать варианты автоматическ штуцера в программном обеспечении, следуют руководство выравнивание возможностей при необходимости. Сохраните файлы как файлы .gpr для дальнейшего анализа.
5. анализ данных
- Сохраните данные в виде файлов ППГ и процесс в R, с помощью пакета Лимма, обычно используются для анализа данных microarray дна4,5.
- Для предварительной обработки, фон коррекции и нормализации в слайд. Поскольку каждый белок печатается в дублированных пятна, объединить оба измерений для создания единого Оценка для этого белка в библиотеке.
- Вычисления оценки для каждого слайда и анализировать результаты для пересечения высокого забил кандидатов между слайдами.
- Используйте повторяющиеся microarrays управления от отдельных тираж для слайд изменчивости и пересечения участков, представляющих данных из обоих экранах для вызова окончательный хитов.
- Наконец выполните дополнительный уровень фильтрации исключить прослушивающем белков в массиве. Такие неспецифические Биндеры определяются как белки, превышает особый статистический порог хит частоты, как определено пользователем через независимые экраны.
Примечание: Этот протокол описана подробно в том et al. 20135. В нашем случае неспецифической связыватель вызова на основании определения совокупного добычу хит ставки, и данными ликвидации порог 5% используется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема рабочего процесса для технологии microarray внеклеточный протеин показан на рисунке 1. После того, как слайды microarray дна, содержащий библиотеку внеклеточных белков доступны, скрининг протеина интереса и анализ данных может быть завершена в течение одного дня. Многие физиологически соответствующего взаимодействия между рецепторы мембраны встроенный характеризуются очень слабое связывание сильные (D K в пределах всех). Чтобы улучшить обнаружение таких взаимодействий, был разработан метод, основанный на multimerization белка (выражается как ФК fusion) запрос на протеин A-микрошарики. Этот Протокол описан в тексте, и представитель пример эффективности этого подхода для расширения обнаружения PPI показано на рисунке 2.
На рисунке 3представлен представителем пример экрана microarray протеина. В этом примере показано сирот человека аденовирус иммуномодулирующих белка проверяется для взаимодействия против Библиотека, состоящая из более чем 1500 рецептора ECD или секретируемых белки14. Как описано, ECD вирусного белка recombinantly выражается как ФК синтез белка и затем инкубируют с белком А-покрытием микрошарики сформировать многовалентных комплексов. Белковых комплексов были проверены с помощью гибридизации станции для сведения к минимуму ручные операции, однако, аналогичные экраны может производиться с использованием гибридизации камеры или аналогичных устройств. Рекомендуется выполнять повторяющиеся экраны с использованием слайдов, напечатан в отдельном пятнистость работает для того, чтобы контролировать любые изменчивости во время печати тиража. На рисунке показан результирующий пересечения участков от дубликатов, независимые экраны. Позитивное взаимодействие и общий фон слайда легко визуализируется после сканирования плит (Cy5 флуоресценции), содействие хит призвание. Обратите внимание, что рекомендуется для съемки каждого рецептора в библиотеке в дубликаты таким образом, чтобы увеличить уверенность в хит. Для большинства запросов белков, никто не наблюдаются один или несколько хитов, демонстрируя специфичность метода для обнаружения ИЦП.
Некоторые белки запроса показывают высокий фон обнаружены путем привязки к необычно большое количество белков в массиве и/или к слайду. По нашему опыту такие неспецифические фон наблюдается только небольшое количество белков. Различные факторы, связанные с характером белка может повлиять неспецифичные взаимодействия, как признание гликозилирования мотивы. На рисунке 3 показан пример вирусного белка, экранированный против microarray библиотеки, который показал высокий фон, исключающее идентификации конкретных хитов. Хотя незначительные изменения в протоколе могут рассматриваться для уменьшения фона (например, увеличения соли или концентрации моющего средства), в этих случаях рекомендуется изучить альтернативные методы для deorphanization белка изучается.
Рисунок 1: внеклеточный протеин microarrays для быстрой и надежной идентификации взаимодействий рецептор лиганд. (Шаг 1) Компиляция библиотеки внеклеточных белков интереса. (Шаг 2) Очищенные белки печатаются на epoxysilane слайды с помощью принтера microarray и хранятся при температуре-20 ° C. (Шаг 3) Multimerized на микрошарики для увеличения алчность и обнаружения переходных белок белковых взаимодействий запрос протеина интереса. Флуоресцентный IgG complexed с запроса: микрошарики как инертный помечены перевозчика. (Шаг 4) Скрининг для партнеров привязки запроса белка. Комплекс белков флуоресцентные запроса проверяется против внеклеточных белков microarray дна с помощью гибридизации станции для автоматизированных слайд обработки. (Шаг 5) Затем слайды визуализируются с использованием сканера microarray. BSA-Cy3 пятна можно наблюдать в канале 535 Нм и хиты, принесли на экране можно наблюдать как повторяющиеся пятна в 635 нм. Анализ данных для хит вызов выполняется путем создания участков пересечение двух независимых экспериментов. Хиты, называются основе взаимно высокие баллы выше фона, как описано в разделе протокол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: расширение сигнал через образование многовалентных комплексов для запроса белка. (A) Multimerization запроса белков. Запрос белки выраженный рекомбинантных ФК сплавливания и сочетании протеина A микрошарики формы multimerized комплексов. (B) высокий жадность приводит к обнаружения низкого сродства взаимодействий. Алчность, обеспечиваемой белка результаты запроса multimerized в стабилизации слабого взаимодействия на microarray протеина, приводит к выше сигнал шум коэффициенты и расширенной хит призвание. Участков показывает результаты проверки для CD200, показан как microbead комплекс, или растворимого белка, непосредственно помечены Cy5 краситель для визуализации хитов. Multimerization (красные столбики) позволяет надежного обнаружения низкого сродства связывание партнера CD200R1, присутствует в библиотеке microarray протеина, с значительным сигнал/шум по сравнению с же белок показан как растворимый продукт (синие столбики). Серые полоски указывают на неспецифические связующих. Были представлены только топ 10 взаимодействий в заговоре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: microarray протеина технологии для идентификации Роман рецептор рецептор вирус хост взаимодействий. (A) результаты обнаружения образцовую рецептор для сирот аденовирусных Иммуномодулирующий протеин. Образы представляют собой фактические microarray сканов, показаны хиты от белков, заметили в дубликаты (красный). Анализы проводятся в дубликаты для управления для любой слайд изменчивости и результаты представлены в виде пересечения участков. В участках красный и синий точки представляют хитов, называется только на репликацию одного массива, тогда как черные точки представляют пересекающихся хитов от выполнений независимых. Весь microarray библиотека печатается на два слайда для простоты использования, учитывая количество белков, присутствующих в коллекции и обеспечить достаточно разделения для каждого индивидуального белка, заметили в массиве. (B) экрана вирусных белков, экспонируется высокая предпосылка, что исключает хит призвание. Некоторые белки запроса может отображать высокий фон, как обнаружено путем привязки к нескольким белков и/или слайды, поэтому создает проблемы для идентификации высокого забил хитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Значительное число сирот рецепторов остается в геноме человека, и Роман взаимодействующих партнеры продолжают появляться внеклеточных белков с ранее характеризуется лигандами. Определение рецептор лиганд взаимодействия человека и модельных организмов необходимо понять механизмы, которые диктуют сотовой связи во время гомеостаза, а также регуляции приводит к болезни и поэтому сообщить новых или усовершенствованных терапевтические возможности. Тем не менее обнаружение внеклеточного белковых взаимодействий, широко используемых технологий представляет значительный барьер главным образом из-за технических проблем, связанных с биохимии клеточных рецепторов и их взаимодействия партнеров. В настоящем докладе мы описывают использование microarray внеклеточный протеин для проверки запросов протеинов интереса, с упором на использование microbead комплексов для расширения обнаружения ИЦП.
Зондирование рецептор рецептор взаимодействия является особенно сложным, как многие физиологически соответствующие пары характеризуются очень слабое взаимодействие с обязательными сходство в обработку диапазона2,3. Алчность повышение через multimerization оказалась полезной стратегией для повышения чувствительности для обнаружения низкого сродства ИЦП. Мы разработали метод, основанный на ФК синтез белков для эффективного формирования запросов многовалентных microbead белковых комплексов4. Multimerization запроса белка является ключевым шагом для обнаружения низкого сродства ИЦП. Как показано в примере на рисунке 2, этот метод значительно усиливает сигнал по сравнению с же запрос белок показан как водорастворимые (не complexed) аналита, сохраняя при этом минимальный фон. Кроме того экраны microarray протеина могут быть выполнены с растворимых Cy5-меченых запросов белка, подход, который совместим с любой тег фьюжн и что может быть достаточно для идентификации более стабильной, выше сродство взаимодействий, например между Некоторые растворимых лигандов и их рецепторов. Следует отметить, что поскольку алчность увеличивается через multimerization запроса на микрошарики, microarray сигнал не является количественная мера силы взаимодействия. Скорее привязка работоспособностью должна быть рассчитана с мономерных версий белков под оценки. Кроме того настоятельно рекомендуется, что любые хиты, выявленных с помощью технологии microarray проверяются через независимых методов. Мы регулярно использовать поверхностного плазмон резонанс как золотой стандарт биофизический метод для измерения кинетики привязки и PPI исследований.
Хотя и выходит за рамки настоящего доклада, следует отметить, что успех любых усилий скрининг с использованием технологии microarray сильно зависит от выбора и доступности высококачественного белка библиотеки. Соответствующие критерии для выделения внеклеточных белков были ранее опубликованы4,22. Ряд полезных инструментов для прогнозирования особенностей соответствующих белков (например трансмембранных спиралей или сигнал пептиды) свободно доступны онлайн, включая следующие серверы: SignalP15, TMHMM16, фобический17и TOPCONS 18. отличные методы документов, описывающих методы очищения сродства доступны в других местах. Следует также отметить, что библиотека поколения microarray протеина опирается на производство белка ECDs как растворимые рекомбинантной продукции, и поэтому этот подход позволяет исследования типа I, тип II и GPI-якорь клеток поверхности рецепторы и выделяется белки, но обычно не подходит для multitransmembrane содержащих белков, таких как G белка-рецепторы. Очищение сотни белков как рекомбинантной растворимые белки требует значительные логистические усилия и может быть очень ресурсо - и трудоемких. Тем не менее с уменьшение расходов на ген синтеза и повысить пропускную способность систем очистки белков, Библиотека поколения теперь относительно быстрее и более доступным. Кроме того коммерческие источники предлагают очищенный внеклеточных белков, которые могут быть приобретены в мкг сумм, которых достаточно для генерации прочный протеина microarray библиотеки, учитывая небольшие требования к печати слайдов. Эти ограничения, несмотря на это, microarray technology предлагает большие преимущества, такие как минимальное потребление белка реагентов, быстрая индикация (новые ИЦП могут быть определены в течение одного дня) и доступного инструментария. Кроме того после того, как были созданы конструкций и условий очистки, мелких очищения может производить достаточно материала для подготовки тысяч массивов.
Наконец в некоторых случаях наблюдается относительно высокий фон, появляясь как привязки для многих белков на библиотеке microarray. Есть несколько факторов, которые могут повлиять на неспецифические привязки. Например некоторые белки могут быть весьма взимается, или взаимодействовать с углеводов, учет неспецифических фона через признание общих мотивов. Аналогично неспецифической привязки может также быть ввиду характера запроса белка, такие как например признание сиаловая кислота мотивы, нашли в нескольких других белков. Как microarray библиотеки расширения, это более вероятно, что общий список неспецифической вяжущих материалов может присутствовать. Таких неспецифических вяжущих можно определить по их поведение отслеживания на различных экранах против белков не связанных запросов. Желательно, чтобы сгенерировать список неспецифической вяжущих материалов на экранах, для улучшения конкретных хит призвание. В нашем случае мы обнаружили, что применение 5% среза (то есть, что белок помечен как неспецифический, если обнаружены как связыватель равен 5% или более не связанных запросов белка экранов) имеет важное значение для уменьшения ложных срабатываний. Следует отметить, что если основная цель анализов для запуска только несколько отдельных экранов, она не может быть целесообразным развивать статистический анализ. В этом случае оно не может быть возможным для выявления ложных срабатываний из-за ограниченного набора данных, и поэтому мы рекомендуем, что особый акцент делается на подтверждение хитов с помощью альтернативных методов.
Мы ожидаем, что внеклеточный протеин microarrays, особенно в сочетании с multimerization методов для обнаружения переходных рецептор лиганд взаимодействий, будет продолжать предлагать уникальную платформу для быстрой и надежной идентификации Роман ИЦП в внеклеточное пространство.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Б.х., S.R-R и N.M-M. Genentech работников и собственных акций в группе Genentech Inc./Рош.
Acknowledgments
Мы благодарим Philamer Calses и Юн Кобе за критически читать рукопись. Мы благодарны Рэнди иен за отличные технические консультации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
