Summary
Hier presenteren we een Cas9-gebaseerd exon23 deletie protocol om Dystrofine expressie in iPSC te herstellen van DMDMDX Mouse-afgeleide huid fibroblasten en direct ipscs te onderscheiden in myogene voorlopercellen (MPC) met behulp van het Tet-on myod activeringssysteem.
Abstract
Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige progressieve spierziekte veroorzaakt door mutaties in het Dystrofine gen, wat uiteindelijk leidt tot uitputting van spier voorlopercellen. Geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR-geassocieerde 9 (CRISPR/Cas9) genbewerking heeft het potentieel om de uitdrukking van het Dystrofine-gen te herstellen. Autologe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)-afgeleide spier voorlopercellen (MPC) kunnen de stam-/voorloper celpool aanvullen, schade herstellen en verdere complicaties in DMD voorkomen zonder een immuunrespons te veroorzaken. In deze studie introduceren we een combinatie van CRISPR/Cas9 en niet-geïntegreerde iPSC-technologieën om spier voorlopercellen te verkrijgen met teruggewonnen Dystrofine-eiwit expressie. Kort samengevat gebruiken we een niet-integrerende Sendai-vector om een iPSC-lijn op te zetten van dermale fibroblasten van DMDMDX -muizen. Vervolgens gebruiken we de crispr/Cas9 verwijderings strategie om Dystrofine expressie te herstellen door een niet-homologe eind verbinding van het de Dystrofine gen. Na PCR-validering van exon23 depletie in drie kolonies uit 94 geplukt iPSC-kolonies, onderscheiden we iPSC in MPC door doxycycline (Dox)-geïnduceerde expressie van MyoD, een belangrijke transcriptiefactor die een belangrijke rol speelt bij het reguleren van spier differentiatie. Onze resultaten tonen de haalbaarheid van het gebruik van CRISPR/Cas9 verwijderings strategie om Dystrofine-expressie te herstellen in de met iPSC afgeleide MPC, die een significant potentieel heeft voor het ontwikkelen van toekomstige therapieën voor de behandeling van DMD.
Introduction
Duchenne spierdystrofie (DMD) is een van de meest voorkomende spier dystrofieën en wordt gekenmerkt door de afwezigheid van Dystrofine, die 1 van ongeveer 5.000 pasgeboren jongens wereldwijd1. Verlies van Dystrofine-genen functie resulteert in structurele spier defecten die leiden tot progressieve myovezels degeneratie1,2. Recombinant Adeno-associated virus (rAAV)-gemedieerd gentherapie systeem is getest om de Dystrofine expressie te herstellen en de spierfunctie te verbeteren, zoals het vervangen van genen met behulp van micro-dystrofines (μ-dys). De raav-benadering vereist echter herhaalde injecties om de expressie van het functionele eiwit3,4te ondersteunen. Daarom hebben we een strategie nodig die een effectief en permanent herstel van Dystrofine genexpressie kan bieden bij patiënten met DMD. De DMDMDX Mouse, een muismodel voor DMD, heeft een puntmutatie in Exon 23 van het Dystrofine gen dat een vroegtijdige beëindiging codon introduceert en resulteert in een niet-functioneel afgeknotte proteïne zonder het C-terminale dystroglycan bindings domein. Recente studies toonden het gebruik van crispr/Cas9 technologie aan om Dystrofine genexpressie te herstellen door nauwkeurige gencorrectie of Mutant Exon deletie in kleine en grote dieren5,6,7. Long et al.8 meldde de methode voor het corrigeren van de Dystrofine-genmutatie in DMDMDX -muis kiembaan door homologie-gestuurde reparatie (HDR) op basis van crispr/Cas9 genoom editing. El Refaey et al.9 meldde dat raav de Mutante Exon 23 in dystrofische muizen efficiënt kon accijns. In deze studies werden grna's ontworpen in de Intron 20 en 23 om dubbel gestrande DNA-onderbrekingen te veroorzaken, die de Dystrofine-expressie gedeeltelijk herstelde na DNA-herstel via niet-homologe eindverbindende (nhej). Nog spannender, Amoasii et al.10 meldde onlangs de werkzaamheid en haalbaarheid van raav-gemedieerde crispr Gene Editing in het herstellen van Dystrofine expressie in Canine modellen, een essentiële stap in toekomstige klinische toepassing.
DMD veroorzaakt ook stamcel aandoeningen11. Voor spier schade, residentiële spier stamcellen vullen stervende spiercellen na spier differentiatie. Echter, de opeenvolgende cycli van letsel en reparatie leiden tot verkorting van telomeren in spier stamcellen12, en vroegtijdige uitputting van stamcel groepen13,14. Daarom kan een combinatie van autologe stamceltherapie met genoom bewerking om Dystrofine expressie te herstellen een praktische benadering zijn voor de behandeling van DMD. De CRISPR/Cas9 technologie biedt de mogelijkheid om autologe genetisch gecorrigeerde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) te genereren voor functionele spier regeneratie en verdere complicaties van DMD te voorkomen zonder immuunafstoting te veroorzaken. Echter, iPSCs hebben een risico van tumorvorming, die kan worden verlicht door de differentiatie van iPSC in myogene voorlopercellen.
In dit protocol beschrijven we het gebruik van het niet-integrerende Sendai-virus om dermale fibroblasten van DMDMDX -muizen te herprogrammeren in ipscs en vervolgens Dystrofine-expressie te herstellen door crispr/Cas9 genoom verwijdering. Na validatie van Exon23 deletie in iPSC door genotypering, we onderscheiden genoom-gecorrigeerde iPSC in myogene voor ouders (MPC) via MyoD-geïnduceerde myogenic differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle behandelings-en chirurgische procedures voor dieren zijn uitgevoerd door een protocol dat is goedgekeurd door het Comité voor institutionele dierenverzorging en-gebruik van Augusta University (IACUC). Muizen werden gevoed standaard dieet en water ad libitum.
1. isolatie van primaire muizen fibroblasten van volwassen DMDMDX -muizen
- Euthanaatie volwassen DMDMDX muizen (mannelijk, 2 maanden oud) door co2 verstikking en Thoracotomie volgens iacuc goedgekeurd door Medical College of Georgia, Augusta University. Snijd de staart met een steriel scalpel in een steriele toestand onder de laminaire kap. Spoel de staart met 70% ethanol gedurende 5 minuten en was vervolgens met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een 6 cm schaal.
- Schil de staart huid af met een scherpe incisie van de basis naar de staart uiteinde langs de staart huid en schil de staart huid vervolgens zachtjes met een pincet. Breng de huid op een grootte van 1 mm3 met behulp van een steriel scalpel en verplaats het fijngehakte huid weefsel naar een 6 cm schaal in dulbecco's minimale essentiële medium/Ham's F12 (DMEM/F12) met 0,1% Collagenase IV en 1 U/ml dispase.
- Verteren het huid weefsel in een kweek schaal voor 2 uur bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 .
- Mantel een 6-goed plaat met fibronectine en 0,2% gelatine (1 mL fibronectine in 199 mL 0,2% gelatine; Tabel met materialen) en incuberen bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Dissociate het verteerde huid weefsel met een pipetpunt van 1 mL en breng het weefsel en de supernatant over in een steriele 15 mL conische centrifugebuis. Centrifuge bij 217 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 1,5 ml fibroblast medium (tabel met materialen).
- Kweek de pellets inclusief onvolledig verteerd huid weefsel uit stap 1,5 op de 6-put plaat gecoat met fibronectin en 0,2% gelatine uit stap 1,4 in een 37 °C, 5% CO2 incubator. Vervang het medium 24 h na de initiële plating om niet-bevestigde cellen te verwijderen, en verander het medium elke 48 h.
2. herprogrammering van muizen huid fibroblasten in iPSCs
- Twee dagen voor transductie, verteerbaar muis dermale fibroblasten uit stap 1,6 met de cel loslating oplossing (tabel van de materialen) in een 37 ° c incubator met een bevoficeerde atmosfeer van 5% Co2 gedurende 5 min.
- Tel cellen met een hemacytometer en Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 217 x g .
- Zaadcellen met een dichtheid van 1 − 2 x 105 cellen per put op een 6-well plaat en cultuur met fibroblast medium (tabel van de materialen) in een incubator van 37 °c met een bevoficeerde atmosfeer van 5% Co2.
- Op de dag van de transductie (dag 0), de cellen inschatten en het volume berekenen van elk virus dat nodig is om de doel multipliciteit van infectie (MOI) van 5, 5 en 3 (d.w.z. KOS MOI = 5, HC-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) volgens het commerciële handboek te bereiken.
- Ontdooit drie Sendai-buizen in een waterbad van 37 °C voor 5 − 10 s en voeg de berekende volumes van elk van de drie Sendai-buizen toe aan 1 mL fibroblast-medium (tabel met materialen).
- Verwijder het fibroblast-medium uit stap 2,3 en voeg het herprogrammeeringsvirus mengsel toe aan de putjes die de cellen bevatten. Incuberen de cellen 's nachts in een incubator van 37 °C met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2.
- Vervang het medium met verse fibroblast medium 24 h na transductie. Cultuur de cellen voor een week met middelgrote uitwisseling om de andere dag.
- Oogst geïnfecteerde muizen fibroblasten op dag 7 na transductie met 0,05% trypsine/EDTA en plaats op gerechten die eerder zijn bekleed met fibronectin en 0,2% gelatine.
- Cultuur de besmette muis fibroblasten uit stap 2,6 met volledige muis embryonale stamcel (ES) groeimedium (tabel van de materialen) in een 37 ° c incubator met een bevochtigen atmosfeer van 5% Co2 en verander het medium dagelijks.
- Observeer vanaf de 8e dag de plaat om de dag onder een omgekeerde Microscoop om de verschijning van celklonten te identificeren met de morfologie van muis ES.
3. met behulp van alkalische fosfatase Live Stain en flow flowcytometrieonderzoeken te kwantificeren herprogrammering efficiëntie
- Verwijder de kweekmedia van elke put en spoel af met DMEM/F-12 voor 2 − 3 min.
- Breng 2 mL 1x alkalische fosfatase (AP) levende vlek werkoplossing (1:500 verdunning in DMEM/F-12) aan op de aanhanger cellen en incureer in een incubator van 37 °C met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Aspireren de AP Live Stain en was tweemaal met PBS voor 5 min elk.
- Verwerk de cellen met de cel loslating oplossing (tabel met materialen) in een incubator van 37 °c met een bevoficeerde atmosfeer van 5% Co2 gedurende 5 min. Voer flow Cytometrie uit om de herprogrammatie efficiëntie te bepalen.
4. selecteren en oogsten van ES-achtige cellen
- Bestudeer de kolonies uit stap 2,8 onder een omgekeerde Microscoop.
- Markeer de kolonies aan de onderkant van de schaal met een object markering met zelf inkt.
- Pas ingevette kloon ringen toe om de gemarkeerde celkolonies te bedekken. Voeg gedurende 5 minuten 100 μL 0,05% trypsine/EDTA toe aan elke kloon ring bij 37 °C en breng de verteerde cellen vervolgens over met de pipetpunten van 100 μL naar 48-goed-kweek platen met mES-groeimedium.
- Incuberen de cellen in 48-goed cultuur platen in een incubator van 37 °C met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2. Passage van de cellen tot 6 cm schotel wanneer ze bereiken 70% samenloop.
- Herhaal de stappen 4,3 en 4,4 meerdere malen totdat uniforme slaapzaal-vormige klonen worden verkregen.
5. invriezen ipscs voor cryopreservatie
- Dissociëren de geselecteerde iPSCs uit stap 4,5 met trypsine, versene, en Chick plasma (TVP; Tabel met materialen) oplossing bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 gedurende 30 min.
- Verzamel de cellen in een steriele 15 mL conische buis en centrifugeer op 217 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant op en onderbreek de celpellet in 2 mL muis ES bevroren medium (tabel metmaterialen) om 1 ml per cryovial te verkrijgen.
- Voeg cellen toe aan cryoflesjes en Vries met behulp van een Vries container die de kritische, herhaalde-1 °C/min koelsnelheid biedt die nodig is voor cryopreservering bij-80 °C 's nachts.
- Breng bevroren flesjes over in een vloeibare stikstof tank.
6. immunofluorescentie kleuring voor stamcel markers in iPSCs
- Zaad iPSCs uit stap 5,1 gekweekt met mES medium in een 8-well kamer Slide bekleed met poly-D-Lysine/laminin (tabel van de materialen) op de juiste dichtheid te bereiken tussen 1 − 2 x 104 cellen per put en incueren in een 37 ° c incubator met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2 voor 48 h.
- Dompel de glaasjes in 4% formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en dompel de dia's in PBS twee keer gedurende 5 minuten bij elkaar.
- Inbroed delen met een muis IgG-blokkerende reagens (tabel met materialen) en 5% geit serum voor 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verdun de primaire antilichamen in eiwit verdunningsmiddel (Mouse-anti-SSEA1, 1:100, konijn-anti-nanog, 1:500; konijn-anti-POU klasse 5 Homeobox 1 [OCT4], 1:500; konijn-anti-sry-Box 2 [SOX2], 1:500; konijn-anti-Lin-28 homo A [Lin28A], 1:400) (tabel van Materialen). Breng antilichamen aan op de cellen en incuberen bij 4 °C 's nachts in een bevoficeerde kamer.
- Gooi de primaire antilichaam oplossing weg en was de dia's 3x in PBS.
- Breng tweede antilichamen aan (Alexa488-geconjugeerd geit-anti-muis antilichaam en Alexa555-geconjugeerde geit-anti-konijn, 1:400 elk) in M.O.M. proteïne verdunningsmiddel op dia's en inincuberen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de dia's 3x in PBS en monteer secties met afdekmedium met 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Maak Foto's met een confocale Microscoop.
7. onderzoek naar de pluripotentie van iPSCs in vivo
- Dissociëren de iPSCs van stap 5,1 in enkele cellen met behulp van TVP-oplossing in een 37 ° c incubator met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Tel cellen met een hemacytometer en Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 217 x g .
- Zuig het supernatant op en regeer de pellet met mES medium in een steriele centrifugebuis van 1,5 mL met een concentratie van 5 x 105 cellen/30 μL voor celtransplantatie.
- Verwijder het haar van beide achterpoten van immunodeficiënte muizen met behulp van haar tondeuses.
- Anesthetiseer muizen met ketamine (100 mg/kg) en reinig de injectieplaats met 75% alcohol.
- Injecteer 30 μL iPSC-suspensie uit stap 7,3 intramusculair in de gastrocnemii met een naald van 31 G.
- Twee weken na de injectie, oogst de muis gastrocnemii en insluiten in optimale snijtemperatuur (OCT) compound, snap bevriezen en gesneden in 5-μm secties15,16.
- Repareer secties in 4% formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en spoel de dia's vervolgens twee keer in PBS gedurende 5 minuten.
- Blokkeer de cellen met 5% geit serumproteïne verdunent voor 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg het verdunde primaire antilichaam toe (konijn anti-AFP, 1:50; konijn anti-SMA, 1:50; konijn anti-TH, 1:50) op de glaasjes en incuberen bij 4 °C 's nachts in een bevoficeerde kamer.
- Gooi de primaire antilichaam oplossing weg, was de cellen 3x (5 min/Wash) in PBS, voeg een 1:400 verdund Alexa555-geconjugeerd geit-anti-konijn antilichaam toe aan glijbanen en inincuberen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel dia's 3x (5 min/Wash) in PBS en monteer secties met een bevestigings medium dat DAPI bevat.
8. bouw van crispr/Cas9 lentivirale vector gericht op intron flankerende Dystrofine Exon 23
- Ontwerp twee paar grna oligos gericht op intron-geflankte Dystrofine Exon 23 via http://crispor.tefor.net/crispor.py.
Opmerking: de ontworpen paren zijn als volgt:
i22sense: 5 '-CACCGTtaagcttaggtaaaatcaa-3 '
i22anti-Sense: 5 '-AAACTtgattttacctaagcttaaC-3 '
i23sense: 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 '
i23anti-Sense: 5 '-AAACAgaaggtatgacacattactC-3 '). - Digest en defosforylaat 5 μg linviraal CRISPR plasmide (Lenti-CRISPRv2-Blast [een geschenk van Mohan Babu] en Lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [een geschenk van Kristen Brennand]) (tabel met materialen) met BsmB1/Esp3I gedurende 30 minuten bij 37 °c. Voeg voor 5 μg plasmiden 3 μL BsmB1-enzym, 3 μL snelle alkalische fosfatase, 6 μL 10x-enzym Digest-buffer en 0,6 μL 100 mM DTT bij een reactie van 60 μL) toe.
- Laad de reacties op een 0,8% agarose gel. Voer de gel gedurende 30 minuten uit bij 100 − 150 V.
- Reinig verteerd plasmide in-gel met behulp van een gel-extractie Kit (tabel met materialen) en elueer in 20 μL H2O.
- Fosforylaat en anneal elk paar van de gRNA oligonucleotiden bevattende 1 μL van elk oligonucleotide bij 100 μM, 1 μL van een ligatie buffer van 10x T4, 0,5 μL T4 polynucleotide kinase (PNK), 6,5 μL ddH2O bij 37 °c gedurende 30 min, en vervolgens 95 °c gedurende 5 min en vervolgens helling d eigen tot 25 °C bij 5 °C/min.
- Ligate a 1:200 verdunning van de gegloeide gRNA oligonucleotiden in de plentiCRISPR v2-Blast of plentiGuide-Hygro-iRFP670. Meng 50 ng van BsmB1/Esp3I verteerde vectoren met 1 μL verdunde oligo duplex en 5 μL 2x ligase buffer plus 1 μL ligase in een 11 μL reactiesysteem en incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voer de transformatie uit met 3 μL ligatie product in 50 μL bevoegde cellen (tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
- Verdeel de getransformeerde competente cellen in een agar-plaat met 100 μg/mL carbenicilinin en inincuberen bij 31,5 °C gedurende 18 uur.
- Kies kolonies met 10 μL steriele pipetpunten en-cultuur in 5 mL geweldige Bouillon (tafel van de materialen) met 100 μg/ml carbenicilinaan bij 31,5 °c, 185 rpm in een shaker-incubator voor 21 uur.
- Reinig het plasmide DNA met behulp van de mini-prep en MIDI-prep Kits (tabel van materialen).
- Controleer de mini-prep plasmiden door beperking spijsvertering. Voeg voor het reactiesysteem van 20 μL 1 μg plasmide DNA, 2 μL Digest-reactiebuffer (tabel met materialen) en 1 μl restrictie-enzym mengsel (0,5 μl KpnI-hf en 0,5 μl AGEI-HF voor plentiCRISPR v2-Blast-i22; 0,5 μl noti-hf en 0,5 ΜL EcoRI-HF voor plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23). Inincuberen van het reactiesysteem voor 1 uur bij 37 °C.
- Laad de reacties op een 0,8% agarose gel. Voer de gel gedurende 30 minuten uit bij 100 − 150 V.
Opmerking: de juiste banden voor plentiCRISPR v2-Blast-I22 moet 622 BP en 12,2 KB, en de juiste banden voor plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23 moet 2,6 KB en 7,1 KB.
9. lentivirale vector verpakkingen
- Cultuur 7 x 105 293ft cellen in 5 ml DMEM media met 10% foetaal runderserum in een schotel van 6 cm 's nachts bij 37 °c, 5% Co2.
- Bereid een cocktail (1 μg plenticrispr v2-Blast-I22 of plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng van psPAX2 verpakkings plasmide, 250 ng van pMD2. G envelop plasmide en 5 μl transfectie-reagens a [tabel van de materialen] in 100 μL van gereduceerde serum mem-media).
- Bereid een mengsel van 5 μL transfectie reagens B (tabel van de materialen) in 100 μL van gereduceerde serum mem-media.
- Voeg 100 μL transfectie reagens B-mengsel toe aan plasmide mengsel uit stap 9,2 en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het DNA-lipide complex (uit stap 9,4) druppelsgewijs naar de 293ft cellen. Incuberen 's nachts bij 37 °C met 5% CO2.
- Voeg virus productie Enhancer (500x) (tabel van de materialen) aan elk gerecht de volgende dag en incuberen voor 24 h bij 37 ° c, 5% Co2.
- Verzamel de komende twee dagen medium uit cellen met pipetten en filtreer het medium door een filter van 0,45 μm om de cellen te verwijderen.
10. concentratie en zuivering van linvirale vectoren
- Precipitaat lentivirale vector in het medium van stap 9,7 's nachts bij 4 ° c met 5x polyethyleenglycol 4000 (PEG4000, 8,5% eindconcentratie) en 4 M NaCl (0,4 M eindconcentratie).
- Centrifugeer de virale media met de PEG4000-oplossing bij 2.095 x g en 4 °c gedurende 30 minuten, verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Respendeer de pellets met 500 μL serum gereduceerde MEM media (lentivirus titer: Lenti-CRISPR v2-gRNAi22:1,56 x 108, Lenti-IRFP670-gRNAi23:1,3 x 108, Lenti-crispr v2-controle: 3,13 x 107, lenti-iRFP670-Control: 5,9 x 107 ). Bewaren bij-80 °C tot gebruik.
11. deletie van Exon 23 in muis iPSCs met twee Guide Rna's (gRNAs) in combinatie met Cas9
- Plaat de muis iPSCs uit stap 4,5 in een 24-put plaat gecoat met fibronectin en gelatine.
- Nadat de cellen 50% samenvloeiing bereiken, schakelt u over op het verse kweekmedium (volledige muis embryonale stamcel groeimedium) dat 8 μg/mL polybrene bevat).
- Voeg 100 μL van de lentivirale deeltjes oplossing uit stap 10,3 met inbegrip van Lenti-CRISPR v2-gRNAi22, Lenti-iRFP670-gRNAi23 en Control (lege Vector: Lenti-CRISPR v2, Lenti-iRFP670) aan muis iPSCs. Incuberen cellen gedurende 3 dagen bij 37 °C met 5% CO2.
- Selecteer stabiel geïnfecteerde cellen met media die 2,5 μg/mL blasticidin en 100 μg/mL hygromycine B bevatten door de minimale concentratie van blasticidin en hygromycine B te bepalen die nodig is om de niet-geïnfecteerde cel te doden.
Opmerking: un-geïnfecteerde cellen worden gedood door blasticidin en hygromycine B. - Verruim de geselecteerde muis iPSCs met 0,5 mL TVP-oplossing elk goed (24-goed plaat) en inincuberen van cellen gedurende 30 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
- Dissociëren de iPSCs in enkele cellen door pipetteren, cellen tellen met een cel telkamer en vervolgens verdunnen over 150 verteerde enkelvoudige cellen met mES medium in 10 cm schaal voor cultuur bij 37 °C met 5% CO2.
- Na ongeveer 10 dagen, kies enkele kolonies onder een omgekeerde Microscoop met 10 μL steriele pipetpunten (96 kolonies moeten worden geplukt).
- Breng de verzamelde kolonies in 50 μL TVP-oplossing elk goed (96-goed bord, één kolonie elk goed), verteren bij 37 °C gedurende 30 minuten, en zaai vervolgens de geverteerde cellen in 2 96-goed cultuur platen om de cultuur te behouden (een voor genotypering).
- Incuberen in een CO2 -incubator bij 37 °c tot 70% Confluent.
12. identificatie van iPSC-kolonies met exon23 deletie
- Verwijder het medium in 96-well plate wanneer de celkolonies 70% samenloop bereiken.
- Voeg aan elk goed 25 μL lysisreagens (tabel met materialen) met proteïinase k-oplossing (1 ml proteïnase k in 100 ml lysisreagens) toe en breng het lysaat over naar een 96-goed PCR-plaat.
- Sluit de PCR-plaat af en inbroed de platen gedurende 30 minuten bij 55 °c, en vervolgens bij 95 °c gedurende 45 min om de cellen te lyseren en de proteïnase K te denatureren.
- Voer PCR-reactie uit met 2 μL lysaat uit stap 12,3. Voeg voor de PCR-reactie van 20 μL 2 μL lysaat, 10 μL van 2x DNA-polymerase premix (tabel van materialen), 7 μl DNase-vrij water en 1 ΜL DMD-Exon 23 primers (tabel 1) toe.
- Gebruik de volgende parameters voor PCR-reactie: 98 °C gedurende 1 minuut, 35 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 30 sec. en een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 1 minuut.
- Laad de PCR-reactie op een 2% agarose gel. Voer de gel gedurende 30 minuten uit bij 100 − 150 V.
- Inspecteer de gel onder UV-licht (de afdek efficiëntie is 3/94).
13. gebruik van het Tet-on MyoD activeringssysteem om iPSC direct te differentiëren in myogene voorlopercellen (MPC)
- Verpak de LV-TRE-VP64-Mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 en LV-TRE-VP16 muis MyoD-T2A-dsRedExpress2 (een geschenk van Charles Gersbach) (tabel met materialen) zoals eerder beschreven voor Lenti-CRISPRv2-blast en Lenti-grna-iRFP670 vectoren in secties 9 en 10.
- Infecteren muis iPSC met lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 of lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 zoals eerder beschreven voor Lenti-CRISPRv2-blast en Lenti-gRNA-iRFP670 vectoren in stappen 11.1 − 11.3.
- Selecteer cellen met 1 μg/mL puromycine na drie dagen infectie om een zuivere getransduceerde celpopulatie te verkrijgen.
- Voeg 3 μg/mL doxycycline toe aan kweekmedia (10% FBS DMEM) aan MPC-differentiatie. Vervang vers medium, aangevuld met doxycycline, elke twee dagen.
14. kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR voor het evalueren van dynamische spier differentiatie en DMD Exon 22-24-expressie
- Extract cellulaire RNA na 0, 3, 6, en 10 dagen na behandeling met doxycycline met behulp van RNA isolatie reagens, eerbieding transcriberen RNA in cDNA met behulp van eerste streng cDNA synthese Kit (tabel van materialen).
- Voeg voor het qPCR-reactiesysteem van 20 μL 1 μL cDNA, 10 μL PCR-reactiebuffer (tabel met materialen), 8 μl DNA H2O en 1 μl mengsel van voorwaartse en omgekeerde primers (Glyceraldehyde-3-fosfaat DEHYDROGENASE [gapdh], skeletspieren [ACTA1], OCT4 en DMD-exon22, DMD-exon23 en DMD-exon24, Zie tabel 1).
- Gebruik de volgende parameters voor PCR-reactie: 50 °C gedurende 2 min, 95 °C gedurende 2 min, 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 1 minuut, smelt curve 65,0 °C tot 95,0 °C, toename 0,5 °C.
15. immunofluorescentie kleuring van myosin Heavy Chain 2 (MYH2) en Dystrofine eiwit expressie
- Plaat doxycycline-geïnduceerde, Lenti-TRE-MyoD gemodificeerde cellen van stap 13,4 op 8-well cultuur dia's.
- Repareer de cellen in 4% formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en spoel de dia's vervolgens twee keer in PBS gedurende 5 minuten.
- Blokkeer de cellen met 5% geit serumproteïne verdunent voor 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg konijn-anti-Dystrofine antilichaam (1:300) en Mouse-anti-MYH2 antilichaam (1:100) toe aan de glijbanen, inbroed bij 4 °C 's nachts in een bevoficeerde kamer.
- Gooi de primaire antilichaam oplossing weg, was de cellen 3x (5 min/Wash) in PBS, voeg 1:400 verdunde Alexa488-geconjugeerde geit-anti-konijn antilichamen en Alexa555-geconjugeerd geit-anti-muis antilichaam toe aan glijbanen en inincuberen voor 45 min bij kamertemperatuur.
- Was de dia's 3x (5 min/Wash) in PBS en monteer secties met een bevestigings medium met DAPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprichting van DMDMDX -huid fibroblasten afgeleid IPSC. We toonden de efficiëntie van het genereren van muis iPSCs van DMDMDX muizen afgeleide huid fibroblast met behulp van de integratie-vrije herprogrammering vectoren. Figuur 1a toonde aan dat de verschijning van embryonale stamcel (ESC)-achtige kolonies op drie weken na infectie. We evalueren de efficiëntie van iPSC-inductie door Live alkalische fosfatase (AP) vlek; Afbeelding 1B toont aan dat het percentage van AP-positieve cellen rond 1,8% door FACS analyse was. SSEA1, Lin28, nanog, OCT4 en SOX2, pluripotentie markers voor muis embryonale stamcellen, waren positief voor iPSC-kolonies door immunofluorescentie kleuring (figuur 1c). Om te onderzoeken de drie kiembaan differentiatie van ipscs in vivo, we intramusculair geïnjecteerd ipscs in de muis gastrocnemii. We hebben geconstateerd dat de geïnjecteerde iPSCs gedifferentieerd in levercellen (endoderm), gladde spiercellen (mesoderm), en adrenergic neuron cellen (Ectoderm) (figuur 1d), aantonende de pluripotentie van ipscs.
Crispr/Cas9-gemedieerde exon23 deletie. We ontwierpen twee geleiderrna's die de Mutant Exon 23 flankeren. Na Cas9-gemedieerde dubbelwandige pauzes (DSB) en niet-homologe eindverbindende (NHEJ) werd Mutant Exon 23 geschrapt, waardoor een afgeknotte maar functionele Dystrofine productie mogelijk was (Figuur 2a). Om Exon 23 verwijderde muis iPSC te identificeren, werden de cellen dun geseerd en werden individuele kolonies verzameld en gekweekt. Genomische Dna's die uit deze kolonies zijn geëxtraheerd, werden onderworpen aan PCR-genotypering. Figuur 2b toonde aan dat kolonie #1 en #2 Exon 23 deleties hebben die wijzen op een succesvolle verwijdering van de Exon 23.
Het differentiëren van de muis iPSCs in een myogene afstamming en het herstellen van Dystrofine expressie. We gebruiken een tetracycline-inducible MyoD-expressie systeem om myogene differentiatie van iPSCs te induceren. Doxycycline werd gebruikt voor het opwekken van MyoD-expressie in iPSCs. Figuur 3a toont het tijdsverloop van de spier differentiatie in met Dox behandelde ipscs. qRT-PCR toonde aan dat het mRNA-niveau van OCT4, een pluripotente marker, geleidelijk daalde, terwijl de expressie van ACTA1, een skeletspier marker, steeg na Dox-inductie. Ook hebben we de myotubes vorming waargenomen na twee weken na de behandeling met Dox (Figuur 3b). Belangrijk is dat de qRT-PCR-test het herstel toonde van DMD Exon 24 mRNA-expressie in Dox-geïnduceerde, Cas9-gemedieerde Exon23 verwijderde lijn in vergelijking met Cas9-controle lijn (figuur 3c). In strijd met qRT-PCR toont immunofluorescentie kleuring de Dystrofine proteïne expressionin Cas9-gemedieerde Exon 23 verwijderde cellen, terwijl de Dystrofine expressie afwezig was in de controle cellen (figuur 3D).
Figuur 1: herprogrammering van huid fibroblasten van DMDMDX -muizen in ipscs.
A) representatief beeld van es-achtige kolonies (schaalbalk = 200 μm). (B) FACS analyse van de herprogrammering van de efficiëntie van muizen huid fibroblasten in ipscs na 8 dagen van Sendai virus transductie door Live AP-kleuring. C) immunofluorescentie KLEURING van SSEA1, Lin28, nanog, OCT4 en SOX2 in ipscs (schaalbalk = 50 μm). D) immunofluorescentie kleuring voor AFP (endoderm), SMA (mesoderm) en tyrosine hydrolase (th) (Ectoderm) van Teratoom 2 weken na de injectie met IPSC in gastrocnemii (schaalbalk = 20 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: CRISPR/Cas9-gemedieerde exon23 deletie.
A) Schematische voorstelling van crispr/Cas9-gemedieerde Exon 23 verwijderingen. De Cas9 Nuclease richt zich op intron 22 en intron 23 door twee Grna's. Dubbel gestrande pauzes (DSBs) door Cas9 resulteert in de excisie van de Mutant Exon 23. De distale uiteinden worden gerepareerd door niet-homologe eindverbindende (nhej), wat resulteert in de restauratie van het Lees frame van het Dystrofine gen. B) PCR-genotypering analyse van Exon 23. De pijl geeft het PCR-product van Exon 23 aan. GAPDH dient als referentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: differentiëren de iPSCs van de muis in de myogene afstamming en het herstellen van Dystrofine expressie.
(A) QRT-PCR toonde de tijdsduur van mRNA-niveau van OCT4 en ACTA1 in met Dox behandelde Exon 23-deleted DMDMDX IPSC (* P < 0,05 VS D0, D6, D10, #P < 0,05 VS D0, D3, D10, $P < 0,05 VS D0, D3, D6, n = 4 voor Oct4) (* P < 0,05 VS D6 en D10 , #P < 0,05 VS D0, D3 en D10, $P < 0,05 VS D0, D3 en D6, n = 3 voor ACTA1). (B) links: representatief beeld van myobuis vorming van Dox-geïnduceerde muis ipscs (schaalbalk = 200 μm). Rechts: immunofluorescentie analyse van MYH2 in myobuis vorming van Dox-geïnduceerde muis iPSCs (schaalbalk = 20 μm). C) bovenste: de PCR-primer posities voor DMD Exon22, Exon23 en Exon24; Bodem: qRT-PCR-analyse van het mRNA-niveau van DMD-Exon22, Exon23 en Exon24-expressie in MPC (* * * * P < 0,0001, n = 3). D) immunofluorescentie analyse van Dystrofine-expressie in Dox-geïnduceerde mpc van IPSCcas9-CTRL en IPSCcas9-grna (schaalbalk = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Gids primers | |
| I22 Sense | 5 '-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA-3 ' |
| I22 antisense | 5 '-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3 ' |
| i23 Sense | 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 ' |
| I23 antisense | 5 '-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3 ' |
| PCR-primers | |
| OCT4-forward | 5 '-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA-3 ' |
| OCT4-achteruit | 5 '-TCTCATTGTTGTCGGCTTCCTCCA-3 ' |
| ACTA1-forward | 5 '-GATCCATGAGACCACCTACAAC-3 ' |
| ACTA1-achteruit | 5 '-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3 ' |
| Exon22-forward | 5 '-TTACCACCAATGCGCTATCA-3 ' |
| Exon22-achteruit | 5 '-CCGAGTCTCTCCTCCATTATTTC-3 ' |
| Exon23-forward | 5 '-CCAAGAAAGCACCTTCAGAAATATG-3 ' |
| Exon23-achteruit | 5 '-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3 ' |
| Exon24-forward | 5 '-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3 ' |
| Exon24-achteruit | 5 '-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3 ' |
| GAPDH-forward | 5 '-TGACAAGCTTCCCATTCTCG-3 ' |
| GAPDH-achteruit | 5 '-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3 ' |
Tabel 1: grondlaag volgorde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Duchenne spierdystrofie (DMD) is een destructieve en uiteindelijk fatale erfelijke aandoening die wordt gekenmerkt door een gebrek aan Dystrofine, wat leidt tot progressieve spieratrofie1,2. Onze resultaten tonen de herstelde Dystrofine genexpressie in DMDMDX IPSC-afgeleide myogene voorlopercellen door de aanpak van crispr/Cas9-gemedieerde exon23 deletie. Deze aanpak heeft drie voordelen.
Eerst genereerden we iPSCs van DMDMDX -muizen afgeleide dermale fibroblasten met behulp van een niet-geïntegreerde RNA-vector. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld voor het genereren van iPSCs, zoals lentivirale en retrovirale vectoren, die in gastheer-chromosomen zullen worden geïntegreerd om herprogrammeeringsgenen te uiten, waardoor veiligheidsproblemen ontstaan. DNA-gebaseerde vectoren zoals plasmide vectoren, adeno-geassocieerde virussen en adenovirussen bestaan op een niet-geïntegreerde manier; ze kunnen echter nog steeds met een lage frequentie in het hostchromosoom worden geïntegreerd. In deze studie gebruikten we een gemodificeerd, niet-overdraagbaar Sendai-virus, een niet-geïntegreerde RNA-vector, om stamcel transcriptiefactoren veilig en effectief te leveren aan fibroblasten voor herprogrammering.
Vervolgens gebruiken we CRISPR-gemedieerde genoom verwijdering, in plaats van CRISPR/Cas9-gemedieerde precisie-gencorrectie, om Dystrofine-expressie in iPSCs te herstellen. Deze methode is haalbaar en efficiënt; het is gemakkelijk om meerdere Grna's te ontwerpen om meerdere Mutante exonen te verwijderen, die optreden bij veel humane DMD-patiënten17. Exon deletie maakt gebruik van een relatief efficiënte niet-homologeuze end-verbindingsweg, en de methode vermijdt ook de noodzaak om een DNA-reparatie sjabloon te leveren. Daarom is, in vergelijking met Cas9-gemedieerde precisie correctie, Cas9 – gemedieerde Exon deletie geschikt voor DMD-patiënten met meerdere genmutaties.
Ten slotte induceren we ongedifferentieerde iPSCs in myogene voorlopercellen, wat het risico op tumorigenese veroorzaakt door iPSCs kan verminderen. In dit protocol hebben we myod expressie geïnduceerd via een induceerbaar tetracycline-gereguleerd (tet-on) vector systeem om ipscs te differentiëren naar skeletspier voorlopercellen18,19.
Concluderend kan de combinatie van CRISPR/Cas9 genoom Editing met Tet-on MyoD activeringssysteem een veilige, haalbare en efficiënte strategie bieden voor de Mutant DMD-Exon23 deletie in stamcellen voor celtransplantatie bij DMD-patiënten.
Om ES-achtige cellen efficiënt te selecteren en te oogsten, moeten we de ongedifferentieerde iPSC-cellen identificeren via hun koepel achtige morfologie, en een inkt voorwerp marker kan ons helpen bij het labelen van individuele klonen van de bodem van de cultuur schotel met een cirkel van 1,8 mm rond de iPSC Klonen. Om lekkage van trypsine-oplossing te voorkomen, moeten we vet gelijkmatig op de onderkant van de ringen aanbrengen. Ook, na het plaatsen van de vet-gecoate ringen op de top van de gelabelde celkolonies, moet worden genomen om de ringen niet aan te raken. Anders worden de klonen van iPSC losgekoppeld.
Het protocol heeft zijn beperkingen; We kozen bijvoorbeeld voor een niet-geïntegreerd RNA vector systeem om iPSCs te genereren. We gebruikten echter een linviraal CRISPR/Cas9 systeem om DMD Exon 23 te verwijderen en een op linviraal gebaseerd MyoD activeringssysteem om de myogene differentiatie van iPSC te induceren; Deze integratieve linvirale vectoren hebben veiligheidsproblemen. Echter, deze problemen kunnen worden opgelost door de toepassing van een RiboNucleoProteïne (RNP) complex bestaande uit een recombinant, hoge zuiverheid S. pyogenes Cas9 Nuclease met een crrna: tracrrna duplex; We kunnen kiezen voor chemisch gemodificeerde MyoD mRNA transfectie om iPSCs direct te differentiëren in myogene voorlopercellen, hoewel de efficiëntie een uitdaging kan zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Tang en Weintraub werden deels ondersteund door NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
