Summary
Här presenterar vi en Cas9-baserade exon23 radering protokoll för att återställa dystrofin uttryck i IPSC från DMDMDX mus-derived hud fibroblaster och direkt differentiera iPSCs till Myogenic progenitorceller (MPC) med hjälp av tet-on MyoD aktiveringssystem.
Abstract
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en svår progressiv muskelsjukdom som orsakas av mutationer i dystrofin genen, vilket i slutändan leder till utmattning av muskelstamceller. Grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom repetitioner/CRISPR-associerad 9 (CRISPR/Cas9) genredigering har potential att återställa uttrycket av dystrofin genen. Autoloka inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)-härledda muskelstamceller (MPC) kan fylla stammen/stamceller pool, reparera skador, och förhindra ytterligare komplikationer i DMD utan att orsaka ett immunsvar. I denna studie introducerar vi en kombination av CRISPR/Cas9 och icke-integrerade iPSC-teknologier för att få muskelstamceller med återvunna dystrofin-proteinuttryck. Kortfattat använder vi en icke-integrera Sendai vektor för att etablera en iPSC linje från dermal fibroblaster av DMDMDX möss. Vi använder sedan CRISPR/Cas9 deletion strategi för att återställa dystrofin uttryck genom en icke-homolog sammanfogning av ominramade dystrofin genen. Efter PCR validering av exon23 utarmning i tre kolonier från 94 plockade iPSC kolonier, vi differentierar iPSC till MPC av doxycyklin (DOX)-inducerad uttryck av MyoD, en viktig transkription faktor spelar en viktig roll i regleringen av muskel differentiering. Våra resultat visar genomförbarheten av att använda CRISPR/Cas9 deletion strategi för att återställa dystrofin uttryck i IPSC-härledda MPC, som har betydande potential för att utveckla framtida terapier för behandling av DMD.
Introduction
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en av de vanligaste muskeldystrofierna och kännetecknas av frånvaron av dystrofin, som drabbar 1 av cirka 5 000 nyfödda pojkar över hela världen1. Förlust av dystrofin genfunktion resulterar i strukturella muskel defekter som leder till progressiv myofibers degeneration1,2. Rekombinant Adeno-associerat virus (Raav)-medierad genterapi system har testats för att återställa dystrofin uttrycket och förbättra muskelfunktion, såsom gen ersättning med mikro-dystrofiner (μ-DYS). Emellertid, den Raav tillvägagångssätt kräver upprepade injektioner att upprätthålla uttrycket av det funktionella proteinet3,4. Därför behöver vi en strategi som kan ge effektivt och permanent återvinna dystrofin genuttryck hos patienter med DMD. DMDMDX Mouse, en musmodell för DMD, har en punktmutation i exon 23 av dystrofin genen som introducerar en förtida uppsägning kodon och resulterar i ett icke-funktionellt stympat protein saknar C-Terminal dystroglycan bindande domän. Nyligen genomförda studier visat användning av CRISPR/Cas9 teknik för att återställa dystrofin genuttryck genom noggrann gen korrigering eller mutant exon radering i små och stora djur5,6,7. Long et al.8 rapporterade metoden för att korrigera dystrofin genmutation i DMDMDX Mouse köns cells av Homology-riktad reparation (HDR) baserad CRISPR/Cas9 Genome redigering. El Refaey et al.9 rapporterade att Raav effektivt kunde punktskatter den muterade exon 23 i dystrofiska möss. I dessa studier utformades grnas i introner 20 och 23 för att orsaka dubbelsträngade DNA-raster, som delvis återställde dystrofin-uttrycket efter DNA-reparation via icke-homolog ändsammanfogning (nhej). Ännu mer spännande, amoasii et al.10 rapporterade nyligen effekt och genomförbarhet av Raav-medierad CRISPR genredigering i återställa dystrofin uttryck i Hundarnas modeller, ett viktigt steg i framtida klinisk tillämpning.
DMD orsakar också stamcells sjukdomar11. För muskel skada, bostäder muskelstamceller fylla döende muskelceller efter muskel differentiering. Emellertid, i följd cykler av skada och reparation leda till förkortning av telomererna i muskelstamceller12, och förtida utarmning av stamceller pooler13,14. Därför kan en kombination av autolog stamcellsterapi med genom-redigering för att återställa dystrofin uttryck vara en praktisk metod för behandling av DMD. Den CRISPR/Cas9 teknik ger möjlighet att generera autololog genetiskt korrigerade inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) för funktionell muskel förnyelse och förhindra ytterligare komplikationer av DMD utan att orsaka immun avvisande. Emellertid, iPSCs har en risk för tumör bildning, som skulle kunna lindras genom differentiering av iPSC i myogena stamceller.
I detta protokoll beskriver vi användningen av icke-integrera Sendai virus för att omprogrammering dermal fibroblaster av DMDMDX -möss i iPSCs och sedan återhämta dystrofin uttryck genom CRISPR/Cas9 genomradering. Efter validering av Exon23 radering i iPSC av genotypning, differentierade vi Genome-korrigerad iPSC till Myogenic stamceller (MPC) via MyoD-inducerad myogen differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All hantering av djur och kirurgiska ingrepp utfördes av ett protokoll som godkändes av Augusta University institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC). Möss matades standard diet och vatten AD libitum.
1. isolering av primära mus fibroblaster från vuxna DMDMDX -möss
- Euthanize vuxna DMDMDX möss (hane, 2 månader gammal) genom Co2 kvävning och thorakotomi enligt Iacuc godkänd av Medical College of Georgia, Augusta University. Skär svansen med en steril skalpell i ett sterilt tillstånd under laminärt huven. Skölj svansen med 70% etanol i 5 min, och sedan tvätta med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en 6 cm skålen.
- Skala svansen huden av en skarp snitt från basen till svansspetsen längs svans huden, och sedan försiktigt dra av svansen huden med pincett. Finhacka huden till en storlek av 1 mm3 med hjälp av en steril skalpell och flytta den malda huden vävnad till en 6 cm skålen i Dulbecco s minimal Essential medium/Ham ' s F12 (DMEM/F12) som innehåller 0,1% kollagenase IV och 1 U/ml av dispase.
- Smälta huden vävnad i en kultur skålen för 2 h vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator.
- Täck en 6-brunn tallrik med Fibronektin och 0,2% gelatin (1 ml Fibronektin i 199 ml 0,2% gelatin; Tabell över material) och inkubera vid 37 ° c i 1 h.
- Separera den smälta hudvävnaden med en 1 mL Pipettera-spets och överför vävnaden och supernatanten till ett sterilt 15 mL koniskt centrifugeringsrör. Centrifugera vid 217 x g i 3 min vid rumstemperatur, Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 1,5 ml fibroblastmedium (tabell över material).
- Odla pelletar inklusive ofullständig smält hud vävnad från steg 1,5 på 6-brunnen plattan belagd med Fibronektin och 0,2% gelatin från steg 1,4 i en 37 ° c, 5% Co2 inkubator. Byt ut mediet 24 h efter den inledande pläteringen för att ta bort okopplade celler, och ändra mediet varje 48 h.
2. omprogrammering mus hud fibroblaster till iPSCs
- Två dagar före transduktion, Digest Mouse dermal fibroblaster från steg 1,6 med cell avlossning lösning (tabell över material) i en 37 ° c inkubator med en Befuktad atmosfär av 5% Co2 för 5 min.
- Räkna celler med en hemacytometer och centrifugera vid 217 x g i 3 min.
- Frö celler med en densitet av 1 − 2 x 105 celler per brunn på en 6-brunn tallrik och kultur med fibroblast medium (tabell över material) i en 37 ° c inkubator med en Befuktad atmosfär av 5% Co2.
- På dagen för transduktion (dag 0), uppskatta cellerna och beräkna volymen av varje virus som krävs för att nå den mål mångfald av infektion (MOI) av 5, 5 och 3 (dvs., KOS MOI = 5, HC-MYC MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) enligt den kommersiella manualen.
- Tina tre Sendai-rör i en 37 ° c vattenbad för 5 − 10 s och tillsätt de beräknade volymerna av var och en av de tre Sendai rören till 1 mL fibroblast medium (tabell över material).
- Ta bort fibroblast mediet från steg 2,3 och tillsätt omprogrammering virus blandningen till brunnarna som innehåller cellerna. Inkubera cellerna över natten i en inkubator på 37 ° c med en Befuktad atmosfär på 5% CO2.
- Byt ut mediet med färsk fibroblast medium 24 h efter transduktion. Odla cellerna i en vecka med medelstort utbyte varannan dag.
- Harvest infekterade mus fibroblaster på dag 7 efter signaltransduktion med 0,05% trypsin/EDTA och placera på rätter som tidigare belagda med Fibronektin och 0,2% gelatin.
- Kultur den infekterade mus fibroblaster från steg 2,6 med komplett mus embryonala stamceller (ES) tillväxtmedium (tabell över material) i en 37 ° c inkubator med en Befuktad atmosfär av 5% Co2 och Byt medium dagligen.
- Från den 8: e dagen, Observera plattan under ett inverterat Mikroskop varannan dag för att identifiera utseendet på cell klumpar med morfologi av mus ES.
3. användning av alkaliskt fosfatas levande fläcken och flödescytometri för att kvantifiera omprogrammering effektivitet
- Ta bort odlingsmediet från varje brunn och skölj med DMEM/F-12 i 2 − 3 min.
- Applicera 2 mL 1x alkaliskt fosfatas (AP) levande fläta arbetslösning (1:500 spädning i DMEM/F-12) till de sittande cellerna och inkubera i en inkubator på 37 ° c med en Befuktad atmosfär på 5% CO2 under 30 min.
- Aspirera AP levande fläcken och tvätta två gånger med PBS för 5 min vardera.
- Smälta cellerna med cell avlossning lösning (tabell över material) i en 37 ° c inkubator med en fuktad atmosfär av 5% Co2 för 5 min. utför flödescytometri för att bestämma omprogrammeringseffektiviteten.
4. val och skörd av ES-liknande celler
- Undersök kolonierna från steg 2,8 under ett inverterat Mikroskop.
- Markera kolonierna längst ner på skålen med en själv Inking objekt markör.
- Applicera smord klonings ringar för att täcka de markerade cellkolonierna. Tillsätt 100 μL av 0,05% trypsin/EDTA till varje klonings ring vid 37 ° c i 5 min, och överför sedan de smälta cellerna med 100 μL pipettspetsar till 48-och kultur plattor som innehåller mES Growth medium.
- Inkubera cellerna i 48-well kultur plattor i en 37 ° c inkubator med en Befuktad atmosfär av 5% CO2. Passage cellerna till 6 cm skålen när de når 70% Confluence.
- Upprepa steg 4,3 och 4,4 för flera gånger tills enhetliga Dorm-formade kloner erhålls.
5. frysning iPSCs för frysförvaring
- Separera markerade iPSCs från steg 4,5 med trypsin, versene och chick plasma (TVP; Tabell över material) lösning vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator i 30 min.
- Samla in cellerna i ett sterilt 15 mL koniskt rör och centrifugera vid 217 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 2 mL mus ES fryst medium (tabell över material) för att få 1 ml per kryovial.
- Tillsätt celler till cryovials och frysa med hjälp av en frys behållare som ger den kritiska, upprepade-1 ° c/min kylhastighet krävs för frysförvaring vid-80 ° c över natten.
- Överför frysta flaskor till en flytande kväve tank.
6. immunofluorescensfärgning av stamcells markörer i iPSCs
- Seed iPSCs från steg 5,1 odlade med mES medium i en 8-brunn kammare Slide belagd med Poly-D-lysin/laminin (tabell över material) vid lämplig densitet för att uppnå mellan 1 − 2 x 104 celler per brunn och inkubera i en 37 ° c inkubator med en Befuktad atmosfär av 5% CO2 för 48 h.
- Sänk ned bilderna i 4% formaldehyd i 15 minuter vid rumstemperatur och sänk sedan ned bilderna i PBS två gånger i 5 minuter varje gång.
- Inkubera sektioner med en mus-IgG-blockeringsreagens (tabell över material) och 5% get serum för 1 h vid rumstemperatur.
- Späd de primära antikropparna i protein spädningsmedel (mus-anti-SSEA1, 1:100, kanin-anti-nanog, 1:500; kanin-anti-Pou klass 5 Hedgehog 1 [OCT4], 1:500; kanin-anti-sry-Box 2 [SOX2], 1:500; kanin-anti-lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400) (tabell över Material). Applicera antikroppar mot cellerna och inkubera vid 4 ° c över natten i en fuktad kammare.
- Kassera den primära antikroppslösningen och tvätta bilderna 3x i PBS.
- Applicera andra antikroppar (Alexa488-konjugerad get-antimusantikropp och Alexa555-konjugerad get-anti-kanin, 1:400 vardera) i M.O.M. protein spädningsmedel på diabilder och inkubera i 45 min vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna 3x i PBS och montera sektioner med monteringsmedel innehållande 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Ta bilder med ett konfokal Mikroskop.
7. undersöka pluripotensen av iPSCs in vivo
- Separera iPSCs från steg 5,1 till enskilda celler med hjälp av TVP-lösning i en inkubator på 37 ° c med en Befuktad atmosfär på 5% CO2 i 30 min.
- Räkna celler med en hemacytometer och centrifugera vid 217 x g i 3 min.
- Aspirera supernatanten och Omsuspendera pelleten med mES medium i ett 1,5 mL sterilt centrifugerör med en koncentration av 5 x 105 celler/30 μl för celltransplantation.
- Ta bort hår från båda bakbenen av immunobristfälliga möss med hårklippningsmaskiner.
- Anesthetize möss med ketamin (100 mg/kg) och rengör injektionsstället med 75% alkohol.
- Injicera 30 μL iPSC-suspension från steg 7,3 intramuskulärt till gastrocnemii, med hjälp av en 31 G nål.
- Två veckor efter injektionen, skörda musen gastrocnemii och bädda in i optimal skärtemperatur (Oct) förening, snap frysa och skär i 5-μm avsnitten15,16.
- Fix sektioner i 4% formaldehyd i 15 min vid rumstemperatur, och sedan tvätta bilderna två gånger i PBS för 5 min varje gång.
- Blockera cellerna med 5% get serumprotein spädningsmedel för 1 h vid rumstemperatur.
- Tillsätt utspädd primär antikropp (kanin anti-AFP, 1:50; kanin anti-SMA, 1:50; kanin anti-TH, 1:50) till glidbanorna och inkubera vid 4 ° c över natten i en fuktad kammare.
- Kassera den primära antikroppslösningen, tvätta cellerna 3x (5 min/tvätta) i PBS, tillsätt en 1:400 utspädd Alexa555-konjugerad get-anti-kanin-antikropp till diabilder och inkubera i 45 min vid rumstemperatur.
- Tvätta bilder 3x (5 min/tvätt) i PBS, och montera sektioner med monteringsmedel som innehåller DAPI.
8. byggande av CRISPR/Cas9 lentiviral Vector inriktning introner kompletterande dystrofin exon 23
- Designa två par grna oligos inriktning intron-flankerad dystrofin exon 23 via http://crispor.tefor.net/crispor.py.
Obs: de designade paren är följande:
i22sense: 5 '-CACCGTtaagcttaggtaaaatcaa-3 '
i22anti-Sense: 5 '-AAACTtgattttacctaagcttaaC-3 '
i23sense: 5 '-CACCGAgtaatgtgtcataccttct-3 '
i23anti-Sense: 5 '-AAACAgaaggtatgacacattactC-3 '). - Digest och defosforylate 5 μg lentiviral CRISPR plasmid (lenti-CRISPRv2-Blast [en gåva från Mohan Babu] och lenti-guide-hygro-iRFP670 [en gåva från kristen Brennand]) (tabell över material) med BsmB1/Esp3I för 30 min vid 37 ° c. För 5 μg plasmider, tillsätt 3 μL BsmB1 begränsa enzym, 3 μL snabbt alkaliskt fosfatas, 6 μL av 10X enzymsammanfattningsbuffert och 0,6 μL 100 mM DTT i 60 μL reaktion).
- Ladda reaktionerna på en 0,8% aguppstod gel. Kör gelen vid 100 − 150 V i 30 min.
- Renar smält plasmid i-gel med hjälp av en gel extraktion Kit (tabell över material) och eluera i 20 μl av H2O.
- Fosforylat och glödga varje par av grna oligonukleotider som innehåller 1 μl av varje oligonukleo tid vid 100 μm, 1 μl 10X T4 ligering buffert, 0,5 μl av T4 polynukleotidkinas (pnk), 6,5 μl av DDH2O vid 37 ° c i 30 min, och sedan 95 ° c i 5 min och sedan ramp d egen till 25 ° c vid 5 ° c/min.
- Ligate a 1:200 utspädning av glödgad gRNA oligonukleotides in i den iRFP670-Blast eller för att leda-hygro-. Blanda 50 ng av BsmB1/Esp3I smält vektorer med 1 μL utspädd oligo duplex och 5 μL 2x ligasbuffert plus 1 μL Ligase i ett 11 μL reaktionssystem och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Utför omvandling med 3 μL ligeringsprodukt till 50 μL kompetenta celler (tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
- Sprid de transformerade kompetenta cellerna i en agarplatta med 100 μg/mL carbenicillin och inkubera vid 31,5 ° c i 18 timmar.
- Välj kolonier med 10 μL sterila pipettspetsar och kultur i 5 mL Terrific buljong (tabell över material) som innehåller 100 μg/ml carbenicillin vid 31,5 ° c, 185 rpm i en shaker inkubator för 21 h.
- Rena plasmid-DNA med hjälp av mini-prep och MIDI-prep Kits (tabell över material).
- Kontrollera mini-prep plasmider genom begränsning matsmältningen. För 20 μL reaktionssystem, tillsätt 1 μg plasmid-DNA, 2 μL Digest-reaktionsbuffert (tabell över material) och 1 μl restriktionsenzymblandning (0,5 μl av kpni-hf och 0,5 μl av agei-HF för i22, 0,5 μl av e-HF-och 0,5 μl EcoRI-HF för som guide-hygro-iRFP670-i23). Inkubera Reaktionssystemet i 1 h vid 37 ° c.
- Ladda reaktionerna på en 0,8% aguppstod gel. Kör gelen vid 100 − 150 V i 30 min.
Obs: de korrekta banden för i22 bör vara 622 BP och 12,2 KB, och de rätta banden för de mer än-hygro-iRFP670-i23 bör vara 2,6 KB och 7,1 KB.
9. lentiviral vektor förpackning
- Kultur 7 x 105 293ft celler i 5 ml DMEM-mediainnehåll ande 10% fetalt bovint serum i 6 cm skålen över natten vid 37 ° c, 5% Co2.
- Förbered en cocktail (1 μg av i22 eller en mängd-hygro-iRFP670-i23, 750 ng av psPAX2 förpackningplasmid, 250 ng av pMD2. G kuvert plasmid och 5 μL transfektionsreagens A [tabell över material] i 100 μl av reducerat serum MEM-medium).
- Bered en blandning av 5 μL transfektionsreagens B (tabell över material) i 100 μl reducerat serum-MEM-medium.
- Tillsätt 100 μL av transfektionsreagens B-blandningen till plasmid-blandningen från steg 9,2 och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt DNA-lipidkomplexet (från steg 9,4) droppvis till 293ft-cellerna. Inkubera över natten vid 37 ° c med 5% CO2.
- Lägg till virus Production Enhancer (500x) (tabell över material) till varje maträtt nästa dag och inkubera för 24 h vid 37 ° c, 5% Co2.
- Samla medel från celler med pipetter på de kommande två dagarna och filtrera mediet genom ett 0,45 μm filter för att ta bort cellerna.
10. koncentration och rening av lentivirala vektorer
- Fällningen lentiviral vektor i mediet av steg 9,7 över natten vid 4 ° c med 5x polyetylenglykol 4000 (PEG4000, 8,5% slutkoncentration) och 4 M NaCl (0,4 M slutlig koncentration).
- Centrifugera det virala mediet som innehåller PEG4000-lösningen vid 2 095 x g och 4 ° c i 30 minuter, ta bort och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera pelletar med 500 μL serum reducerat MEM media (lentivirus titer: lenti-CRISPR v2-gRNAi22:1,56 x 108, lenti-IRFP670-gRNAi23:1,3 x 108, lenti-CRISPR v2-kontroll: 3,13 x 107, lenti-iRFP670-Control: 5,9 x 107 ). Förvara vid-80 ° c till användning.
11. borttagande av exon 23 i mus iPSCs med två guide RNAs (gRNAs) tillsammans med Cas9
- Platta musen iPSCs från steg 4,5 i en 24-brunn tallrik belagd med Fibronektin och gelatin.
- Efter att cellerna når 50% sammanflödet, Byt till det friska odlingsmediet (komplett mus embryonala stamcells odlingssubstrat) som innehåller 8 μg/mL polybrene).
- Tillsätt 100 μL av lentiviral partikel lösning från steg 10,3 inklusive lenti-CRISPR v2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 och kontroll (tom vektor: lenti-CRISPR v2, lenti-iRFP670) till mus iPSCs. Inkubera celler i 3 dagar vid 37 ° c med 5% CO2.
- Välj stabilt infekterade celler med media som innehåller 2,5 μg/mL blasticidin och 100 μg/mL hygromycin B genom att bestämma den lägsta koncentrationen av blasticidin och hygromycin B som krävs för att döda den un-infekterade cellen.
Obs: un-infekterade celler skulle dödas av blasticidin och hygromycin B. - Smälta den valda musen iPSCs med 0,5 mL TVP lösning varje brunn (24-väl tallrik) och inkubera celler i 30 min vid 37 ° c med 5% CO2.
- Separera iPSCs i enskilda celler genom pipettering, räkna celler med en cell räknar kammare och sedan späda ut ca 150 smälta enstaka celler med mES medium i 10 cm skålen för kultur vid 37 ° c med 5% CO2.
- Efter ca 10 dagar, plocka enstaka kolonier under ett inverterat Mikroskop med 10 μL sterila pipettspetsar (96 kolonier måste plockas).
- Överför de plockade kolonierna till 50 μL TVP-lösning varje brunn (96-brunn plätera, en koloni varje brunn), smälta på ° c 37 för 30 minuter, och därefter frö de smälta cellerna in i 2 96-brunn kultur pläterar för att hålla kultur (en för genotyping).
- Inkubera i en CO2 -inkubator vid 37 ° c till 70% confluent.
12. identifiering av iPSC-kolonier med exon23-radering
- Ta bort mediet i 96-väl plattan när cellkolonierna når 70% Confluence.
- Tillsätt 25 μl lysis reagens (tabell över material) som innehåller proteinas k-lösning (1 ml proteinas k i 100 ml lyreagensmedel) till varje brunn och överför lysatet till en 96-brunn PCR-platta.
- Försegla PCR-plattan och inkubera plattorna vid 55 ° c i 30 min, och sedan vid 95 ° c i 45 min för att lysera cellerna och denaturera proteinas K.
- Utför PCR-reaktion med 2 μL lysat från steg 12,3. För den 20 μL PCR-reaktionen, tillsätt 2 μL lysat, 10 μL 2x DNA polymeras premix (tabell över material), 7 μl DNase-fritt vatten och 1 μl av DMD exon 23 primers (tabell 1).
- Använd följande parametrar för PCR-reaktion: 98 ° c för 1 min, 35 cykler av 98 ° c för 10 s, 60 ° c för 15 s, 72 ° c för 30 s, och en slutlig förlängning vid 72 ° c i 1 min.
- Ladda PCR-reaktionen på en 2-procentig agaros gel. Kör gelen vid 100 − 150 V i 30 min.
- Inspektera gelen under UV-ljus (Knockout-effektiviteten är 3/94).
13. använda tet-on MyoD aktiveringssystem för att direkt särskilja iPSC till myogena progenitorceller (MPC)
- Paketera LV-TRE-VP64-Mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 och LV-TRE-VP16 Mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 (en gåva från Charles Gersbach) (tabell över material) som tidigare beskrivits för lenti-CRISPRv2-Blast och lenti-Grna-iRFP670 vektorer i avsnitt 9 och 10.
- Infektera mus iPSC med lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 eller lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 som tidigare beskrivits för lenti-CRISPRv2-Blast och lenti-gRNA-iRFP670 vektorer i steg 11.1 − 11,3.
- Välj celler med 1 μg/mL puromycin efter tre dagar av infektion för att få en ren omvandnad cellpopulation.
- Tillsätt 3 μg/mL doxycyklin i odlingsmedier (10% FBS DMEM) till MPC-differentiering. Byt ut färskt medium kompletterat med doxycyklin varannan dag.
14. kvantitativ omvänd Transkription PCR för utvärdering av dynamisk muskel differentiering och DMD exon 22-24 uttryck
- Extrahera cellulära RNA efter 0, 3, 6, och 10 dagar efter doxycyklin behandling med RNA-isolering reagens, transkribera transkribera RNA till cDNA genom att använda First strand cDNA syntes Kit (tabell över material).
- För 20 μL qPCR-reaktionssystem, tillsätt 1 μL cDNA, 10 μL PCR-reaktionsbuffert (tabell över material), 8 μl DNA H2O och 1 μl blandning av främre och omvända primrar (glyceraldehyd-3-FOSFATDEHYDROGENAS [GAPDH], skelettmuskulaturen [ACTA1], OCT4 och DMD exon22, DMD exon23 och DMD exon24, se tabell 1).
- Använd följande parametrar för PCR-reaktion: 50 ° c för 2 min, 95 ° c för 2 min, 40 cykler av 95 ° c för 15 s, 60 ° c för 1 min, smält kurva 65,0 ° c till 95,0 ° c, ökning 0,5 ° c.
15. immunofluorescensfärgning av myosin tung kedja 2 (MYH2) och dystrofin proteinuttryck
- Platta doxycyklin-inducerad, lenti-TRE-MyoD modifierade celler från steg 13,4 till 8-well kultur diabilder.
- Fix celler i 4% formaldehyd i 15 min vid rumstemperatur, och sedan tvätta bilderna två gånger i PBS för 5 min varje gång.
- Blockera cellerna med 5% get serumprotein spädningsmedel för 1 h vid rumstemperatur.
- Tillsätt kanin-anti-Dystrophin antikropp (1:300) och mus-anti-MYH2 antikropp (1:100) till diabilderna, inkubera vid 4 ° c över natten i en fuktad kammare.
- Kassera den primära antikroppslösningen, tvätta cellerna 3x (5 min/tvätta) i PBS, tillsätt 1:400 utspädd Alexa488-konjugerad get-anti-kanin-antikropp och Alexa555-konjugerad get-antimus-antikropp till diabilder, och inkubera i 45 min vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna 3x (5 min/tvätt) i PBS och montera sektioner med monteringsmedel som innehåller DAPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inrättande av DMDMDX Skin fibroblaster härledda IPSC. Vi demonstrerade effektiviteten för att generera mus iPSCs från DMDMDX möss härledd hud fibroblast med hjälp av integrations fria omprogrammering vektorer. Figur 1a visade att uppkomsten av embryonala STAMCELLER (ESC)-liknande kolonier vid tre veckor efter infektion. Vi utvärderar effektiviteten av iPSC induktion av levande alkaliskt fosfatas (AP) fläcken; Figur 1b visar att andelen AP-positiva celler var cirka 1,8% av FACS-analysen. SSEA1, Lin28, nanog, OCT4 och SOX2, pluripotensmarkörer för embryonala stamceller från möss, var positiva för iPSC-kolonier genom Immunofluorescerande färgning (figur 1c). För att undersöka de tre köns cells differentiering av iPSCs in vivo, vi injiceras intramuskulärt iPSCs i musen gastrocnemii. Vi observerade att den injicerade iPSCs differentieras till leverceller (endoderm), glatta muskelceller (mesoderm), och adrenerga neuron celler (ectoderm) (figur 1d), indicerar pluripotensen av iPSCs.
CRISPR/Cas9-medierad exon23 radering. Vi designade två guide-RNAs som flanerar muterade exon 23. Efter Cas9-medierade dubbel-strandade raster (DSB) och icke-homolog sammanfogning (NHEJ), muterade exon 23 togs bort, vilket möjliggör stympad men funktionell dystrofin produktion (figur 2A). För att identifiera exon 23 raderade mus iPSC var celler glest seedade, och enskilda kolonier plockades och propagerades. Genomiska DNAs som utvinns ur dessa kolonier utsattes för genotypning av PCR. Figur 2b visade att kolonin #1 och #2 har exon 23 borttagningar som indikerar en lyckad radering av exon 23.
Differentiera mus iPSCs till en myogen härstamning och återställa dystrofin uttryck. Vi använder ett tetracyklin-inducerbart MyoD-uttryckssystem för att inducera myogen differentiering av iPSCs. Doxycyklin användes för att inducera MyoD-uttryck i iPSCs. Figur 3a visar tidsförloppet för muskel differentiering i DOX-behandlad iPSCs. qRT-PCR visade att mRNA-nivån av OCT4, en pluripotenta markör, minskade gradvis, medan uttrycket av ACTA1, en skelettmuskel markör, ökade efter DOX-induktion. Vi observerade också myotubes bildas vid två veckor efter DOX-behandling (figur 3b). Viktigt är att qRT-PCR-analysen visade återhämtningen av DMD exon 24 mRNA-uttrycket i DOX-inducerad, Cas9-medierad Exon23 borttagen linje jämfört med Cas9-Control line (figur 3c). Oförenligt med QRT-PCR visar immunofluorescensfärgning dystrofin proteinexpressionin Cas9-medierad exon 23 borttagna celler, medan dystrofin uttryck saknades i kontrollceller (figur 3D).
Figur 1: omprogrammering av hud fibroblaster från DMDMDX -möss till iPSCs.
A) representativ bild av ES-liknande kolonier (skalstreck = 200 μm). (B) FACS analys av omprogrammering effektivitet mus hud fibroblaster till iPSCs efter 8 dagar av Sendai virus transduktion av levande AP färgning. C) Immunofluorescerande FÄRGNING av SSEA1, Lin28, nanog, OCT4 och SOX2 i iPSCs (skal stång = 50 μm). D) immunofluorescensfärgning av AFP (endoderm), SMA (mesoderm) och tyrosin hydrolas (th) (ectoderm) av teratoma 2 veckor efter IPSC-injektion i gastrocnemii (Scale bar = 20 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CRISPR/Cas9-medierad exon23 radering.
(A) Schematiskt diagram över CRISPR/Cas9-medierad exon 23 borttagningar. Den Cas9 Nuclease mål intron 22 och intron 23 av två gRNAs. Dubbel-strandsatta avbrott (DSBs) vid Cas9 resulterar i excisionen av den muterade exon 23. Den distala ändarna repareras av icke-homolog sammanfogning (nhej), vilket resulterar i återställandet av läsramen av dystrofin genen. B) genotypning av PCR-analys av exon 23. Pilen indikerar PCR-produkten av exon 23. GAPDH fungerar som referens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: differentiera mus iPSCs till myogena linjen och återställa dystrofin uttryck.
(A) QRT-PCR visade tidsförloppet för mRNA-nivån för OCT4 och ACTA1 i DOX-behandlad exon 23-borttagen DMDMDX IPSC (* P < 0,05 vs D0, D6, D10, #P < 0,05 vs D0, d3, D10, $P < 0,05 vs D0, D3, D6, n = 4 för Oct4) (* P < 0,05 vs D6 och D10 , #P < 0,05 vs D0, D3 och D10, $P < 0,05 vs D0, D3 och D6, n = 3 för ACTA1). (B) vänster: representativ bild av myotube formation från DOX-inducerad mus iPSCs (Scale bar = 200 μm). Höger: Immunofluorescent analys av MYH2 i myotube formation från DOX-inducerad mus iPSCs (Scale bar = 20 μm). Cövre: PCR-primerpositionerna för DMD Exon22, Exon23 och Exon24. Bottom: qRT-PCR-analys av mRNA-nivån för DMD Exon22, Exon23 och Exon24 uttryck i MPC (* * * * P < 0,0001, n = 3). (D) Immunofluorescerande analys av dystrofin uttryck i DOX-inducerad MPC från IPSCCas9-CTRL och IPSCCas9-grna (Scale bar = 50 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Guide primers | |
| i22 Sense | 5 '-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA-3 ' |
| i22 antisense | 5 '-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3 ' |
| i23 Sense | 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 ' |
| I23 antisense | 5 '-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3 ' |
| PCR-primers | |
| OCT4-framåt | 5 '-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA-3 ' |
| OCT4-omvänd | 5 '-TCTCATTGTTGTCGGCTTCCTCCA-3 ' |
| ACTA1-framåt | 5 '-GATCCATGAGACCACCTACAAC-3 ' |
| ACTA1-omvänd | 5 '-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3 ' |
| Exon22-framåt | 5 '-TTACCACCAATGCGCTATCA-3 ' |
| Exon22-omvänd | 5 '-CCGAGTCTCTCCTCCATTATTTC-3 ' |
| Exon23-framåt | 5 '-CCAAGAAAGCACCTTCAGAAATATG-3 ' |
| Exon23-omvänd | 5 '-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3 ' |
| Exon24-framåt | 5 '-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3 ' |
| Exon24-omvänd | 5 '-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3 ' |
| GAPDH-Forward | 5 '-TGACAAGCTTCCCATTCTCG-3 ' |
| GAPDH-omvänd | 5 '-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3 ' |
Tabell 1: primer-sekvens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en destruktiv och ytterst dödlig ärftlig sjukdom som kännetecknas av brist på dystrofin, vilket leder till progressiv muskelatrofi1,2. Våra resultat visar den återställda dystrofin genuttryck i DMDMDX IPSC-härledda myogena stamceller genom att närma sig CRISPR/Cas9-medierad exon23 radering. Detta tillvägagångssätt har tre fördelar.
Först genererade vi iPSCs från DMDMDX mus-härledda dermal fibroblaster med hjälp av en icke-integrerad RNA-vektor. En mängd olika metoder har utvecklats för att generera iPSCs, såsom lentivirala och retrovirala vektorer, som kommer att integreras i värdkromosomer för att uttrycka omprogrammering gener, vilket bär säkerhetsproblem. DNA-baserade vektorer såsom plasmid vektorer, Adeno-associerade virus och adenovirus finns på ett icke-integrerat sätt; emellertid, de kan fortfarande integreras i värd kromosomen på en låg frekvens. I denna studie använde vi en modifierad, icke-överförbara Sendai virus, en icke-integrerad RNA-vektor, för att säkert och effektivt leverera stamceller transkription faktorer till fibroblaster för omprogrammering.
Nästa, vi använder CRISPR-medierad genom radering, snarare än CRISPR/Cas9-medierad precision gen korrigering, att återställa dystrofin uttryck i iPSCs. Denna metod är genomförbar och effektiv. Det är lätt att designa flera gRNAs för att ta bort flera muterade exoner, som förekommer hos många humana DMD-patienter17. Exon radering utnyttjar en relativt effektiv icke-homolog sammanfognings väg, och metoden undviker också behovet av att leverera en DNA-reparationsmall. Därför, i jämförelse med Cas9-medierad precision korrigering, Cas9-medierad exon radering är lämplig för DMD patienter med flera genmutationer.
Slutligen, vi inducerade odifferentierade iPSCs till myogena stamceller, vilket kan minska risken för tumorigenes orsakad av iPSCs. I detta protokoll, vi inducerade MyoD uttryck via en inducerbar tetracyklin-reglerade (tet-on) vektorsystem för att differentiera iPSCs till skelettmuskel progenitorer18,19.
Sammanfattningsvis, kombinationen av CRISPR/Cas9 genom redigering med tet-on MyoD aktiveringssystem kan ge en säker, genomförbar och effektiv strategi för Mutant DMD-Exon23 radering i stamceller för celltransplantation hos DMD-patienter.
För att välja och skörda ES-liknande celler effektivt bör vi identifiera de odifferentierade iPSC-cellerna via deras kupolliknande morfologi, och en pennanteckningar objekt markör kan hjälpa oss att märka enskilda kloner från botten av kultur skålen med en 1,8 mm cirkel runt iPSC Kloner. För att undvika läckage av trypsin lösning, måste vi applicera fett jämnt till botten av ringarna. Också, efter att ha placerat fett-belagda ringarna på toppen av den märkta cellkolonier, bör försiktighet iakttas att inte röra ringarna. I annat fall kommer iPSC-klonerna att tas loss.
Protokollet har sina begränsningar; till exempel valde vi ett icke-integrerat RNA vektorsystem för att generera iPSCs. Emellertid, vi använde en lentiviral CRISPR/Cas9 system för att ta bort DMD exon 23 och en lentiviral-baserade MyoD aktiveringssystem för att inducera iPSC Myogenic differentiering; dessa integrativa lentivirala vektorer har säkerhetsproblem. Emellertid, dessa frågor kan lösas genom tillämpning av en ribonukleoprotein (RNP) komplex som består av en rekombinant, hög renhet S. pyogenes Cas9 Nuclease med ett crrna: tracrrna duplex; Vi kan välja kemiskt modifierade MyoD mRNA transfektion att direkt differentiera iPSCs till Myogenic stamceller, även om effektiviteten kan vara utmanande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Tang och Weintraub stöddes delvis av NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
