Summary
여기서, 우리는Dmdmdx 마우스 유래 피부 섬유아세포로부터 iPSC에서 디스트로핀 발현을 복원하고 Tet-on MyoD 활성화 시스템을 사용하여 iPSC를 myogenic 전구 세포(MPC)로 직접 분화하는 Cas9 기반 exon23 결실 프로토콜을 제시한다.
Abstract
Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 궁극적으로 근육 전구 세포의 고갈로 이끌어 내는 dystrophin 유전자에 있는 돌연변이에 기인한 가혹한 진보적인 근육 질병입니다. 클러스터된 정기적으로 연속된 짧은 palindromic 반복/CRISPR 관련 9 (CRISPR/Cas9) 유전자 편집은 디스트로핀 유전자의 발현을 회복시킬 수 있는 잠재력을 갖는다. 자가성 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)-유래 근육 전구 세포 (MPC)는 줄기 / 전구 세포 풀을 보충하고 손상을 복구하며 면역 반응을 일으키지 않고 DMD에서 추가 합병증을 예방 할 수 있습니다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 및 비통합 iPSC 기술의 조합을 도입하여 회복된 디스트로핀 단백질 발현을 가진 근육 선조를 얻습니다. 간략하게, 우리는 Dmdmdx 마우스의 진피 섬유아세포로부터 iPSC 라인을 확립하기 위해 비통합 센다이 벡터를 사용합니다. 그런 다음 CRISPR/Cas9 결실 전략을 사용하여 재프레임된 디스트로핀 유전자의 비상동성 말 결합을 통해 디스트로핀 발현을 복원합니다. 94개의 iPSC 콜로니에서 3개의 콜로니에서 exon23 고갈의 PCR 검증 후, 우리는 근육 분화 조절에 중요한 역할을 하는 주요 전사 인자인 MyoD의 독시사이클린(Dox)-유도 발현에 의해 iPSC를 MPC로 분화합니다. 우리의 결과는 DMD의 처리를 위한 미래 치료를 개발하기 위한 중요한 잠재력을 가지고 있는 iPSC 파생된 MPC에 있는 dystrophin 표현을 복구하기 위하여 CRISPR/Cas9 삭제 전략을 사용하는 타당성을 보여줍니다.
Introduction
Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 가장 일반적인 근 이영양증의 한개이고 전세계 대략 5,000명의 신생아 소년의 1에 영향을 미치는 dystrophin의 부재에 의해 특징입니다1. 디스트로핀 유전자 기능의 손실은 진보적 인 myofibers 변성으로 이어지는 구조적 근육 결함을초래1,2. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)-매개 유전자 치료 시스템은 마이크로 디스트로핀(μ-Dys)을 이용한 유전자 교체와 같은 디스트로핀 발현을 복원하고 근육 기능을 향상시키는 것으로 시험되었다. 그러나, rAAV 접근법은 기능성 단백질3,4의발현을 유지하기 위해 반복주사를 요구한다. 따라서, 우리는 DMD를 가진 환자에 있는 dystrophin 유전자 발현을 효과적이고 영구적으로 복구할 수 있는 전략이 필요합니다. DMD를 위한 마우스 모델인Dmdmdx 마우스는, 조기 종결 코동을 도입하고 C 말단 디스트로글리칸 결합 도메인이 결여된 비기능성 잘린 단백질을 초래하는 디스트로핀 유전자의 엑소(23)에서 포인트 돌연변이를 갖는다. 최근 연구는 크고 작은동물5,6,7에서정확한 유전자 보정 또는 돌연변이 엑시온 결실에 의해 디스트로핀 유전자 발현을 복원하는 CRISPR/Cas9 기술의 사용을 입증하였다. Long etal.8은 상동성 지향 수리(HDR) 기반 CRISPR/Cas9 게놈 편집에 의해Dmdmdx 마우스 생식선에서 디스트로핀 유전자 돌연변이를 교정하는 방법을 보고했다. 엘 레페이 외9 는 rAAV가 영양 실조 마우스에서 돌연변이 엑슨 23을 효율적으로 소비 할 수 있다고보고했다. 이 연구 결과에서, gRNAs는 비 상동성 끝 접합을 통해 DNA 복구 후에 디스트로핀 발현을 부분적으로 복구하는 이중 좌초된 DNA 중단을 일으키는 원인이 되기 위하여 인트론 20 및 23에서 디자인되었습니다 (NHEJ). 더욱 흥미진진한, Amoasii 등10은 최근 개 모델에서 디스트로핀 발현을 복원하는 데 있어 rAAV 매개 CRISPR 유전자 편집의 효능 및 타당성을 보고했으며, 이는 향후 임상 적용에 필수적인 단계이다.
DMD는 또한 줄기 세포 무질서(11)를일으키는 원인이 됩니다. 근육 손상에 대 한, 주거 근육 줄기 세포 근육 분화 후 죽어가는 근육 세포를 보충. 그러나, 상해 및 수리의 연속적인 주기는 근육 줄기 세포(12)에서텔로미어의 단축으로 이어지고, 줄기 세포 풀의 조기 고갈13,14. 따라서, 디스트로핀 발현을 복원하기 위한 게놈 편집과 자가 줄기 세포 요법의 조합은 DMD 를 치료하기 위한 실용적인 접근법이 될 수 있다. CRISPR/Cas9 기술은 기능적인 근육 재생을 위해 자가 수정된 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하고 면역 거부를 일으키지 않으면서 DMD의 추가 합병증을 예방할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나, iPSCs는 myogenic 전구 세포로 iPSC의 분화에 의해 완화될 수 있던 종양 대형의 리스크가 있습니다.
이 프로토콜에서는Dmdmdx 마우스의 진피 섬유아세포를 iPSCs로 재프로그래밍한 다음 CRISPR/Cas9 게놈 삭제에 의한 디스트로핀 발현을 복구하기 위해 비통합 Sendai 바이러스의 사용을 설명합니다. 유전자 형이 나는 에 의해 iPSC에서 Exon23 삭제의 검증 후, 우리는 MyoD 유도 myogenic 분화를 통해 myogenic 선조 (MPC)로 게놈 보정 iPSC를 분화.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 취급 및 외과 적 절차는 오거스타 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜에 의해 수행되었다. 마우스는 표준 식이요법과 물 광고 리비텀을 공급하였다.
1. 성인 Dmdmdx 마우스에서 기본 마우스 섬유 아세포의 격리
- 조지아 의과 대학에 의해 승인 IACUC에 따라 CO2 질식 및 흉부 절제술에 의해 성인 Dmdmdx 마우스 (남성, 2 개월) 안락사 오거스타 대학. 라미나 후드 에서 멸균 상태에서 멸균 메스로 꼬리를 잘라. 꼬리를 70% 에탄올로 5분 간 헹구고, 멸균 인산완충식염수(PBS)로 6cm 접시에 씻습니다.
- 꼬리 피부를 따라 밑면에서 꼬리 끝까지 날카로운 절개로 꼬리 피부를 벗겨낸 다음 핀셋으로 꼬리 피부를 부드럽게 벗깁니다. 멸균 된 메스를 사용하여 1mm3 의 크기로 피부를 다진 피부 조직을 덜베코의 최소 필수 매체 / 햄의 F12 (DMEM / F12)에서 6cm 접시로 옮기고 0.1 % 콜라게 나아제 IV 및 1 U / mL의 디스파스를 함유합니다.
- 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 2시간 동안 배양 접시에 피부 조직을 소화한다.
- 피브로넥틴과 0.2% 젤라틴(0.2% 젤라틴의 199 mL에서 1 mL의 피브로넥틴)을 가진 6웰 플레이트를 코팅하는 경우; 재료 표) 1 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 1 mL 파이펫 팁으로 소화 된 피부 조직을 해리하고 조직을 멸균 된 15 mL 원소 원심 분리 튜브로 옮기십시오. 217 x g에서 실온에서 3 분 동안 원심 분리기를 폐기하고 섬유 아세포 배지의 1.5 mL(재료 표)에서펠릿을 다시 놓습니다.
- 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 1.4단계에서 섬유넥틴및 0.2% 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트에서 1.5단계로부터 불완전소화된 피부 조직을 포함하는 펠릿을 배양하였다. 초기 도금 후 배지 24h를 교체하여 부착되지 않은 전지를 제거하고 매 48시간마다 배지를 변경한다.
2. 마우스 피부 섬유아세포를 iPSCs로 재프로그래밍
- 2일 전, 5%CO2의 가습 된 분위기로 37°C 인큐베이터에서 세포 분리 용액(표 의물질)으로1.6단계에서 마우스 진피 섬유아세포를 5분 동안 소화한다.
- 혈소계와 원심분리기를 사용하여 세포를 3분 동안 217 x g로 계산합니다.
- 종자 세포는 1-2 x10의 밀도로 잘 6웰 플레이트상에 및 섬유아세포배지(Table of Materials)를배양하여 5%CO2의가습된 분위기의 인큐베이터에서 배양한다.
- 트랜스덕션의 날(0일째)에, 세포를 추정하고 5, 5 및 3의 표적 감염 복합성(MOI)에 도달하는 데 필요한 각 바이러스의 부피를 계산한다(즉, KOS MOI = 5, hc-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) 상용 매뉴얼에 따른다.
- 37°C의 수조에서 센다이 튜브 3개(5~10s)를 해동하고 센다이 튜브 3개각각의 계산된 부피를 섬유아세포 배지 1 mL에 추가합니다(재료표).
- 2.3단계에서 섬유아세포 배지를 제거하고 세포를 함유하는 웰에 리프로그래밍 바이러스 혼합물을 첨가한다. 5%CO2의가습 된 분위기와 함께 37 °C 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양.
- 환납 후 24시간 후에 배지를 신선한 섬유아세포 배지로 교체하십시오. 세포에 1주일 동안 배지 교환을 매일 배양한다.
- 감염된 마우스 섬유아세포는 0.05% 트립신/EDTA로 전환한 후 7일째에 수확하고 이전에 피브로넥틴과 0.2% 젤라틴으로 코팅된 접시에 놓습니다.
- 감염된 마우스 섬유아세포를 완전한 마우스 배아줄기세포(ES)성장배지(표)로2.6단계에서 배양하여 37°C 인큐베이터에서 5%CO2의 가습된 대기를 가지며 배지를 매일 변화시켰다.
- 8일째부터, 마우스 ES의 형태와 세포 덩어리의 모양을 확인하기 위해 매일 거꾸로 현미경으로 플레이트를 관찰.
3. 알칼리 성 인산염 살아있는 얼룩 및 유세포 측정을 사용하여 재프로그래밍 효율을 정량화
- 각 우물에서 배양 배지를 제거하고 DMEM/F-12로 2-3분 동안 헹구어 내주세요.
- 1x 알칼리성 인산염 (AP) 살아있는 얼룩 작업 용액 (DMEM / F-12에서 1 : 500 희석)의 2 mL을 부착 하고 37 °C 인큐베이터에서 30 분 동안 5 %CO2의 가습 된 분위기로 인큐베이터합니다.
- AP 라이브 얼룩을 흡인하고 각각 5 분 동안 PBS로 두 번 씻으하십시오.
- 세포 분리용액(표)을5분 동안 5%CO2의 가습 된 분위기로 37 °C 인큐베이터에서 세포를 소화시고 재프로그래밍 효율을 결정합니다.
4. ES와 같은 세포 선택 및 수확
- 반전된 현미경으로 2.8단계에서 콜로니를 검사합니다.
- 접시 하단에 식민지를 자체 수동 개체 마커로 표시합니다.
- 표시된 세포 콜로니를 덮기 위해 기름을 바른 복제 링을 적용합니다. 100 μL의 0.05% 트립신/EDTA를 각 복제 링에 5분 동안 37°C로 추가한 다음, 100 μL 파이펫 팁으로 소화된 세포를 mES 성장 배지를 함유하는 48웰 배양 플레이트로 옮김을 옮김을 더합니다.
- 5%CO2의가습 된 분위기와 37 °C 인큐베이터에서 48 웰 배양 플레이트에서 세포를 배양. 70% 합류에 도달할 때 6 cm 접시에 세포를 통로.
- 균일한 기숙사 모양의 클론이 얻을 때까지 4.3 단계와 4.4 단계를 여러 번 반복합니다.
5. 동결 보존을위한 동결 iPSCs
- 트립신, 구절 및 병아리 플라즈마 (TVP) 4.5 단계에서 선택한 iPSCs를 해리; 재료 표) 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 30분 동안 용액을
- 실온에서 3분 동안 217 x g에서 멸균 된 15 mL 원엽 튜브 및 원심 분리기에 세포를 수집합니다.
- 상월체를 흡인하고 마우스 ES 냉동배지(Table of Materials)의2 mL에서 세포 펠릿을 다시 현탁하여 저온 당 1 mL을 얻었다.
- 하룻밤 동안 -80°C에서 냉동 보존에 필요한 중요하고 반복적인 -1°C/min 냉각 속도를 제공하는 냉동 용기를 사용하여 저온 제거에 세포를 추가하고 동결합니다.
- 냉동 바이알을 액체 질소 탱크로 옮김.
6. iPSCs에서 줄기 세포 마커에 대한 면역 형광 염색
- 5.1단계에서 mES 배지로 배양된 종자 iPSCs를 폴리-D-리신/라미닌으로 코팅된 8웰 챔버슬라이드(표)로코팅하여 웰당 1-2 x 104개의 세포를 달성하고 37°C 인큐베이터로 인큐베이터를 배양하여 적절한 밀도로 48 시간 동안 5 % CO2의 가습 분위기.
- 실온에서 15 분 동안 4 % 포름알데히드에 슬라이드를 담그고 매번 5 분 동안 PBS에 두 번 담그십시오.
- 마우스 IgG 차단 시약(재료의 표)와배양 섹션, 실온에서 1 시간 동안 5 % 염소 혈청.
- 희석단백질의 1차 항체를 희석(마우스-항-SSEA1, 1:100, 토끼 안티-나노, 1:500; 토끼 안티 POU 클래스 5 홈 박스 1 [OCT4], 1:500; 토끼 안티 SRY-box 2 [SOX2], 1:500; 토끼 안티 린-28 호모로그 A [Lin28A], 1:400 재료)를참조하십시오. 세포에 항체를 도서하고 가습 된 챔버에서 밤새 4 °C에서 배양하십시오.
- 1차 항체 용액을 버리고 슬라이드를 PBS에서 3배 세척합니다.
- M.O.M. 단백질 희석제에 두 번째 항체(Alexa488-컨쥬게이트 염소-항마우스 항체 및 Alexa555-컨쥬게이션 염소 항 토끼, 각각 1:400)를 바르고 실온에서 45분 동안 배양합니다.
- 4'6-디아미디노-2-페니린들레(DAPI)를 포함하는 마운팅 매체로 PBS에서 슬라이드를 3배 세척하고 장착 섹션을 장착합니다.
- 공초점 현미경으로 사진을 찍습니다.
7. 생체 내에서 iPSCs의 다능성 조사
- 37°C 인큐베이터에서 TVP 용액을 사용하여 5.1단계에서 iPSCs를 단일 세포로 해리하고 30분 동안 5%CO2의 가습 된 분위기를 갖는다.
- 혈소계와 원심분리기를 사용하여 세포를 3분 동안 217 x g로 계산합니다.
- 상월체를 흡인하고 세포 이식을 위한 5 x 105 세포/30 μL의 농도로 1.5 mL 멸균 원심분리기 튜브에서 mES 배지로 펠릿을 재중단한다.
- 이발기를 사용하여 면역 결핍 마우스의 양쪽 뒷다리에서 머리카락을 제거하십시오.
- 케타민 (100 mg/kg)으로 마우스를 마취시키고 75 % 알코올로 주사 부위를 청소하십시오.
- 31 G 바늘을 사용하여 위프나미에 7.3 단계에서 iPSC 현탁액 30 μL을 주입합니다.
- 주사 2주 후, 마우스가 가스트로크나이를 수확하고 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물에 내장하고, 스냅 동결 및 5-μm 섹션15,16으로절단한다.
- 실온에서 15 분 동안 4 % 포름알데히드로 섹션을 고정 한 다음 매번 PBS에서 슬라이드를 두 번 세척하십시오.
- 실온에서 1 시간 동안 5 % 염소 혈청 단백질 희석제로 세포를 차단합니다.
- 희석된 1차 항체(토끼 항-AFP, 1:50; 토끼 항-SMA, 1:50; 토끼 항-TH, 1:50)를 슬라이드에 넣고 4°C에서 밤새 인큐베이션하여 가습된 챔버에서 배양한다.
- 1차 항체 용액을 버리고, PBS에서 세포를 3x(5분/세척)로 세척하고, 1:400 희석된 Alexa555-컨쥬게이트 염소-토끼 항체를 슬라이드에 넣고 실온에서 45분 동안 배양한다.
- PBS에서 3x(5분/세척)의 슬라이드를 세척하고 DAPI가 포함된 장착 매체로 섹션을 장착합니다.
8. CRISPR/Cas9 렌티바이러스 벡터 타겟팅 인트론 측면 디스트로핀 엑손 23
- http://crispor.tefor.net/crispor.py 통해 인트론 측면 디스트로핀 엑손 23을 대상으로 gRNA 올리고2 쌍을 디자인하십시오.
참고: 디자인된 쌍은 다음과 같습니다.
i22sense: 5'-CACCGTTAAGTAGGTAAAAA- 3'
i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTACCTAAGTAC-3'
i23센스: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTCT- 3'
i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGATATATATATACTC-3'). - 렌티바이러스 CRISPR 플라스미드 5 μg (렌티-CRISPRv2-blast [모한바부의 선물] 및 렌티-가이드-하이그로-iRFP670 [크리스틴 브레넌드로부터의 선물])(재료표)와BsmB1/Esp3I를 30분 동안 37°C에서. 플라스미드 5 μg의 경우, BsmB1 제한 효소 3 μL, 빠른 알칼리성 인산염 3 μL, 10x 효소 다이제스트 완충액 6 μL, 60 μL 반응에서 100 mM DTT의 0.6 μL을 추가합니다.
- 반응을 0.8% 아가로즈 젤에 로드합니다. 젤을 100-150 V에서 30분 동안 실행합니다.
- 젤 추출키트(표 재료)를이용하여 소화된 플라스미드 인젤을 정화하고H2O의 20 μL에서 용루한다.
- 인산화및 어닐각 쌍의 gRNA 올리고뉴클레오티드각각 100 μM, 10x T4 결찰 완충제의 1 μL, 0.5 μL의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK), 37°C에서 ddH 2 O의 6.5 μL, 그리고 30분 동안 5°C의 ddH 2 O를 각각 100 μM, 100μL, 1μL의 t4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK), 6.5 μL의 ddH2O를 30분 동안, 그리고 90°C에 ddH2O의 각 쌍을 함유하고 있다. 5 °C / 분에서 25 °C에 자신의.
- 어닐링된 gRNA 올리고뉴클레오티드의 1:200 희석을 풍부하게 하는 CRISPR V2-블라스트 또는 풍부하게 다발-Hygro-iRFP670으로 희석한다. BsmB1/Esp3I 소화 벡터 50ng을 희석된 올리고 듀플렉스 1 μL과 2x 리가제 완충액 5 μL, 11 μL 반응 시스템에서 1μL 로 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 결찰 생성물 3 μL을 50 μL 유능한세포(재료 표)로변환합니다.
- 형질전환된 유능한 세포를 100 μg/mL 카베니실린으로 한천 판에 펴고 31.5°C에서 18시간 동안 배양한다.
- 31.5 °C에서 100 μg/ mL 카베니실린을 함유한 5 mL의 훌륭한 국물(재료 표)에서10 μL 멸균 파이펫 팁과 배양으로 식민지를 선택하십시오.
- 미니 프렙 및 미디프키트(재료 표)를사용하여 플라스미드 DNA를 정화합니다.
- 제한 소화에 의해 미니 준비 플라스미드를 확인합니다. 20 μL 반응 시스템의 경우, 플라스미드 DNA 1 μg, 다이제스트 반응 완충액 2 μL(재료표)및 제한 효소 혼합물 1 μL(KpnI-HF 0.5 μL, AgeI-HF0.5 μL, 노티-HF0.5μl, 0.5 μL 의 노티-HF 및 0.5 μL plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23). 37°C에서 1시간 동안 반응 시스템을 배양한다.
- 반응을 0.8% 아가로즈 젤에 로드합니다. 젤을 100-150 V에서 30분 동안 실행합니다.
참고: plentiCRISPR V2-Blast-i22에 대한 올바른 대역은 622bp 및 12.2kb이어야 하며, plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23에 대한 올바른 대역은 2.6kb 및 7.1kb여야 합니다.
9. 렌티 바이러스 벡터 포장
- 배양 7 x 105 293FT 세포는 37°C, 5%CO2에서하룻밤 동안 6 cm 접시에 10% 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지의 5 mL에서.
- 칵테일 (1 μg의 plentiCRISPR V2-Blast-i22 또는 plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, psPAX2 포장 플라스미드 750 ng, pMD2.G 봉투 플라스미드 250 ng, 및 5 μL의 트랜스펙션 시약 A[재료 표]100 μl 감소.
- 환전 시약B(재료 표)의5 μL을 100 μL의 감소된 혈청 MEM 매질의 혼합물을 준비한다.
- 9.2단계에서 플라스미드 혼합물에 100 μL의 형질감염 시약 B 혼합물을 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- DNA 지질 복합체(9.4단계로부터)를 293FT 세포에 드롭와이즈로 추가합니다. 37 °C에서 5 %CO2로밤새 배양하십시오.
- 바이러스 생산 증강제(500x)(재료표)를다음 날 각 접시에 넣고 37°C, 5%CO2에서24시간 동안 배양한다.
- 다음 이틀에 파이펫을 사용하여 세포로부터 배지를 수집하고 0.45 μm 필터를 통해 배지를 필터링하여 세포를 제거합니다.
10. 렌티 바이러스 벡터의 농도 및 정제
- 5x 폴리에틸렌 글리콜 4000(PEG4000, 8.5% 최종 농도)과 4 M NaCl(0.4 M 최종 농도)으로 4°C에서 9.7단계의 배지에서 렌티바이러스 벡터를 침전시하였다.
- 2,095 x g 및 4°C에서 PEG4000 용액을 함유하는 바이러스 매체를 30분 동안 원심분리하고, 상급물질을 제거하고 폐기한다.
- 500 μL의 혈청 감소 MEM 매체 (렌티 바이러스 티터 : 렌티 - CRISPR V2-gRNAi22 : 1.56 x 108,렌티 -iRFP6로 펠릿을 다시 일시 중단 70-gRNAi23: 1.3 x 108,렌티-CRISPR V2-컨트롤: 3.13 x 107,렌티-iRFP670-컨트롤: 5.9 x 107 ). 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
11. 2개의 가이드 RNA(gRNA)가 Cas9와 결합된 마우스 iPSCs에서 엑온(23)의 삭제
- 피브로넥틴 및 젤라틴으로 코팅된 24웰 플레이트에서 4.5단계에서 마우스 iPSCs를 플레이트.
- 세포가 50% 합류에 도달한 후, 8 μg/mL 폴리브레인을 함유하는 신선한 배양 배지(완전한 마우스 배아 줄기 세포 성장 배지)로 전환한다.
- 렌티-CRISPR V2-gRNAi22, 렌티-iRFP670-gRNAi23 및 대조군(빈 벡터: 렌티-CRISPR V2, 렌티-iRFP670)을 마우스 iPSCs에 포함하여 10.3단계에서 렌티바이러스 입자 용액의 100 μL을 추가합니다. 37°C에서 3일간 세포를 5%CO2로배양한다.
- 2.5 μg/mL 블라스티신과 100 μg/mL 의 히그로마이신 B를 함유한 매체로 안정적으로 감염된 세포를 선택하여 감염되지 않은 세포를 죽이는 데 필요한 블라스티신과 히그로마이신 B의 최소 농도를 결정하였다.
참고 : 감염되지 않은 세포는 블라스티딘과 히그로 마이신 B에 의해 살해 될 것입니다. - 선택된 마우스 iPSCs를 0.5 mL의 TVP 용액으로 소화하고 각각 37°C에서 30분 동안 배양세포를 5%CO2로배양한다.
- 파이펫팅에 의해 단일 세포로 iPSCs를 해리하고, 세포 계수 챔버로 세포를 카운트한 다음, 5%CO2로37°C에서 배양을 위한 mES 배지로 약 150개의 소화된 단일 세포를 10cm 접시로 희석한다.
- 약 10 일 후, 10 μL 멸균 파이펫 팁을 사용하여 반전 된 현미경으로 단일 식민지를 선택하십시오 (96 개의 식민지를 골라야합니다).
- 선택된 콜로니를 50 μL의 TVP 용액으로 각각 잘(96-well plate, 각 콜로니마다 1개) 37°C에서 30분 동안 소화한 다음, 소화된 세포를 2개의 96웰 배양 플레이트(유질성 지질질용)로 시드합니다.
- CO2 인큐베이터에서 37°C에서 70% 까지 인큐베이터에 투숙합니다.
12. exon23 삭제와 iPSC 식민지의 식별
- 세포 콜로니가 70% 합류에 도달할 때 96 웰 플레이트에서 배지를 제거합니다.
- 25 μL의 용염 시약(재료표)을함유 한 단백질성 K 용액 (용해 시약 100 mL에 1 mL)을 각각 잘 넣고 용해염을 96 웰 PCR 플레이트로 옮니다.
- PCR 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 55°C에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 95°C에서 45분 동안 세포를 용해시키고 단백질분해제 K를 변성시냅니다.
- 12.3단계에서 2 μL의 포액으로 PCR 반응을 수행합니다. 20 μL PCR 반응을 위해, 용해액 2 μL, 2x DNA 폴리머라제 프리믹스 10 μL(재료표),7 μL의 DNase-free 물, 1 μL의 DMD 엑손 23 프라이머(표1)를추가합니다.
- PCR 반응에 대한 다음 매개 변수를 사용: 1분 동안 98°C, 10s용 98°C의 35사이클, 15s의 경우 60°C, 30초의 경우 72°C, 1분 동안 72°C에서 최종 연장.
- PCR 반응을 2% 아가로즈 젤에 로드합니다. 젤을 100-150 V에서 30분 동안 실행합니다.
- 자외선 아래에서 젤을 검사하십시오 (녹아웃 효율은 3/94입니다).
13. Tet-on MyoD 활성화 시스템을 사용하여 iPSC를 myogenic 전구 세포(MPC)로 직접 분화
- 패키지 LV-TRE-VP64-마우스 MyoD-T2A-dsRedExpress2 및 LV-TRE-VP16 마우스 MyoD-T2A-dsRedExpress2 (찰스 거스바흐에서 선물)(재료의 표)렌티-CRISPRv2-폭발 및 렌티-gRNA-iRFP670 벡터 섹션에 대해 설명한 대로 9 및 10.
- 렌즈바이러스-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 또는 렌티바이러스-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2로 마우스 iPSC를 감염시 다. 11.1-1-11 단계에서 렌티-CRISPRv2-블라스트 및 렌티-gRNA-iRFP670 벡터에 대해 설명한 대로.
- 순수한 트랜스듀싱 된 세포 집단을 얻기 위해 감염 3 일 후에 1 μg / mL puromycin을 가진 세포를 선택하십시오.
- MPC 분화에 3 μg/mL 독시 사이클린을 배양 배지(10% FBS DMEM)에 추가합니다. 2일마다 독시사이클린으로 보충된 신선한 배지를 대체하십시오.
14. 동적 근육 분화 및 DMD 엑손 22-24 발현을 평가하기위한 정량적 역전사 PCR
- RNA 격리 시약을 사용하여 독시 사이클린 처리 후 0, 3, 6 및 10일 후에 세포 RNA를 추출하고, 제1 가닥 cDNA 합성키트(표 오브 머티리얼)를사용하여 RNA를 cDNA로 역전처리한다.
- 20 μL qPCR 반응 시스템의 경우, cDNA 1 μL, PCR 반응 완충액 10 μL(재료표),DNA H2O 의 8 μL, 전방 및 역방향 프라이머 의 혼합물 1 μL(글리세랄데알데히드-3-인산 탈수소 효소 [GAPDH]), 골격 근 [ACTA1], OCT4 및 DMD 엑손22, DMD 엑손23 및 DMD 엑손24, 표 1참조.
- PCR 반응에 대한 다음 매개 변수를 사용: 50 °C 에 대 한 2 분, 95°C에 대 한 2 분, 40 사이클 95 s에 대 한 95°C, 60°C 에 대 한 1 분, 용융 곡선 65.0 °C 95.0 °C, 증분 0.5 °C.
15. 미오신 중혈계2(MYH2) 및 디스트로핀 단백질 발현의 면역형광 염색
- 플레이트 독시사이클린-유도, 렌티-TRE-MyoD 변형 세포단계 13.4에서 8웰 배양 슬라이드로.
- 실온에서 15 분 동안 4 % 포름알데히드에 세포를 고정 한 다음 매번 PBS에서 슬라이드를 두 번 세척하십시오.
- 실온에서 1 시간 동안 5 % 염소 혈청 단백질 희석제로 세포를 차단합니다.
- 토끼-항-디스트로핀 항체(1:300) 및 마우스-항-MYH2 항체(1:100)를 슬라이드에 넣고, 가습된 챔버에서 밤새 4°C에서 배양한다.
- 1차 항체 용액을 버리고, PBS에서 세포를 3x(5분/세척)하고, 1:400 희석된 Alexa488-컨쥬게이트 염소-항토끼 항체 및 Alexa555-컨쥬게이트 염소-항마우스 항체를 슬라이드에 넣고 실온에서 45분 동안 배양한다.
- PBS에서 슬라이드 3배(5분/세척)를 세척하고 DAPI가 포함된 장착 매체로 섹션을 장착합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dmdmdx 피부 섬유아세포 유래 iPSC의 확립. 우리는 통합없는 재프로그래밍 벡터를 사용하여Dmdx 마우스 유래 피부 섬유 아세포로부터 마우스 iPSC를 생성하는 효율성을 입증했습니다. 도 1A는 감염 후 3주에 배아 줄기세포(ESC)와 유사 콜로니의 출현을 입증하였다. 우리는 살아있는 알칼리성 인산염 (AP) 얼룩에 의한 iPSC 유도의 효율을 평가합니다; 도 1B는 FACS 분석에 의한 AP 양성 세포의 백분율이 약 1.8%였다는 것을 보여준다. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 및 SOX2, 마우스 배아 줄기 세포에 대한 다능 마커는 면역형광 염색에 의해 iPSC 콜로니에 대해 양성이었다(도1C). 생체 내에서 iPSCs의 3개의 생식선 분화를 조사하기 위하여는, 우리는 마우스 gastrocnemii에 iPSCs를 근육내 로 주입했습니다. 우리는 주입된 iPSCs가 간 세포(내배엽), 평활근 세포(mesoderm), 및 아드레날린 신경 세포(ectoderm)(그림1D)로분화되어 iPSCs의 다능성을 기소하는 것을 관찰하였다.
CRISPR/Cas9-중재 exon23 삭제. 우리는 돌연변이 엑슨 (23)의 측면 두 가이드 RNA를 설계했다. Cas9-중재된 이중 가닥 브레이크(DSB) 및 비상동성 종단 결합(NHEJ) 후, 돌연변이 엑손(23)은 삭제되어 잘린 기능성 디스트로핀 생산을 허용하였다(그림2A). exon 23 삭제된 마우스 iPSC를 확인하기 위해, 세포는 드물게 시드되었고, 개별 콜로니를 선택하여 전파하였다. 이들 콜로니에서 추출된 게놈 DDNA는 PCR 지질형 검사를 실시하였다. 도 2B는 콜로니 #1 #2 엑온(23)의 성공적인 결실을 나타내는 엑온(23)을 가지고 있음을 입증했다.
마우스 iPSCs를 근생 계보로 분화하고 디스트로핀 발현을 복원합니다. 우리는 iPSCs의 근생 분화를 유도하기 위하여 테트라사이클린 유도성 MyoD 발현 시스템을 이용합니다. 독시사이클린은 iPSCs에서 MyoD 발현을 유도하기 위해 사용되었다. 도 3A는 Dox 처리된 iPSCs에서 근육 분화의 시간 과정을 나타낸다. qRT-PCR은 만능 마커인 OCT4의 mRNA 수준이 점차 감소하는 것으로 나타났으며, 한편 해골 근육 마커인 ACTA1의 발현은 Dox 유도 후 증가하였다. 또한, 우리는 Dox 처리 후 2 주 에 myotubes 형성을 관찰(그림 3B). 중요한 것은, qRT-PCR 분석은 Cas9-제어라인(도 3C)에비해 Dox-유도된, Cas9 매개 Exon23 삭제라인에서 DMD 엑손 24 mRNA 발현의 회복을 보여주었다. qRT-PCR과 일치하지 않는, 면역형광 염색은 디스트로핀 단백질 발현 Cas9-매개 된 엑소온 23 삭제 된 세포를 나타내고, 반면 디스트로핀 발현은 대조군 세포에서 결석하였다(도 3D).
그림 1: Dmdmdx 마우스에서 피부 섬유아세포를 iPSCs로 재프로그래밍.
(A)ES와 같은 콜로니의 대표적인 이미지(스케일 바 = 200 μm). (B)라이브 AP 염색에 의한 센다이 바이러스 전이 8일 후 마우스 피부 섬유아세포의 재프로그래밍 효율을 iPSCs로 분석하였다. (C)iPSCs에서 SSEA1, Lin28, Nanog, Oct4 및 SOX2의 면역 형광 염색 (스케일 바 = 50 μm). (D)AFP에 대한 면역 형광 염색 (내배 엽), SMA (메소더름), 및 티로신 하이드랄라제 (TH) (ectoderm) 기형종의 2 주 후 위트로네미에 iPSC 주입 후 2 주 (스케일 바 = 20 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CRISPR/Cas9 매개 exon23 삭제.
(A)CRISPR/Cas9 매개 엑슨 23 삭제의 회로도. Cas9 뉴클레아제는 2개의 gRNA에 의하여 인트론 22 및 인트론 23을 표적으로 합니다. Cas9에 의한 이중 가닥 브레이크(DSBs)는 돌연변이 엑손(23)의 절제결과를 초래한다. 말단 끝은 비상동성 끝 접합에 의해 수리됩니다 (NHEJ), 디스트로핀 유전자의 판독 프레임의 복원의 결과. (B)엑소온(23)의 PCR 지질분석. 화살표는 엑슨(23)의 PCR 생성물(23)을 나타낸다. GAPDH는 참조 역할을 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마우스 iPSCs를 근생 계보로 분화하고 디스트로핀 발현을 복원한다.
(A)qRT-PCR은 Dox 처리된 엑소온 23-삭제된 Dmdmdx iPSC(*P & lt; 0.05 vs D0, D6, D10, #P < 0.05 vs D0, D3, D10, $P < 0.05 vs D0, D3, D6, n = 4 100월4일) (*P < 0.05 vs D6 및 D10 , #P 0.05 vs D0, D3 및 D10, $P < 0.05 대 D0, D3 및 D6, n = ACTA1의 경우 3). (B)왼쪽: Dox-유도 마우스 iPSCs로부터의 myotube 형성의 대표적인 이미지(스케일 바 = 200 μm). 오른쪽: Dox-유도 마우스 iPSCs로부터의 myotube 형성에서 MYH2의 면역 형광 분석 (스케일 바 = 20 μm). (C)어퍼: DMD 엑손22, 엑온23, 엑손24용 PCR 프라이머 포지션; 하단: MPC에서 DMD Exon22, Exon23 및 Exon24 발현의 mRNA 수준의 qRT-PCR 분석(****P < 0.0001, n = 3). (d)iPSCCas9-Ctrl 및 iPSCCas9-gRNA로부터의 독스 유도 MPC에서의 디스트로핀 발현의 면역형광 분석(스케일 바 = 50 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 가이드 프라이머 | |
| i22 센스 | 5'-CACCGTAAGTTAAAAAAA- 3' |
| i22 안티센스 | 5'-AAACTTGATTTTTAAC-3' |
| i23 센스 | 5'-AccGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3' |
| I23 안티센스 | 5'-AAACAGAAGGATATATATTACTC-3' |
| PCR 프라이머 | |
| OCT4-포워드 | 5'-AGCTGCTGAAGGAAGAGAGAGAG가카-3' |
| OCT4-리버스 | 5'-TCTCATTGTGTGTGCTCCTCCA-3' |
| ACTA1-포워드 | 5'-가트가가카카카카AC-3' |
| ACTA1-리버스 | 5'-TCAGCGATATAGGGTACAT-3' |
| 엑소22-포워드 | 5'-TTACCACCAATGCTATCA-3' |
| 엑소22-리버스 | 5'-CCCTCTTATTTC-3' |
| 엑소23-포워드 | 5'-CCAAAAAGCACCTTCAATATG-3' |
| 엑소23-리버스 | 5'-TTTGGCAGCTTCCACCA-3' |
| 엑소24-포워드 | 5'-AAC CTT ACA GAA ATG 가트 GGC-3' |
| 엑소24-리버스 | 5'-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3' |
| 갭드 포워드 | 5'-TGACAAGCTCTCTCTCG-3' |
| 갭DH 리버스 | 5'-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3' |
표 1: 프라이머 시퀀스.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
듀첸 근이영양증(DMD)은 디스트로핀의 부족을 특징으로 하는 파괴적이고 궁극적으로 치명적인 유전질환으로, 진행성 근육 위축으로 이어지는1,2. 우리의 결과는 CRISPR/Cas9 매개 exon23 결실의 접근법에 의해Dmdmdx iPSC 유래 myogenic 전구 세포에서 복원된 디스트로핀 유전자 발현을 입증한다. 이 방법은 세 가지 장점이 있습니다.
첫째, 우리는 비통합 RNA 벡터를 사용하여Dmdmdx 마우스 유래 진피 섬유아세포로부터 iPSC를 생성하였다. 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터와 같은 iPSCs를 생성하기 위해 다양한 방법이 개발되었으며, 이는 숙주 염색체로 통합되어 재프로그래밍 유전자를 발현하여 안전성 문제를 제기합니다. 플라스미드 벡터, 아데노-관련 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 DNA 기반 벡터는 비-통합 방식으로 존재; 그러나, 그(것)들은 아직도 낮은 주파수에 호스트 염색체로 통합할 수 있습니다. 이 연구에서는, 우리는 재프로그래밍을 위한 섬유아세포에 줄기 세포 전사 인자를 안전하고 효과적으로 전달하기 위하여, 비통합RNA 벡터인 수정된, 비 투과성 Sendai 바이러스를 이용했습니다.
다음으로, 우리는 CRISPR/Cas9 매개 정밀 유전자 보정보다는 CRISPR 매개 게놈 삭제를 사용하여 iPSCs에서 디스트로핀 발현을 복원합니다. 이 방법은 실현 가능하고 효율적입니다. 그것은 많은 인간 DMD 환자에서 발생하는 다중 돌연변이 엑슨을 삭제하는 다중 gRNAs를 설계하기쉽습니다 17. 엑손 결실은 비교적 효율적인 비상동성 단부 결합 경로를 이용하며, 이 방법은 DNA 복구 템플릿을 제공할 필요도 회피한다. 따라서, Cas9 매개 정밀 교정에 비해, Cas9-매개 엑슨 결실은 다중 유전자 돌연변이를 가진 DMD 환자에게 적합하다.
마지막으로, 우리는 iPSCs에 기인한 종양발생의 리스크를 감소시킬 수 있는 myogenic 전구 세포로 미분화 iPSCs를 유도했습니다. 본 프로토콜에서, 우리는 iPSCs를 골격 근 전구체18,19로분화시키기 위해 유도 가능한 테트라사이클린 조절(Tet-On) 벡터 시스템을 통해 MyoD 발현을 유도하였다.
결론적으로, CRISPR/Cas9 게놈 편집과 Tet-on MyoD 활성화 시스템의 조합은 DMD 환자에서 세포 이식을 위한 줄기 세포에서 돌연변이 DMD-Exon23 결실을 위한 안전하고, 실행 가능하고, 효율적인 전략을 제공할 수 있다.
ES와 같은 세포를 효율적으로 선택하고 수확하기 위해 돔 모양의 형태를 통해 미분화 iPSC 세포를 식별해야 하며, 수동 개체 마커는 iPSC 주위에 1.8 mm 원으로 배양 접시 바닥에서 개별 클론을 표시하는 데 도움이 될 수 있습니다. 클론. 트립신 용액의 누출을 방지하기 위해, 우리는 반지의 바닥에 균일하게 그리스를 적용해야합니다. 또한, 라벨 이 표시된 세포 콜로니의 상단에 그리스 코팅 링을 배치 한 후, 주의는 반지를 만지지 않도록주의해야한다. 그렇지 않으면 iPSC 클론이 분리됩니다.
프로토콜에는 한계가 있습니다. 예를 들어, 우리는 iPSCs를 생성하기 위해 비통합 RNA 벡터 시스템을 선택했습니다. 그러나, 우리는 dMD 엑온 (23)과 iPSC myogenic 분화를 유도하는 렌티 바이러스 기반 MyoD 활성화 시스템을 삭제하는 렌티 바이러스 CRISPR / Cas9 시스템을 사용; 이러한 통합 렌즈 바이러스 벡터는 안전 문제가 있습니다. 그러나, 이러한 문제점은 crRNA:tracrRNA 이중을 가진 재조합, 고순도 S. pyogenes Cas9 뉴클레아제를 포함하는 리보뉴클레오프로테인트(RNP) 복합체의 적용에 의해 해결될 수 있다; 우리는 화학적으로 변형된 MyoD mRNA 형질전환을 선택하여 iPSCs를 myogenic 선조로 직접 분화할 수 있지만 효율성은 어려울 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
탕과 와인트라우브는 NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
