Summary
Aquí, presentamos un protocolo de pantalla proteína extracelular microarrays para la identificación de las interacciones receptor-ligando novela en alto rendimiento. También se describe un método para mejorar la detección de interacciones proteína-proteína transitorias mediante el uso de complejos de proteína-microbead.
Abstract
Factores secretados, receptores de membrana atada y sus socios interactúan son los reguladores principales de la comunicación celular y la iniciación de cascadas de señalización durante la homeostasis y la enfermedad y como tal representan dianas terapéuticas principales. A pesar de su importancia, estas redes de interacción quedan significativamente subrepresentadas en las bases de datos actuales; por lo tanto, más proteínas extracelulares no tienen ningún socio obligatorio documentado. Esta discrepancia es sobre todo debido a los problemas relacionados con el estudio de las proteínas extracelulares, incluyendo la expresión de proteínas funcionales y la débil, baja afinidad, las interacciones de la proteína a menudo se establece entre receptores de superficie celular. El propósito de este método es describir la impresión de una librería de proteínas extracelulares en un formato de microarray para la detección de interacciones proteína-proteína. Para habilitar la detección de interacciones débiles, se describe un método basado en multimerization de la proteína de consulta bajo estudio. Junto a esta base del microbead multimerization para mayor multivalency, el microarray de proteínas permite la detección robusta de interacciones proteína-proteína transitorias en alto rendimiento. Este método ofrece un muestra rápida y de bajo consumo de enfoque para la identificación de nuevas interacciones aplicables a cualquier proteína extracelular. Impresión de microarrays de la proteína y el protocolo de detección se describen. Esta tecnología será útil para los investigadores que buscan un método robusto para el descubrimiento de las interacciones de la proteína en el espacio extracelular.
Introduction
El método revisado aquí describe la impresión de una colección de proteínas extracelulares en un formato de microarrays, seguido de un método para la detección de un objetivo de interés contra esta biblioteca. Hemos identificado proteínas multimerization como un paso crucial para la detección de interacciones caracterizados por afinidades de unión baja. Para mejorar la detección de estas interacciones, se describe un protocolo basado en multimerization de la proteína de consulta de interés utilizando microesferas.
Segregada y superficie expresan proteínas de la célula (colectivamente llamadas proteínas extracelulares) junto con sus socios de la interacción son reguladores claves de la comunicación celular, la señalización y la interacción con el microambiente. Por lo tanto, son esenciales en la regulación de muchos procesos fisiológicos y patológicos. Aproximadamente un cuarto del genoma humano (≈5, 000 proteínas) codifica para las proteínas extracelulares, que, dada su relevancia y accesibilidad a medicamentos sistemáticamente entregados, representan objetivos claves para el desarrollo de drogas1. Por lo tanto, proteínas extracelulares representan más del 70% de los objetivos de la proteína con acción farmacológica conocida de medicamentos aprobados en el mercado, conocido como el "proteoma druggable". A pesar de su importancia y abundancia, las redes de interacción (ePPI) proteína extracelular siendo muy subrepresentadas en las bases de datos disponibles. Esto es fundamentalmente debido a la complejidad bioquímica de las proteínas extracelulares, que impide su caracterización utilizando tecnologías más disponibles2. En primer lugar, las proteínas de membrana son difíciles de solubilizar, un proceso que implica a menudo las condiciones de lavado áspero y detergentes; en segundo lugar, proteínas extracelulares a menudo carecen de relevantes modificaciones post-traduccionales como glicosilación que están ausentes cuando estas proteínas se expresan en comúnmente utilizados sistemas heterólogos. Finalmente, las interacciones entre los receptores, tales como co receptores expresados en las células inmunes, suelen ser transitorios y caracterizado por afinidades muy bajo (KD en el ~ 1 μM a > rango μM 100). En conjunto, la naturaleza de estas proteínas y su enlace de socios hacen más ampliamente utilizado tecnologías como afinidad purificación/espectrometría de masas (AP/MS) o levadura-dos-híbrido, inadecuado para la detección de interacciones en el espacio extracelular 2 , 3.
En un esfuerzo por superar estos desafíos técnicos y acelerar el descubrimiento de nuevas interacciones de proteínas extracelulares, hemos desarrollado una cobertura alta proteína extracelular microarray4,5. Microarrays ofrecen la ventaja de generar superficies de alta densidad con pequeñas cantidades de muestra y son generalmente susceptibles a estudios de alto rendimiento. Estudios basados en microarrays de la proteína anteriormente han proporcionado penetraciones relevantes en las interacciones de la proteína para varios organismos modelo, aunque centrándose principalmente en interacciones citosólicas o proteína específica familias6,7, 8. Por el contrario, trabajo limitado se ha hecho para investigar las interacciones de la proteína extracelular utilizando esta tecnología. Hemos desarrollado un método de microarrays de proteínas para permitir estudios de ePPIs mediante la construcción de una biblioteca amplia y muy diversa de purificado proteínas secretadas y solo receptores transmembranales de (STM) expresan como recombinantes dominios extracelulares (ECD) fusionados a tags comunes para afinidad purificación4. El éxito de las pantallas de microarrays de la proteína depende en gran medida la creación de una biblioteca de proteína de alta calidad. Para la expresión de la proteína de la biblioteca y la consulta, células mamíferas o insectos fueron elegidos preferentemente como sistemas de expresión heteróloga, para asegurar la adecuada incorporación de modificaciones post-traduccionales como la glicosilación o disulfuro de bonos. SDS-PAGE, cromatografía por exclusión de tamaño y luz laser multi-angulo de dispersión son técnicas comúnmente utilizadas para evaluar la calidad de la proteína recombinante. La biblioteca de la proteína entonces es vista en diapositivas epoxysilane y almacenada a-20 ° C para uso a largo plazo. Concentraciones de proteína por encima de 0,4 mg/mL se recomiendan para el protocolo que se describe a continuación. Por lo tanto, baja expresando proteínas pueden requerir un paso de concentración antes de la impresión de la muestra y almacenamiento. Sin embargo, la principal ventaja de esta técnica es la escasa cantidad de proteína necesaria (50 μg de proteína es suficiente para llevar a cabo > 2.000 pantallas), junto con el consumo de proteínas de consulta mínima (20-25 μg por pantalla de duplicados). Utilizando el protocolo y el equipo descrito aquí, y siempre que las bibliotecas están disponibles, se pueden generar resultados para proteínas individuales de la consulta dentro de un día de trabajo.
Un desafío importante en la detección de interacciones de proteínas en el ambiente extracelular surge de su naturaleza característico débil o transitoria, que impide la identificación de metodologías más utilizadas. Aumentar la avidez de Unión grandemente mejora la sensibilidad para la detección de proteína débiles interacciones9,10,11. Basado en este principio se desarrolló un método para multimerize las proteínas de la consulta (expresadas como Fc fusión) usando proteína de granos recubiertos A4,5. Para evitar cualquier potencial inactivación de la proteína de la consulta por etiquetas al azar, en cambio etiqueta una irrelevante inmunoglobulina humana G con Cy5 y añadirlo junto con la proteína de la consulta a las perlas de proteína A, eliminando así cualquier artefactos debido a la conjugación directa de un colorante a la proteína de interés. Teniendo en cuenta las afinidades micromolar de varios pares de co-receptor, los complejos multivalentes mejoran relación señal a ruido, comparado con las proteínas de consulta de fusión Fc proyectadas como proteínas solubles4.
En Resumen, el objetivo de este protocolo es describir la preparación de microarray diapositivas que contiene una biblioteca de proteína extracelular preexistente para la identificación de las interacciones receptor-ligando. Repasamos los pasos para la diapositiva de la impresión, seguido de un protocolo para la detección de una proteína de interés contra la biblioteca de proteína extracelular. Por otra parte, se describe un método para la detección mejorada de ePPIs basados en microesferas para lograr mayor avidez de la proteína bajo estudio. La tecnología de microarrays de la proteína extracelular descrita aquí representa un enfoque rápido, robusto y eficaz para la investigación y detección de ePPI novela con baja proporción de falsos positivos y utilizando solamente cantidades de microgramos de la proteína de consulta bajo investigación. Esta tecnología ha impulsado varios estudios que han proporcionado penetraciones relevantes en funciones celulares desconocidas y vías de señalización para una variedad de receptores12,13, incluyendo virales immunoregulators14, y pueden ser utilizados para la orphanize cualquier proteína extracelular de interés.
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Protocol
1. generación de una biblioteca de extracelulares proteínas humanas
- Compilar una lista de receptores de superficie celular o proteínas secretadas de interés para la construcción de la biblioteca de microarrays de proteínas. Familias de proteínas específicas (por ejemplo, la superfamilia de las inmunoglobulinas) o proteínas selectivamente expresan en particular tipos pueden seleccionarse para el estudio de la célula.
- Para receptores de superficie celular, determinar los límites del dominio extracelular (ECD), identificando las regiones transmembranales utilizando herramientas de software y péptido señal. Algunas de las herramientas, libremente disponibles en línea, se hace referencia en la Tabla de materiales15,16,17,18.
- Sintetizar el DIT para los genes de interés y clon en el vector correspondiente. Proteínas secretadas o los receptores de ECD de STM fusionados a un número de etiquetas de afinidad común pueden ser purificados de los medios condicionados de células transfectadas con el vector adecuado, o de sistemas de expresión de células de insecto baculovirus.
Nota: Los sistemas basadas en células mamíferos (como HEK/293 células CHO) se recomiendan para maximizar la probabilidad de plegamiento de la proteína adecuada y además de las modificaciones postraduccionales como la glicosilación. - Purificar las proteínas mediante métodos de purificación de la afinidad estándar. Esfuerzos anteriores han descrito procedimientos automatizados o semi-automatizados adecuados para la purificación de cientos de proteínas, que se pueden escalar para generar el conjunto de proteínas de interés9,19,20, 21.
Nota: SDS-PAGE, cromatografía por exclusión de tamaño (S) o láser multi-angulo luz dispersa (centros comerciales) se recomienda para evaluar cualquier agregación no covalentes y para controlar la calidad de las preparaciones de proteínas. - Ajustar las proteínas a 200 o 400 μg/mL en la medida de lo posible y diluir las existencias con glicerol al 80% para el almacenamiento a largo plazo en viales criogénicos a-20 ° C. Estos representan acciones principales y deben accederse sólo cuando sea necesario.
- Transferir alícuotas de cada proteína (100 μL) para placas de 96 pocillos (chapa), sellar con hoja adhesiva y almacenar a-20 ° C hasta que la preparación de los portaobjetos de microarrays. Chapa se genera para reducir ciclos de congelación-descongelación y asegurar la estabilidad de la proteína.
2. impresión de microarrays de la proteína extracelular
- Utilice un microarrayer estándar para la impresión de la diapositiva. El instrumento utilizado para el protocolo descrito aquí tiene una capacidad de 57 diapositivas y correr y utiliza un cabezal de impresión con 48 pernos de localización. Estos pernos generar manchas de ~ 100 μm de diámetro separados por una distancia de punto a punto de ~ 350 μm y dibuja 0,25 μL por carga. Bajo esta configuración, hasta 8.000 puntos por diapositiva se pueden acomodar.
- Generar trabajo placas (placas bien 384, 10 μL de muestra/pozo) de la chapa. Realizar este paso manualmente antes de la impresión de diapositivas utilizando el microarrayer. Proteínas entonces, lugares con los pernos telescopio tipo pluma en epoxysilane se desliza en el 60% de humedad (para evitar deshidratación de las manchas de proteína).
Nota: Marcado con Cy3 albúmina de suero bovino (BSA) se pueden observar en los duplicados entre cada muestra de proteína (5 μg/mL de glicerol PBS/40%) para visualizar la matriz para el montaje de la máscara (ver sección 4). Si bien se recomienda, este paso es opcional. - Con posterioridad a la impresión, retire las diapositivas de microarrays de la proteína del ambiente humidificado y bloquean toda la noche con leche de 5% en SAFT para inactivar la superficie.
Nota: El método preferido es usar un nebulizador ultrasónico para generar una niebla fina de bloquear la solución que se instala sobre la superficie del portaobjetos. - Almacenar diapositivas a-20 ° C en glicerol al 50% para evitar la congelación.
3. preparación de complejos de cebo polivalente
Nota: Las interacciones entre las proteínas extracelulares se caracterizan a menudo por afinidades bajas. Para habilitar la detección de estas interacciones al aumentar la avidez de la Unión, un enfoque polivalente basado en capturar a la proteína de la consulta, expresada como Fc-tagged ECD, microesferas recubiertas A proteína fue desarrollada4.
- Marque el portador IgG utilizado para detección con tinte de monoreactive Cy5 y separar el tinte gratis utilizando columnas de desalación. Determinar el tinte a las relaciones de proteína mediante la medición de la absorbancia ULTRAVIOLETA a 280 y 650 nm.
Nota: Normalmente se utilizan proporciones de proteína-colorante entre 2.0 y 4.0. Se recomienda hacer girar los conjugados de Cy5 a 100.000 x g durante 15 min eliminar los posibles agregados solubles debido al proceso de etiquetado. - Determinar la relación óptima de proteína de microbead valoración de proteína contra una cantidad constante de la proteína de la consulta. El volumen mínimo de saturación de granos donde ninguna proteína gratis tagged Fc sigue siendo, como es medido usando un análisis competitivo determinado por interferometría de biocapa, se utiliza para la proyección.
- Formar los complejos de proteínas del microbead incubando la consulta tagged Fc y Cy5-IgG con microesferas de proteína A y la mezcla en un agitador de tubo en PBS durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz.
- Para formar estos complejos, utilizar la proteína de la consulta a una concentración final de 20 μg/mL. Para calcular la fracción molar de la proteína de la consulta y Cy5-IgG, dividir el peso molecular de la proteína de la consulta por el peso molecular de la IgG (150.000 Da) y multiplicar por 40 μg/mL para determinar la concentración de IgG de Cy5 necesario.
- Complementar las muestras con una (1 mg/mL) inmediatamente antes de la incubación con el microarray diapositivas (ver sección 4.2) para evitar atascamiento de cualquier proteína libre A los granos a la proteína de fusión Fc que puede estar presente en la matriz de proteína soluble.
Nota: El volumen de reacción final puede variar dependiendo de la cámara de incubación o estación de hibridación utilizada. La instrumentación que se describe en la Tabla de materiales permite la incubación de la muestra con volúmenes relativamente pequeños (~ 200 μL por portaobjetos).
4. extracelular proteína Microarray de detección y tratamiento.
Nota: Hay un número de fabricantes que ofrecen plataformas de procesamiento automático. Si no hay una estación de hibridación, los pasos siguientes pueden realizarse manualmente, asegurando que no hay suficiente volumen de tampón para mantener las diapositivas sumergido en todo momento.
- Caliente las diapositivas en temperatura ambiente y enjuagar con PBS/0.1% Tween 20 (SAFT) para eliminar el glicerol residual antes de la carga a la estación de hibridación.
- Utilizar el protocolo de investigación siguientes:
- Lavar con SAFT para 1 minuto.
- 200 μL de proteína 1 mg/mL en la leche PBS/5% de carga e incubar durante 30 min evitar la proteína de uncomplexed un microesferas de unión a las proteínas con etiqueta Fc que pueden estar presentes en el microarray.
- Lavar cinco veces con SAFT para 1 minuto.
- Carga 200 μL de la consulta: microbeads del complejo en presencia de proteína 1 mg/mL e incubar durante 30 min.
- Lavar con SAFT para 1 minuto.
- Después de la hibridación, enjuague los portaobjetos con agua, coloque en los tubos cónicos de 50 mL y seque girar a 900 x g durante 5 minutos.
- Por último, analizar las diapositivas con un escáner de microarreglos apropiado para detectar Cy3 (si ha sido impresa BSA-Cy3) y Cy5 fluorescencia por excitar en 532 y 635 nm, respectivamente.
- Realizar el análisis de los datos mediante el análisis de datos microarray que lo acompaña. La lista correspondiente de la matriz (como un archivo .gal) se carga en el software de extracción de datos. En esta etapa, se utilizan los puntos Cy3-BSA para encontrar bloques y utilice las opciones de ajuste automático en el software, seguido por la alineación manual de las funciones cuando sea necesario. Guardar los archivos como archivos de .gpr para su posterior análisis.
5. Análisis de datos
- Guardar los datos como archivos GPR y proceso en R usando el paquete limma, comúnmente utilizado para el análisis de microarray de datos4,5.
- Para el preprocesamiento, Fondo de corrección y normalización dentro de la diapositiva. Puesto que cada proteína es impreso en puntos duplicados, combinar ambas mediciones replicadas para crear una cuenta solo para la proteína en la biblioteca.
- Calcular puntuaciones para cada diapositiva y analizar los resultados para el cruce de candidatos alta puntuación entre las diapositivas.
- Utilice microarrays duplicados de diferentes tiradas para control de variabilidad de la diapositiva y parcelas de intersección que representa datos de dos pantallas llamar hits finales.
- Por último, realizar un nivel adicional de filtrado para excluir promiscuas proteínas dentro de la matriz. Estas carpetas no específicos son identificados como proteínas superior a un umbral específico frecuencia definida por el usuario a través de pantallas independientes.
Nota: Este protocolo se describe en detalle en Tom et al 20135. En nuestro caso la carpeta no específica llamada se basa en la determinación de la acumulativa presa tarifa de golpe, y se utiliza un umbral de eliminación basada en datos del 5%.
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Representative Results
Figura 1muestra un esquema del flujo de trabajo para la tecnología de microarrays de proteínas extracelulares. Una vez disponibles las diapositivas de microarrays que contiene la biblioteca de la proteína extracelular, la proyección de la proteína de interés y análisis de datos puede completarse en un día. Muchas interacciones fisiológicamente relevantes entre receptores de membrana integrado se caracterizan por fuerzas de enlace muy débil (KD en el rango micromolar). Para mejorar la detección de tales interacciones, se desarrolló un método basado en consulta multimerization de proteína (expresada como Fc la fusión) en la proteína A-microesferas. Este protocolo se describe en el texto, y un ejemplo representativo de la actuación de este enfoque para la detección mejorada de PPI se muestra en la figura 2.
Un ejemplo representativo de una pantalla de microarrays de la proteína se presenta en la figura 3. En el ejemplo mostrado, una proteína inmunomoduladora de adenovirus humano huérfano es proyectada para las interacciones contra una biblioteca conformada por más de 1.500 receptor ECD o secretado proteínas14. Como se describe, la ECD de la proteína viral es por vía recombinante expresada en una proteína de fusión Fc y luego se incubaron con microesferas recubiertas A la proteína para formar complejos multivalentes. Los complejos de proteína fueron defendidos con una estación de hibridación para reducir al mínimo las operaciones manuales, sin embargo, pantallas similares pueden realizarse utilizando una cámara de hibridación o dispositivos similares. Se aconseja ejecutar pantallas duplicadas usando las diapositivas impresas en funcionamientos telescopios separados para controlar cualquier variabilidad durante la tirada. La figura muestra las parcelas de intersección resultante de pantallas duplicadas, independiente. Las interacciones positivas y general fondo de diapositiva se visualizan fácilmente al análisis de las placas (Cy5 fluorescencia), facilitando la llamada golpe. Tenga en cuenta que se recomienda a cada receptor en la biblioteca de duplicados con el fin de aumentar la confianza de éxito. Para las proteínas de consulta de la mayoría, ninguno, se observan uno o pocos golpes, demostrando la especificidad del método para la detección de los IBP.
Ciertas proteínas consulta Mostrar fondo alta detectada por Unión a un número inusualmente elevado de proteínas dentro de la matriz o a la diapositiva. En nuestra experiencia, tales antecedentes no específicos se observan para sólo un pequeño número de proteínas. Diversos factores relativos a la naturaleza de la proteína podrían influir en las interacciones no específicas, tales como el reconocimiento de los motivos de la glicosilación. La figura 3 muestra un ejemplo de una proteína viral defendido contra la biblioteca de microarrays que mostraron alta fondo, imposibilitando la identificación de golpes específicos. Mientras que pequeñas modificaciones en el protocolo pueden ser considerados para disminuir el fondo (como sal aumento o concentración de detergente), en estos casos se recomienda explorar métodos alternativos de deorphanization de la proteína bajo estudio.
Figura 1: microarrays de la proteína extracelular para la identificación rápida y robusta de las interacciones receptor-ligando. (Paso 1) Una librería de proteínas extracelulares de interés está compilada. (Paso 2) Las proteínas purificadas se imprimen en las diapositivas de epoxysilane utilizando una impresora de microarrays y almacenadas a-20 ° C. (Paso 3) La consulta la proteína de interés es multimerized en microesferas de mayor avidez y detección de interacciones proteína-proteína transitorias. Una IgG fluorescente es complexed con la consulta: microbeads como soporte inerte de etiquetado. (Paso 4) Proyección para los socios de la Unión de una proteína de la consulta. El complejo de la proteína fluorescente consulta es defendido contra los microarrays de la proteína extracelular utilizando una estación de hibridación para el procesamiento automatizado de la diapositiva. (Paso 5) Diapositivas se visualizan después mediante un escáner de microarreglos. Los puntos de BSA-Cy3 pueden observarse en el canal de 535 nm y los golpes rendidos en la pantalla se observan como puntos duplicados en 635 nm. Análisis de los datos para llamar golpe se realizan mediante la creación de parcelas de intersección de dos experimentos independientes. Hits se llaman basados en puntuaciones mutuamente sobre el fondo, como se describe en la sección de protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: señal mejorada a través de la formación de multivalentes complejos de la proteína de la consulta. (A) Multimerization de proteínas de consulta. Consulta proteínas son expresadas como fusiones Fc recombinantes y acopladas a la proteína A microesferas para formar complejos multimerized. (B) alta avidez conduce a la detección de interacciones de baja afinidad. La avidez por resultados de proteína de la consulta multimerized en la estabilización de las interacciones débiles en el microarray de proteínas, conduce a mayor señal a proporción de ruido y mejorada llamada golpe. Parcelas muestra resultados para que CD200, proyectado como un microbead complejo, o una proteína soluble directamente marcado con Cy5 tinte permitir la visualización de los golpes. Multimerization (barras rojas) permite la detección robusta baja afinidad obligatoria del socio de la CD200R1, presente en la biblioteca de microarrays de proteínas, relación señal/ruido significativo en comparación con la misma proteína proyectada como un producto soluble (barras azules). Barras grises indican carpetas no específicos. Sólo las 10 interacciones superior han sido representadas en la parcela. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: proteína microarray tecnología para la identificación de interacciones virus-huésped de novela del receptor-receptor. (A) resultados de descubrimiento del receptor ejemplar para una proteína inmunomoduladora adenoviral huérfano. Imágenes representan análisis de microarrays reales, mostrando éxitos de proteínas en duplicados (rojo). Ensayos se realizan por duplicado para controlar cualquier diapositiva variabilidad y los resultados representados como parcelas de intersección. En las parcelas, los puntos rojo y azul representan éxitos llamados solamente en la repetición de un arreglo de discos, mientras que los puntos negros representan hits intersección de dos pistas independientes. La biblioteca de microarray todo está impreso en dos diapositivas para facilidad de uso, dada la cantidad de proteínas presentes en la colección y para asegurar la suficiente separación para cada proteína individual en la matriz. (B) pantalla de proteína Viral exponiendo alto fondo que impide golpea llamadas. Ciertas proteínas de consulta pueden mostrar fondo alta, que al unirse a múltiples proteínas o las diapositivas, por lo tanto plantea retos para la identificación de aciertos puntuación alta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un número significativo de receptores huérfanos permanece en el genoma humano, y nuevos socios interactúan siguen apareciendo para proteínas extracelulares con ligandos previamente caracterizados. Definición de las interacciones ligando-receptor en humanos y organismos modelo es esencial para comprender los mecanismos que determinan la comunicación celular durante la homeostasis, así como desregulación conduce a la enfermedad y por lo tanto informar de nuevos o mejorados opciones terapéuticas. Sin embargo, la detección de interacciones proteína extracelular por tecnologías ampliamente utilizadas ha representado un obstáculo importante debido principalmente a los desafíos técnicos asociados a la bioquímica de los receptores celulares y sus socios de la interacción. En este informe describimos el uso de una proteína extracelular microarray para la detección de proteínas de consulta de interés, con énfasis en la utilización de complejos del microbead para detección mejorada de los IBP.
Sondear las interacciones receptor-receptor es particularmente desafiante, como muchas parejas fisiológicamente relevantes se caracterizaron por interacción débil muy vinculantes las afinidades en el rango micromolar2,3. Mejora de la avidez por multimerization ha demostrado para ser una estrategia útil para aumentar la sensibilidad para detección de baja afinidad los IBP. Hemos desarrollado un método basado en la proteína de fusión Fc, para la eficiente formación de multivalentes en proteínas del microbead consulta complejos4. Multimerization de la proteína de la consulta es un paso clave para detección de baja afinidad los IBP. Como se muestra en el ejemplo en la figura 2, este método mejora significativamente la señal en comparación con la misma proteína consulta proyectada como un analito (no complejado) soluble, conservando un mínimo fondo. Alternativamente, las pantallas de microarrays de proteínas pueden realizarse con la proteína soluble consulta marcado con Cy5, un enfoque que es compatible con cualquier etiqueta de fusión y que puede ser suficiente para la identificación de las interacciones más estables, mayor afinidad, tales como entre algunos ligandos solubles y sus receptores. Cabe señalar que, debido a la avidez se incrementa a través de multimerization de la consulta en microesferas, la señal de microarray no es una medida cuantitativa de la fuerza de interacción. Más bien, las afinidades de enlace se calculará con las versiones monoméricas de las proteínas bajo evaluación. Además, es altamente recomendable que cualquier hits identificados a través de la tecnología de microarrays se validan a través de métodos independientes. Rutinariamente utilizamos resonancia de plasmón superficial como un método biofísico del patrón oro para los estudios de IBP y medición de la cinética de Unión.
Aunque fuera del alcance de este informe, cabe señalar que el éxito de cualquier esfuerzo de investigación usando la tecnología de microarrays pesadamente se basa en la selección y la disponibilidad de una biblioteca de proteína de alta calidad. Criterios relevantes para la selección de proteínas extracelulares han sido previamente publicados4,22. Una serie de herramientas útiles para la predicción de características relevantes de la proteína (como hélices transmembranales o péptidos de señal) está libremente disponible en línea, incluyendo los siguientes servidores: SignalP15TMHMM16, Phobious17y TOPCONS 18. métodos excelentes papeles que describe métodos de purificación de la afinidad están disponibles en otros lugares. Cabe también mencionar que la generación de biblioteca de proteína de microarray se basa en la producción de proteína ECDs como productos recombinantes solubles, y por lo tanto, este enfoque permite estudios de tipo I, tipo II y células GPI anclado receptores de superficie y secretada proteínas, pero no es generalmente conveniente para el multitransmembrane que contiene proteínas como receptores acoplados a proteína G. La purificación de cientos de proteínas como proteínas recombinantes solubles exige esfuerzos logísticos significativos y pueden ser recursos muy - y desperdiciador de tiempo. Sin embargo, con los costos disminución de síntesis de genes y mayor rendimiento de los sistemas de purificación de proteínas, generación de biblioteca ahora es relativamente más rápido y más económico. Por otra parte, fuentes comerciales ofrecen purificadas proteínas extracelulares que pueden adquirirse en cantidades de microgramos, que es suficiente para la generación de una biblioteca de microarray de proteína durable los pequeños requisitos para la impresión de la diapositiva. Estas limitaciones no obstante, la tecnología de microarrays ofrece grandes ventajas tales como un consumo mínimo de reactivo de proteína, instrumentación asequible y rápida lectura (nuevo IBP pueden identificarse dentro de un día). Además, una vez que se han establecido las condiciones de depuración y construcciones, purificaciones en pequeña escala pueden producir suficiente material para preparar miles de matrices.
Finalmente, en algunos casos, se observa fondo relativamente alta, que aparece como enlace a muchas proteínas en la biblioteca de microarrays. Hay múltiples factores que podrían influir en fijación no específica. Por ejemplo, algunas proteínas pueden ser altamente cargadas, o interactúan con hidratos de carbono, contabilidad para el fondo no específico vía reconocimiento de motivos comunes. Semejantemente, Unión no específica puede también debido a la naturaleza de la proteína de la consulta, como por ejemplo reconocimiento de motivos de ácido siálico, encontrarse en varias otras proteínas. Como amplían las bibliotecas de microarrays, es más probable que una lista común de aglutinantes no específicos puede estar presente. Estas carpetas no específicos pueden identificarse mediante el seguimiento de su comportamiento a través de varias pantallas contra las proteínas de la consulta sin relación. Es recomendable generar una lista de carpetas no específico a través de pantallas, para mejorar la llamada golpe específico. En nuestro caso, hemos encontrado que aplicando un límite de 5% (es decir, una proteína está marcada como no específico si detecta como binder es 5% o más de las pantallas de consulta sin relación proteína) es importante reducir falsos positivos. Cabe señalar que si el propósito principal de las pruebas es realizar sólo unas pocas pantallas seleccionadas, puede no ser vale la pena desarrollar un análisis estadístico. En este caso, no puede ser factible detectar falsos positivos debido a un limitado conjunto de datos, y por lo tanto recomendamos que hace especial hincapié en la confirmación de los golpes mediante métodos alternativos.
Anticipamos que los microarrays de la proteína extracelular, especialmente en combinación con multimerization métodos para la detección de interacciones ligando-receptor transitorio, continuará ofreciendo una plataforma única para la identificación rápida y robusta de novela PPI en el espacio extracelular.
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Disclosures
B.H., S.R-R y M N.M. son empleados de Genentech y acciones propias en el grupo de Genentech Inc./Roche.
Acknowledgments
Agradecemos a Philamer Calses y Kobe Yuen para leer críticamente el manuscrito. Estamos agradecidos a Randy yenes para asesoramiento técnico excelente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
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