Summary
Ici, nous présentons un protocole de suppression d'exon23 basé cas9 pour reconstituer l'expression de dystrophine dans l'iPSC des fibroblastes de peau souris-dérivés de Dmd et différencient directement des iPSC en cellules myogènes de progéniture (MPC) utilisant le système d'activation de Tet-on MyoD.
Abstract
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire progressive grave provoquée par des mutations dans le gène de dystrophine, qui mène finalement à l'épuisement des cellules progénitrices de muscle. L'édition génétique de 9 (CRISPR/Cas9) a le potentiel de restaurer l'expression du gène de la dystrophine. Les cellules progénitrices musculaires induites autologues (iPSC) dérivées de cellules musculaires (MPC) peuvent reconstituer la piscine de cellules souches/progénitrices, réparer les dommages et prévenir d'autres complications dans la DMD sans provoquer de réponse immunitaire. Dans cette étude, nous introduisons une combinaison de technologies CRISPR/Cas9 et iPSC non intégrées pour obtenir des progéniteurs musculaires avec l'expression récupérée de protéine de dystrophine. En bref, nous utilisons un vecteur Sendai non-intégration pour établir une ligne iPSC à partir de fibroblastes dermiques de souris Dmdmdx. Nous utilisons ensuite la stratégie de suppression CRISPR/Cas9 pour restaurer l'expression de la dystrophine par une jointure non-homologue du gène recadré de dystrophine. Après la validation de PCR de l'épuisement d'exon23 dans trois colonies de 94 colonies choisies d'iPSC, nous différencions iPSC en MPC par l'expression doxycycline (Dox)-induite de MyoD, un facteur de transcription clé jouant un rôle significatif en réglant la différenciation de muscle. Nos résultats montrent la faisabilité d'utiliser la stratégie de suppression CRISPR/Cas9 pour restaurer l'expression de la dystrophine dans le MPC dérivé de l'iPSC, qui a un potentiel important pour développer de futures thérapies pour le traitement de la DMD.
Introduction
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est l'une des dystrophies musculaires les plus communes et se caractérise par l'absence de dystrophine, affectant 1 des quelque 5 000 garçons nouveau-nés dans le monde1. La perte de la fonction de gène de dystrophine a comme conséquence des défauts structurels de muscle menant à la dégénérescence progressive de myofibers1,2. Le système de thérapie génique à médiation adéno-associée (rAAV) a été testé pour restaurer l'expression de la dystrophine et améliorer la fonction musculaire, comme le remplacement des gènes à l'aide de micro-dystrophines(Dys). Cependant, l'approche rAAV nécessite des injections répétées pour soutenir l'expression de la protéine fonctionnelle3,4. Par conséquent, nous avons besoin d'une stratégie qui peut fournir l'expression efficace et permanente de gène de dystrophine dans les patients présentant Le DMD. La souris Dmdmdx, un modèle de souris pour DMD, a une mutation de point dans l'exon 23 du gène de dystrophine qui introduit un codon prématuré de terminaison et a comme conséquence une protéine tronquée non fonctionnelle manquant du domaine de liaison de Dystroglycan C-terminal. Des études récentes ont démontré l'utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 pour restaurer l'expression du gène de la dystrophine par correction génétique précise ou suppression d'exon mutant chez les petits et grands animaux5,6,7. Long et coll.8 ont rapporté la méthode pour corriger la mutation du gène de la dystrophine dans la lignée germinale de souris Dmdmdx par réparation dirigée par homologie (HDR) basée sur l'édition du génome CRISPR/Cas9. El Refaey et coll.9 ont rapporté que le rAAV pouvait exciser efficacement l'exon 23 mutant chez les souris dystrophiques. Dans ces études, les gRNAs ont été conçus dans les introns 20 et 23 pour causer des ruptures d'ADN à double brin, qui ont partiellement restauré l'expression de dystrophine après réparation d'ADN par l'intermédiaire de jointure de fin non-homologue (NHEJ). Encore plus excitant, Amoasii et coll.10 ont récemment signalé l'efficacité et la faisabilité de l'édition du gène CRISPR par le rAAV dans la restauration de l'expression de la dystrophine dans les modèles canins, une étape essentielle dans l'application clinique future.
DMD provoque également des troubles des cellules souches11. Pour les dommages musculaires, les cellules souches musculaires résidentielles réapprovisionnent les cellules musculaires mourantes après la différenciation musculaire. Cependant, les cycles consécutifs de blessures et de réparation conduisent à un raccourcissement des télomères dans les cellules souches musculaires12, et l'épuisement prématuré des piscines de cellules souches13,14. Par conséquent, une combinaison de thérapie autologue de cellules souches avec l'édition de génome pour reconstituer l'expression de dystrophine peut être une approche pratique pour traiter DMD. La technologie CRISPR/Cas9 offre la possibilité de générer des cellules souches pluripotentes induites induites génétiquement corrigées autologues (iPSC) pour la régénération fonctionnelle des muscles et prévenir d'autres complications de la DMD sans provoquer de rejet immunitaire. Cependant, les iPSC ont un risque de formation de tumeur, qui pourrait être allégé par la différenciation de l'iPSC en cellules progénitrices myogéniques.
Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation du virus Sendai non-intégration pour reprogrammer les fibroblastes dermiques des souris dmdmdx en iPSCs et récupérons ensuite l'expression de dystrophine par suppression de génome de CRISPR/Cas9. Après validation de la suppression d'Exon23 dans l'iPSC par génotypage, nous avons différencié l'iPSC genome-corrected en progéniteurs myogéniques (MPC) par la différenciation myogène MyoD-induite.
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Protocol
Toutes les interventions chirurgicales et de manipulation des animaux ont été effectuées par un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université d'Augusta (IACUC). Les souris ont été alimentées régime standard et l'eau ad libitum.
1. Isolement des fibroblastes primaires de souris des souris adultes de Dmdmdx
- Euthanasier les souris adultes Dmdmdx (mâle, 2 mois) par asphyxie co2 et thoracotomie selon l'IACUC approuvé par Medical College of Georgia, Université d'Augusta. Couper la queue avec un scalpel stérile dans un état stérile sous le capot laminaire. Rincer la queue avec 70 % d'éthanol pendant 5 min, puis laver à l'œil de salin stérilisé tamponné par le phosphate (PBS) dans un plat de 6 cm.
- Peler la peau de la queue par une incision pointue de la base à l'extrémité de la queue le long de la peau de la queue, puis décoller délicatement la peau de la queue avec une pince à épiler. Émincer la peau à une taille de 1 mm3 à l'aide d'un scalpel stérile et déplacer le tissu cutané haché à un plat de 6 cm dans le milieu essentiel minimal de Dulbecco / F12 Ham (DMEM/ F12) contenant 0,1% de collagène IV et 1 U/mL de dispase.
- Diger le tissu cutané dans un plat de culture pendant 2 h à 37 oC dans un incubateur de CO2 à 5 %.
- Enrober une plaque de 6 puits de fibronectin et de 0,2 % de gélatine (1 ml de fibronectin dans 199 mL de gélatine de 0,2 %; Tableau des matériaux) et incuber à 37 oC pendant 1 h.
- Dissocier le tissu cutané digéré avec une pointe de tuyauterie de 1 ml et transférer le tissu et le supernatant dans un tube conique stérile de centrifugeuse de 15 ml. Centrifugeuse à 217 x g pendant 3 min à température ambiante, jetez le supernatant et suspendez la pastille dans 1,5 ml de fibroblaste moyen(Tableau des matériaux).
- Culture les granulés, y compris les tissus de la peau digérés incomplets à partir de l'étape 1.5 sur la plaque de 6 puits enduit de fibronectine et 0,2% de gélatine à partir de l'étape 1.4 dans un 37 oC, 5% CO2 incubateur. Remplacer le milieu 24 h après le placage initial pour enlever les cellules non attachées, et changer le milieu tous les 48 h.
2. Reprogrammer les fibroblastes de peau de souris en iPSCs
- Deux jours avant la transduction, digérez les fibroblastes dermiques de souris à partir de l'étape 1.6 avec la solution de détachement cellulaire(tableau des matériaux)dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 pendant 5 min.
- Compter les cellules à l'aide d'un hemacytomètre et d'une centrifugeuse à 217 x g pendant 3 min.
- Cellules de graines à une densité de 1 à 2 x 105 cellules par puits sur une plaque de 6 puits et la culture avec le milieu de fibroblaste (Tableau des matériaux) dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5% CO2.
- Le jour de la transduction (jour 0), estimez les cellules et calculez le volume de chaque virus nécessaire pour atteindre la multiplicité cible de l'infection (MOI) de 5, 5 et 3 (c.-à-d., KOS MOI 5, hc-Myc MOI 5, hKlf4 MOI 3) selon le manuel commercial.
- Décongeler trois tubes sendai dans un bain d'eau de 37 oC pour 5 à 10 s et ajouter les volumes calculés de chacun des trois tubes sendai à 1 ml de fibroblaste moyen(Tableau des matériaux).
- Retirez le milieu fibroblaste de l'étape 2.3 et ajoutez le mélange de virus de reprogrammation aux puits contenant les cellules. Incuber les cellules toute la nuit dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2.
- Remplacer le milieu par un fibroblaste frais moyen 24 h après la transduction. Culture des cellules pendant une semaine avec échange moyen tous les deux jours.
- Récoltez les fibroblastes infectés par la souris le jour 7 après la transduction avec 0,05 % de trypsine/EDTA et placez-les sur des plats qui sont auparavant recouverts de fibronectin et de gélatine de 0,2 %.
- Culture les fibroblastes infectés de souris à partir de l'étape 2.6 avec le milieu de croissance embryonnaire complet de cellules souches de souris (ES) (tableau des matériaux) dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5% CO2 et changer moyen par jour.
- À partir du 8ème jour, observez la plaque sous un microscope inversé tous les deux jours pour identifier l'apparition des amas cellulaires avec la morphologie de la souris ES.
3. Utilisation de la cytométrie de la tache et du débit vivant de phosphatase alcalin pour quantifier l'efficacité de la reprogrammation
- Retirez les supports de culture de chaque puits et rincez-le avec le DMEM/F-12 pendant 2 à 3 min.
- Appliquer 2 ml de 1x sauce alcaline phosphatase (AP) solution de travail des taches vivantes (1:500 dilution dans DMEM/F-12) sur les cellules adhérentes, et couver dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5% CO2 pendant 30 min.
- Aspirez la tache ap en direct et lavez-les deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
- Diger les cellules avec la solution de détachement cellulaire (Table des matériaux) dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 pendant 5 min. Effectuer la cytométrie du débit pour déterminer l'efficacité de la reprogrammation.
4. Sélection et récolte de cellules de la même sien
- Examiner les colonies à partir de l'étape 2.8 sous un microscope inversé.
- Marquez les colonies au fond du plat avec un marqueur d'objet auto-inking.
- Appliquer les anneaux de clonage graissés pour couvrir les colonies cellulaires marquées. Ajouter 100 oL de 0,05 % de trypsine/EDTA à chaque anneau de clonage à 37 oC pendant 5 min, puis transférer les cellules digérées avec des pointes de pipette de 100 l sur des plaques de culture de 48 puits contenant un milieu de croissance mES.
- Incuber les cellules dans des plaques de culture de 48 puits dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2. Passer les cellules à 6 cm plat quand ils atteignent 70% confluence.
- Répétez les étapes 4.3 et 4.4 plusieurs fois jusqu'à ce que des clones uniformes en forme de dortoir soient obtenus.
5. Congélation des iPSC pour la cryoconservation
- Dissocier les iPSC sélectionnés de l'étape 4.5 avec la trypsine, le verset, et le plasma de poussin (TVP ; Tableau des matériaux) solution à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 % pendant 30 min.
- Recueillir les cellules dans un tube conique stérile de 15 ml et une centrifugeuse à 217 x g pendant 3 min à température ambiante.
- Aspirer le supernatant et re-suspendre le granule de cellules dans 2 ml de souris ES milieu congelé (Tableau des matériaux) pour obtenir 1 ml par cryovial.
- Ajouter les cellules aux cryovials et congeler à l'aide d'un contenant de congélation qui fournit le taux critique et répété de refroidissement de -1 oC/min requis pour la cryoconservation à -80 oC pendant la nuit.
- Transférer les flacons congelés dans un réservoir d'azote liquide.
6. Coloration immunofluorescence pour les marqueurs de cellules souches dans les iPSC
- Les iPSC de semence s'agitent de l'étape 5.1 cultivées avec le milieu mES dans un toboggan de chambre de 8 puits recouvert de poly-D-lysine/laminine (Tableau des matériaux) à la densité appropriée pour atteindre entre 1-2 x 104 cellules par puits et couver dans un incubateur de 37 oC avec un atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 pendant 48 h.
- Immerger les lames dans 4 % de formaldéhyde pendant 15 min à température ambiante, puis les glisser deux fois en PBS pendant 5 min à chaque fois.
- Incuber les sections avec un réactif de blocage IgG souris (Table des matériaux), et 5% sérum de chèvre pendant 1 h à température ambiante.
- Diluer les anticorps primaires dans le diluant protéique (souris-anti-SSEA1, 1:100, lapin-anti-Nanog, 1:500; lapin-anti-POU classe 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; lapin-anti-SRY-box 2 [SOX2], 1:500; lapin-anti-Lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400) (Tableau de Matériaux). Appliquer les anticorps sur les cellules et incuber à 4 oC pendant la nuit dans une chambre humidifiée.
- Jetez la solution d'anticorps primaire et lavez les diapositives 3x dans PBS.
- Appliquer des deuxièmes anticorps (anticorps anti-souris de chèvre alexa488 et anti-lapin conjugué alexa555, 1:400 chacun) dans le diluant protéique M.O.M. sur les toboggans et incubependant 45 min à température ambiante.
- Laver les diapositives 3x en PBS et monter les sections avec le support de montage contenant 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Prenez des photos avec un microscope confocal.
7. Enquêter sur la pluripotence des iPSC in vivo
- Dissocier les iPSC de l'étape 5.1 en cellules simples à l'aide d'une solution TVP dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 pendant 30 min.
- Compter les cellules à l'aide d'un hemacytomètre et d'une centrifugeuse à 217 x g pendant 3 min.
- Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille avec le milieu de mES dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 ml à une concentration de 5 x 105 cellules/30 l pour la transplantation cellulaire.
- Enlever les cheveux des deux membres postérieurs des souris immunodéficientes à l'aide de tondeuses à cheveux.
- Anesthésiez les souris à la kétamine (100 mg/kg) et nettoyez le site d'injection avec 75 % d'alcool.
- Injecter 30 L de suspension iPSC de l'étape 7.3 intramusculairement dans le gastrocnemii, à l'aide d'une aiguille de 31 G.
- Deux semaines après l'injection, récolter la souris gastrocnemii et intégrer dans la température de coupe optimale (OCT) composé, congeler et couper en sections de 5 m15,16.
- Fixer les sections dans 4 % de formaldéhyde pendant 15 min à température ambiante, puis laver les lames deux fois en PBS pendant 5 min à chaque fois.
- Bloquer les cellules avec 5% de diluant de protéines de sérum de chèvre pendant 1 h à température ambiante.
- Ajouter l'anticorps primaire dilué (lapin anti-AFP, 1:50; lapin anti-SMA, 1:50; lapin anti-TH, 1:50) aux toboggans et incuber à 4 oC pendant la nuit dans une chambre humidifiée.
- Jetez la solution d'anticorps primaire, lavez les cellules 3x (5 min/lavage) en PBS, ajoutez un anticorps de chèvre-anti-lapin dilué de 1:400 Alexa555 aux glissières, et incubez pendant 45 min à température ambiante.
- Laver les glissières 3x (5 min/lavage) en PBS, et monter les sections avec le support de montage contenant DAPI.
8. Construction d'un vecteur lentiviral CRISPR/Cas9 ciblant les introns flanquant la dystrophine exon 23
- Concevoir deux paires d'oligos gRNA ciblant la dystrophine intron-flanked exon 23 par http://crispor.tefor.net/crispor.py.
REMARQUE : Les paires conçues sont les suivantes :
i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3'
i22anti-sens: 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3'
i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTTTT- 3'
i23anti-sens: 5'-AAACAGAAGGTATCACATTACTC-3'). - Digest et déphosphorylate 5 g de plasmide CRISPR lentiviral (lenti-CRISPRv2-blast [un cadeau de Mohan Babu] et lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [un cadeau de Kristen Brennand]) (Table of Materials) avec BsmB1/Esp3I pour 30 min à 37 oC. Pour 5 g de plasmides, ajouter 3 l de BsmB1 à limiter l'enzyme, 3 l de phosphatase alcaline rapide, 6 l de tampon de digestion enzymatique 10x et 0,6 L de 100 mL de DTT en 60 degrés de réaction).
- Chargez les réactions sur un gel agarose de 0,8%. Exécuter le gel à 100'150 V pendant 30 min.
- Purifez le plasmide digéré en gel à l'aide d'un kit d'extraction de gel (Table of Materials) et elute en 20 oL de H2O.
- Phosphorylate et anneal chaque paire d'oligonucléotides gRNA contenant 1 L de chaque oligonucléotide à 100 M, 1 l de tampon de ligature T4 de 10x, 0,5 oL de t4 polynucléotide kinase (PNK), 6,5 l de ddH2O à 37 oC pendant 30 min, puis 95 oC pendant 5 min, puis rampe d à 25 oC à 5 oC/min.
- Ligate une dilution 1:200 des oligonucléotides de gRNA annealed dans le plentiCRISPR V2-Blast ou plentiGuide-Hygro-iRFP670. Mélanger 50 ng de vecteurs digérés BsmB1/Esp3I avec 1 l de duplex oligo dilué et 5 l de tampon de 2x ligase plus 1 an de ligase dans un système de réaction de 11 L et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Effectuer la transformation avec 3 L de produit de ligature en 50 cellules compétentes L (Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
- Étendre les cellules compétentes transformées dans une plaque d'agar avec 100 'g/mL de carbenicilline et incuber à 31,5 oC pendant 18 h.
- Choisissez des colonies avec des pointes et une culture de pipette stériles de 10 ll dans 5 ml de bouillon formidable (Table of Materials) contenant 100 og/mL de carbenicilline à 31,5 oC, 185 tr/min dans un incubateur shaker pendant 21 h.
- Purifier l'ADN plasmide à l'aide des kits de mini-préparation et midi-préparation (Table des Matériaux).
- Vérifier les plasmides mini-préparation par la digestion de restriction. Pour le système de réaction de 20 L, ajouter 1 g d'ADN plasmide, 2 l de tampon de réaction digeste (Tableau des matériaux) et 1 L de mélange d'enzymes de restriction (0,5 L de KpnI-HF et 0,5 L d'AgeI-HF pour plentiCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 l de NotI-HF et 0,5 l d'EcoRI-HF pour le plentiCRISP-HF pour l'EcoRI-HF pour le plentiCRISP-HF pour le plentiCRISP-HF pour l'EcoRI-HF pour le plentiCRISP-HF pour le plentiCRISP-HF plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Incuber le système de réaction pendant 1 h à 37 oC.
- Chargez les réactions sur un gel agarose de 0,8%. Exécuter le gel à 100'150 V pendant 30 min.
REMARQUE: Les bandes correctes pour plentiCRISPR V2-Blast-i22 devrait être 622 bp et 12,2 kb, et les bandes correctes pour plentiGuide-Hygro-iRFP670- i23 devrait être 2,6 kb et 7,1 kb.
9. Emballage vectoriel lentiviral
- Culture 7 x 105 293FT cellules dans 5 ml de médias DMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal dans un plat de 6 cm pendant la nuit à 37 oC, 5% CO2.
- Préparer un cocktail (1 g de plentiCRISPR V2-Blast-i22 ou plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng de plasmide d'emballage psPAX2, 250 ng de plasmide enveloppe pMD2.G, et 5 l de réagent de transfection A [Table of Materials] en 100 'L de sérum réduit MEM media).
- Préparer un mélange de 5 l de réactif de transfection B (Tableau des matériaux) dans 100 'L de sérum réduit MEM media.
- Ajouter 100 ll de mélange de réactif B de transfection au mélange de plasmide à partir de l'étape 9.2 et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Ajoutez le complexe ADN-lipidique (à partir de l'étape 9.4) goutte à goutte aux cellules 293FT. Incuber toute la nuit à 37 oC avec 5 % de CO2.
- Ajouter l'améliorateur de production de virus (500x) (Tableau des matériaux) à chaque plat le lendemain et incuber pendant 24 h à 37 oC, 5 % CO2.
- Recueillir le milieu des cellules à l'aide de pipettes sur les deux prochains jours et filtrer le milieu à travers un filtre de 0,45 m pour enlever les cellules.
10. Concentration et purification des vecteurs lentiviraux
- Précipitez le vecteur lentiviral au milieu de l'étape 9,7 pendant la nuit à 4 oC avec 5 x polyéthylène glycol 4000 (PEG4000, concentration finale de 8,5 %) et 4 M NaCl (concentration finale de 0,4 M).
- Centrifuger le média viral contenant la solution PEG4000 à 2 095 x g et 4 oC pendant 30 min, retirez et jetez le supernatant.
- Resuspendre les granulés avec 500 ll de sérum réduit meM media (lentivirus titer: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 x 108, lenti-iRFP670-gRNAi23: 1.3 x 108, lenti-CRISPR V2-contrôle: 3.13 x 107, lenti-iRFP670-control: 5.9 x 107 ). Conserver à -80 oC jusqu'à utilisation.
11. Suppression de l'exon 23 dans les iPSC souris avec deux ARN guides (gRNAs) couplés avec Cas9
- Plaquer les iPSC de souris à partir de l'étape 4.5 dans une plaque de 24 puits recouverte de fibronectine et de gélatine.
- Une fois que les cellules atteignent 50 % de confluence, passez au milieu de culture frais (milieu de croissance embryonnaire complète des cellules souches de souris) contenant 8 polybrenes g/mL).
- Ajoutez 100 L de la solution de particules lentivirales de l'étape 10.3 incluant lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 et contrôle (vecteur vide : lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) aux iPSC de souris. Incuber les cellules pendant 3 jours à 37 oC avec 5 % de CO2.
- Sélectionnez les cellules infectées de façon stable avec des supports contenant 2,5 g/mL de blasticidin et 100 'g/mL d'hygromycine B en déterminant la concentration minimale de blasticidin et d'hygromycine B nécessaire pour tuer la cellule non infectée.
REMARQUE : Les cellules non infectées seraient tuées par la blasticicine et l'hygromycine B. - Diger les iPSC de souris sélectionnées avec 0,5 ml de solution TVP chaque puits (24-bien plaque) et incuber les cellules pendant 30 min à 37 oC avec 5% CO2.
- Dissocier les iPSC en cellules simples par pipetting, compter les cellules avec une chambre de comptage cellulaire, puis diluer environ 150 cellules simples digérées avec mES milieu en 10 cm plat pour la culture à 37 oC avec 5% CO2.
- Après environ 10 jours, choisissez des colonies individuelles au microscope inversé à l'aide de 10 pointes de pipette stériles ll (96 colonies doivent être cueillies).
- Transférer les colonies cueillies dans 50 oL de solution TVP chaque puits (96 puits, une colonie chacun puits), digérer à 37 oC pendant 30 min, puis ensemencer les cellules digérées en deux plaques de culture de 96 puits pour conserver la culture (une pour le génotypage).
- Incuber dans un incubateur de CO2 à 37 oC jusqu'à 70 % de confluents.
12. Identification des colonies iPSC avec suppression exon23
- Retirez le milieu dans une plaque de 96 puits lorsque les colonies cellulaires atteignent 70 % de confluence.
- Ajouter 25 l de réactif de lyse(Tableau des matériaux)contenant la solution Protéase K (1 ml de protéase K dans 100 ml de réactif de lyse) à chaque puits, et transférer le lysate dans une plaque PCR de 96 puits.
- Sceller la plaque PCR et incuber les plaques à 55 oC pendant 30 min, puis à 95 oC pendant 45 min pour lyser les cellules et dénaturer la protéinase K.
- Effectuer la réaction PCR avec 2 ll de lysate à partir de l'étape 12.3. Pour la réaction PCR de 20 L, ajouter 2 l de lysate, 10 l de 2x adhérence de polymérase d'ADN (Tableau des matériaux), 7 l d'eau sans DNase, et 1 l d'amorces d'exon 23 DMD (tableau 1).
- Utilisez les paramètres suivants pour la réaction de PCR : 98 oC pour 1 min, 35 cycles de 98 oC pour 10 s, 60 oC pour 15 s, 72 oC pour 30 s, et une extension finale à 72 oC pour 1 min.
- Chargez la réaction PCR sur un gel agarose de 2%. Exécuter le gel à 100'150 V pendant 30 min.
- Inspectez le gel sous la lumière UV (l'efficacité knock-out est 3/94).
13. Utilisation du système d'activation Tet-on MyoD pour différencier directement l'iPSC en cellules progénitrices myogéniques (MPC)
- Emballez le LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 et LV-TRE-VP16 souris MyoD-T2A-dsRedExpress2 (un cadeau de Charles Gersbach) (Table of Materials) tel que décrit précédemment pour lenti-CRISPRv2-blast et lenti-gRNA-iRFP670 vecteurs dans les sections 9 et 10.
- Infecter la souris iPSC avec lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 ou lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 tel que décrit précédemment pour lenti-CRISPRv2-blast et lenti-gRNA-iRFP670 vectors in steps 11.1-11.3.
- Sélectionnez les cellules dont la puromycine est de 1 g/mL après trois jours d'infection afin d'obtenir une population cellulaire transductrice pure.
- Ajoutez 3 doxycyclinedes de 3 g/mL dans les médias culturels (10 % de DMEM FBS) à la différenciation MPC. Remplacer le milieu frais complété par de la doxycycline tous les deux jours.
14. Transcription inversée quantitative PCR pour évaluer la différenciation musculaire dynamique et l'expression d'exon DMD 22-24
- Extraire l'ARN cellulaire après 0, 3, 6, et 10 jours après traitement de doxycycline utilisant le réactif d'isolement d'ARN, transcrivent inversement l'ARN dans le cDNA en utilisant le premier kit de synthèse de cDNA de brin (tableau des matériaux).
- Pour le système de réaction qPCR de 20 L, ajouter 1 l d'ADNc, 10 l de tampon de réaction PCR (Tableau des matériaux), 8 L d'ADN H2O, et 1 L de mélange d'amorces avant et inverses (glyceraldéhyde-3-phosphate dehydrogenase [GAPDH], muscle squelettique [ACTA1], OCT4 et DMD exon22, DMD exon23, et DMD exon24, voir tableau 1).
- Utiliser les paramètres suivants pour la réaction pcR : 50 oC pour 2 min, 95 oC pour 2 min, 40 cycles de 95 oC pour 15 s, 60 oC pour 1 min, courbe de fonte de 65,0 à 95,0 oC, incrément de 0,5 oC.
15. Coloration immunofluorescence de la chaîne lourde de myosine 2 (MYH2) et de l'expression de protéine de dystrophine
- Cellules modifiées induites par la doxycycline de plaque, lenti-TRE-MyoD de l'étape 13.4 sur les diapositives de culture de 8 puits.
- Fixer les cellules dans 4% de formaldéhyde pendant 15 min à température ambiante, puis laver les diapositives deux fois en PBS pendant 5 min à chaque fois.
- Bloquer les cellules avec 5% de diluant de protéines de sérum de chèvre pendant 1 h à température ambiante.
- Ajouter l'anticorps lapin-anti-dystrophine (1:300) et l'anticorps souris-anti-MYH2 (1:100) aux diapositives, incuber à 4 oC pendant la nuit dans une chambre humidifiée.
- Jetez la solution d'anticorps primaire, lavez les cellules 3x (5 min/lavage) en PBS, ajoutez 1:400 diluant Sataïd Alexa488-anticorps anti-lapin conjugués et anticorps anti-souris de chèvre Alexa555-conjugués aux glissières, et incubez pendant 45 min à température ambiante.
- Laver les diapositives 3x (5 min/lavage) en PBS, et monter les sections avec le support de montage contenant DAPI.
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Representative Results
Établissement des fibroblastes de peau de Dmdmdx dérivés d'iPSC. Nous avons démontré l'efficacité de générer des iPSC de souris à partir de souris Dmdmdx dérivées fibroblaste de peau en utilisant les vecteurs de reprogrammation sans intégration. La figure 1A a démontré que l'apparition de cellules souches embryonnaires (ESC) semblables à des colonies à trois semaines après l'infection. Nous évaluons l'efficacité de l'induction d'iPSC par la tache vivante de phosphatase alcalin (AP) ; La figure 1B montre que le pourcentage de cellules AP-positives était d'environ 1,8 % selon l'analyse FACS. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 et SOX2, marqueurs de la pluripotence pour les cellules souches embryonnaires de souris, étaient positifs pour les colonies iPSC par coloration immunofluorescente, (Figure 1C). Pour étudier la différenciation de trois germinaux des iPSCins in vivo, nous avons intramusculairement injecté des iPSCs dans le gastrocnemii de souris. Nous avons observé que les iPSC injectés se différencient en cellules hépatiques (endoderm), cellules musculaires lisses (mesoderm), et cellules neuronales adrénergiques (ectoderm) (Figure 1D), inculpant la pluripotence des iPSC.
Suppression de l'exon23 négociée par CRISPR/Cas9. Nous avons conçu deux ARN guides qui flanquent l'exon mutant 23. Après les pauses à double brin à médiation Cas9 (DSB) et l'adhésion à la fin non-homologue (NHEJ), l'exon 23 mutant a été supprimé, permettant la production tronquée mais fonctionnelle de dystrophine (figure 2A). Pour identifier l'exon 23 iPSC supprimé de souris, les cellules ont été peu enseies, et les colonies individuelles ont été cueillies et propagées. Les ADN génomiques extraits de ces colonies ont été soumis au génotypage PCR. La figure 2B a démontré que les #1 et les #2 de la colonie ont des suppressions exon 23 indiquant une suppression réussie de l'exon 23.
Différencier les iPSC de souris dans une lignée myogénique et restaurer l'expression de dystrophine. Nous utilisons un système d'expression MyoD inducible de tétracycline pour induire la différenciation myogénique des iPSC. La doxycycline a été employée pour induire l'expression de MyoD dans les iPSCs. La figure 3A montre le cours temporel de la différenciation musculaire dans les iPSC traités par Dox. qRT-PCR a prouvé que le niveau d'ARNm d'OCT4, un marqueur pluripotent, a graduellement diminué, alors que l'expression d'ACTA1, un marqueur squelettique de muscle, a augmenté après induction de Dox. De plus, nous avons observé la formation de myotubes deux semaines après le traitement dox (Figure 3B). Fait important, l'effort qRT-PCR a montré la récupération de l'expression d'ARNm DMD exon 24 dans la ligne supprimée Exon23 induite par Dox et à médiation Cas9 par rapport à la ligne de contrôle Cas9 (figure 3C). Incompatible avec qRT-PCR, la coloration immunofluorescente montre l'expression de protéine de dystrophine Cas9-négociée exon 23 cellules supprimées, alors que l'expression de dystrophine était absente dans les cellules témoins (figure 3D).
Figure 1 : Reprogrammer les fibroblastes cutanés des souris Dmdmdx en iPSC.
(A) Image représentative des colonies ES (barre d'échelle de 200 m). (B) Analyse FACS de l'efficacité de reprogrammation des fibroblastes de peau de souris dans les iPSCs après 8 jours de transduction de virus de Sendai par coloration AP vivante. (C) Coloration immunofluorescente de SSEA1, Lin28, Nanog, Oct4 et SOX2 dans les iPSC (barre d'échelle de 50 m). (D) coloration immunofluorescente pour l'AFP (endoderm), SMA (mesoderm), et tyrosine hydrolase (TH) (ectoderm) de tératome 2 semaines après injection d'iPSC dans gastrocnemii (barre d'échelle de 20 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : suppression de l'exon23 négociée par CRISPR/Cas9.
(A) Diagramme schématique de L'exon à médiation CRISPR/Cas9 23 suppressions. La nucléase Cas9 cible intron 22 et intron 23 par deux gRNAs. Double-stranded breaks (DSBs) par Cas9 results in the excision of the mutant exon 23. Les extrémités distales sont réparées par jointure de fin non-homologue (NHEJ), ayant pour résultat la restauration du cadre de lecture du gène de dystrophine. (B) ANALYSE de génotypage PCR de l'exon 23. La flèche indique le produit PCR de l'exon 23. GAPDH sert de référence. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Différencier les iPSC de souris dans la lignée myogénique et restaurer l'expression de dystrophine.
(A) qRT-PCR a montré le cours de temps du niveau d'ARNm d'Oct4 et d'ACTA1 dans Dox-traité exon 23-supprimé Dmdmdx iPSC (P 'lt; 0,05 vs D0, D6, D10, #P 'lt; 0.05 vs D0, D3, D10, $P 'lt; 0.05 vs D0, D3, D6, n '4 pour Oct4) (P 'lt; 0.05 vs D6 et D10 , #P'est de 0,05 vs D0, D3 et D10, $P lt; 0,05 vs D0, D3 et D6, n ' 3 pour ACTA1). (B) Gauche : Image représentative de la formation de myotube à partir d'iPSC de souris induits par Dox (barre d'échelle de 200 m). Droite : Analyse immunofluorescente de MYH2 dans la formation de myotube à partir d'iPSC de souris induits par Dox (barre d'échelle de 20 m). (C) Haut : les positions d'amorce PCR pour DMD Exon22, Exon23 et Exon24 ; En bas : analyse qRT-PCR du niveau d'ARNm de DMD Exon22, Exon23, et Exon24 expression dans MPC (lt de P ; 0,0001, n - 3). (D) Analyse immunofluorescente de l'expression de la dystrophine dans le MPC induit par Dox de l'iPSCCas9-Ctrl et de l'iPSCCas9-gRNA (barre d'échelle de 50 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Amorces de guide | |
| sens i22 | 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAATCAA- 3' |
| i22 antisens | 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3' |
| sens i23 | 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTTTT- 3' |
| I23 antisens | 5'-AAACAGAAGGTATCACATTACTC-3' |
| Amorces PCR | |
| OCT4-Forward | 5'-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA-3' |
| OCT4-Reverse | 5'-TCTCATTGTTGTCGGCTTCCTCCA-3' |
| ACTA1-En avant | 5'-GATCCATGAGACCACCTACAAC-3' |
| ACTA1-Revers | 5'-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3' |
| Exon22-Forward | 5'-TTACCACCAATGCGCTATCA-3' |
| Exon22-Revers | 5'-CCGAGTCTCTCTCCATTATTTTC-3' |
| Exon23-En avant | 5'-CCAAGAAAGCACCTCAGAAATTG-3' |
| Exon23-Revers | 5'-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3' |
| Exon24-Forward | 5'-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3' |
| Exon24-Revers | 5'-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3' |
| GAPDH-En avant | 5'-TGACAAGCTCCCATTCTCG-3' |
| GAPDH-Reverse | 5'-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3' |
Tableau 1 : Séquence d'apprêt.
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Discussion
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire destructrice et finalement mortelle caractérisée par un manque de dystrophine, menant à l'atrophie progressive de muscle1,2. Nos résultats démontrent l'expression rétablie de gène de dystrophin dans les cellules myogenic de progéniture d'iPSC d'iPSC par l'approche de la suppression CRISPR/Cas9-négociée d'exon23. Cette approche présente trois avantages.
Tout d'abord, nous avons généré des iPSC à partir de fibroblastes dermiques dérivés de la souris Dmdmdx à l'aide d'un vecteur d'ARN non intégré. Diverses méthodes ont été développées pour générer des iPSC, tels que les vecteurs lentiviraux et rétroviraux, qui s'intégreront dans les chromosomes hôtes pour exprimer des gènes de reprogrammation, ce qui portera des préoccupations en matière de sécurité. Des vecteurs à base d'ADN tels que les vecteurs plasmides, les virus adéno-associés et les adénovirus existent d'une manière non intégrée; cependant, ils peuvent toujours s'intégrer dans le chromosome hôte à basse fréquence. Dans cette étude, nous avons utilisé un virus Sendai modifié et non transmissible, un vecteur d'ARN non intégré, pour fournir en toute sécurité et efficacement des facteurs de transcription de cellules souches aux fibroblastes pour la reprogrammation.
Ensuite, nous utilisons la suppression du génome à médiation CRISPR, plutôt que la correction du gène de précision par CRISPR/Cas9, pour restaurer l'expression de la dystrophine dans les iPSC. Cette méthode est faisable et efficace; il est facile de concevoir plusieurs gRNAs pour supprimer les exons mutants multiples, qui se produisent dans beaucoup de patients humains de DMD17. La suppression d'exon utilise une voie de jointure de fin non-homologous relativement efficace, et la méthode évite également la nécessité de fournir un modèle de réparation d'ADN. Par conséquent, par rapport à la correction de précision Cas9-négociée, la suppression d'exon cas9-négociée est appropriée pour des patients de DMD présentant des mutations génétiques multiples.
Enfin, nous avons induit des iPSC indifférenciés dans les cellules progénitrices myogéniques, ce qui peut réduire le risque de tumorigenesis causé par les iPSC. Dans ce protocole, nous avons induit l'expression de MyoD par l'intermédiaire d'un système inductible de tetracycline-régulé (Tet-On) de vecteur pour différencier iPSCs en progéniteurs de muscle squelettique18,19.
En conclusion, la combinaison de l'édition du génome CRISPR/Cas9 avec le système d'activation Tet-on MyoD peut fournir une stratégie sûre, faisable et efficace pour la suppression mutante de DMD-Exon23 dans les cellules souches pour la transplantation de cellules chez les patients atteints de DMD.
Pour sélectionner et récolter efficacement les cellules DE type ES, nous devrions identifier les cellules iPSC indifférenciées par leur morphologie en forme de dôme, et un marqueur d'objet d'encrage peut nous aider à étiqueter les clones individuels du fond du plat de culture avec un cercle de 1,8 mm autour de l'iPSC Clones. Pour éviter les fuites de solution trypsine, nous devons appliquer la graisse uniformément au fond des anneaux. En outre, après avoir placé les anneaux recouverts de graisse sur le dessus des colonies de cellules étiquetées, il faut prendre soin de ne pas toucher les anneaux. Dans le cas contraire, les clones iPSC seront détachés.
Le protocole a ses limites; par exemple, nous avons choisi un système vectoriel d'ARN non intégré pour générer des iPSC. Cependant, nous avons utilisé un système CRISPR/Cas9 lentiviral pour supprimer d'exon 23 de DMD et un système d'activation de MyoD lentiviral-basé pour induire la différenciation myogène iPSC ; ces vecteurs lentiviraux intégratifs ont des préoccupations en matière de sécurité. Cependant, ces problèmes peuvent être résolus par l'application d'un complexe de ribonucleoprotein (RNP) comprenant un recombinant, haute pureté S. pyogenes Cas9 nucléase avec un duplex crRNA:tracrRNA; nous pouvons choisir la transfection chimiquement modifiée d'ARNm de MyoD pour différencier directement des iPSCen dans les progéniteurs myogéniques, bien que l'efficacité puisse être provocante.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Tang et Weintraub ont été partiellement soutenus par NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
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