Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול Cas9 מבוסס exon23 מחיקה כדי לשחזר ביטוי הדיסטרופין ב-iPSC מ Dmdmdx העכבר הנגזר פיברוהפיצוצים ולהבדיל ישירות iPSCs לתוך תאים מיוגניים מיוגנים (mpc) באמצעות ט-על מערכת ההפעלה myod.
Abstract
ניוון שרירים duchenne (DMD) היא מחלה מתקדמת חמורה שרירים נגרמת על ידי מוטציות הגן הדיסטרופין, אשר בסופו של דבר מוביל לתשישות של תאים שריר קדמון. באשכולות באופן קבוע הכולל מרווח מחדש palindromic חוזר/CRISPR-הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) לעריכת גנים יש את הפוטנציאל לשחזר את הביטוי של הגן הדיסטרופין. אוטוולוגי המושרה תאי גזע רב-עוצמה (iPSCs)-בתאי שריר נגזר (MPC) יכול לחדש את בריכת גזע/מחולל קדמון, לתקן נזק, ולמנוע סיבוכים נוספים ב-DMD ללא גרימת תגובה חיסונית. במחקר זה, אנו מציגים שילוב של CRISPR/Cas9 ו-iPSC שאינם משולבים טכנולוגיות להשיג ושלתי שרירים עם ביטוי חלבון הדיסטרופין התאושש. בקצרה, אנו משתמשים בווקטור שאינו שילוב של סנדאי כדי ליצור קו iPSC מתוך פיברותקיעות העורי של עכברMdx dmd. לאחר מכן אנו משתמשים באסטרטגיית המחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין באמצעות הצטרפות לא הומוולוגי של גן הדיסטרופין ממוסגר מחדש. לאחר אימות PCR של exon23 דלדול בשלוש מושבות מ 94 לאסוף מושבות iPSC, אנו להבדיל iPSC לתוך MPC על ידי דוקסיציקלין (חמצון)-ביטוי המושרה של MyoD, גורם שעתוק מפתח לשחק תפקיד משמעותי בוויסות בידול שריר. התוצאות שלנו מציגות את הכדאיות של שימוש באסטרטגיית מחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין ב-iPSC-נגזר MPC, אשר יש פוטנציאל משמעותי לפיתוח טיפולים עתידיים לטיפול DMD.
Introduction
ניוון שרירים duchenne (DMD) הוא אחד הdystrophies השרירים הנפוצים ביותר והוא מאופיין על ידי העדר הדיסטרופין, המשפיעים על 1 של כ 5,000 בנים יילוד ברחבי העולם1. הפסד של הדיסטרופין הפונקציה גן תוצאות פגמים שרירים מבניים המוביל ניוון מתקדם מיואיים1,2. רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV)-תיווך מערכת הריפוי גנטי נבדק כדי לשחזר את ביטוי הדיסטרופין ולשפר את תפקוד השריר, כגון החלפת גנים באמצעות מיקרו-הdystrophins (μ-Dys). עם זאת, הגישה raav מחייב זריקות חוזרות כדי לקיים את הביטוי של חלבון פונקציונלי3,4. לכן, אנחנו צריכים אסטרטגיה שיכולה לספק ביעילות ולשחזר לצמיתות הדיסטרופין ביטוי גנטי בחולים עם DMD. העכברהmdx dmd, מודל העכבר עבור dmd, יש מוטציה נקודה ב אקסון 23 של הגן הדיסטרופין המציג מוקדם הפסקת קודון ותוצאות חלבון מעוגל לא פונקציונלי חסר הדיסטרוc מסוף מחייב לתחום. מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו השימוש crispr/Cas9 טכנולוגיה כדי לשחזר ביטוי גנטי הדיסטרופין על ידי תיקון גנטי מדויק או מוטציה אקסון מחיקה של חיה קטנה וגדולה5,6,7. ארוך ואח '8 דיווחו על השיטה לתיקון מוטציה גן הדיסטרופין ב dmdmdx העכבר germline על ידי תיקון homology מכוון (HDR) מבוסס Crispr/Cas9 הגנום עריכה. אל-רפאי ואח '9 דיווח כי raav יכול ביעילות לבלו את מוטציה 23 בעכברים הדיסטרומנוונת. במחקרים אלה, gRNAs עוצבו ב introns 20 ו 23 כדי לגרום כפול נתקע DNA הפסקות, אשר שוחזר באופן חלקי את הביטוי הדיסטרופין לאחר תיקון DNA דרך הצטרפות לא הומוולוגי (NHEJ). אפילו יותר מרגש, אמאסיאני ואח '.10 דיווחו לאחרונה על יעילות והיתכנות של raav-תיווך CRISPR לערוך גנים בשחזור הביטוי הדיסטרופין במודלים כלבים, צעד חיוני ביישום קליני בעתיד.
DMD גם גורם להפרעות תא גזע11. עבור נזק שרירים, בתאי גזע שרירים מגורים לחדש תאי שריר לאחר בידול שריר. עם זאת, מחזורים רצופים של פציעה ותיקון להוביל קיצור של טלומרים בתאי גזע שריר12, ו דלדול מוקדמת של בריכות תאי גזע13,14. לכן, שילוב של טיפול אוטוולוגי בתאי גזע עם עריכת הגנום כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין יכול להיות גישה מעשית לטיפול DMD. The CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מספקת את האפשרות של יצירת אוטוולוגי גנטית מתוקן בתאי גזע המושרה pluripotent iPSC) עבור התחדשות שרירים תפקודית ולמנוע סיבוכים נוספים של DMD ללא גרימת דחייה החיסונית. עם זאת, iPSCs יש סיכון של היווצרות הגידול, אשר יכול להיות להקלה על ידי הבידול של iPSC לתוך תאים מיוגני קדמון.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש ללא שילוב וירוס סנדאי כדי לתיכנות מראש באמצעות הפנים של עכבריםMdx dmd לתוך iPSCs ולאחר מכן לשחזר ביטוי הדיסטרופין על ידי CRISPR/Cas9 הגנום מחיקה. לאחר אימות של מחיקה Exon23 ב-iPSC על ידי הגנוטיפים, אנו הבדיל מתוקן הגנום iPSC לתוך ושלתי מיוגניים (MPC) באמצעות בידול מיוגני הנגרמת על ידי MyoD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל טיפול בבעלי חיים והליכים כירורגיים בוצעו על ידי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת אוגוסטה (IACUC). לעכברים הואכלו דיאטה סטנדרטית. ומים ליסיביות
1. בידוד של העכבר הראשי פיברוהפיצוצים מתוך עכברים מבוגרים Dmdmdx
- המתת חסד של מבוגרים Dmdmdx עכברים (זכר, 2 חודשים) על ידי CO2 חנק וכריתת האונה על פי iacuc אושרה על ידי המכללה הרפואית של גאורגיה, אוניברסיטת אוגוסטה. חותכים את הזנב עם אזמל סטרילי במצב סטרילי תחת המכסה המנוע. לשטוף את הזנב עם 70% אתנול עבור 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מלוחים סטרילי מאגור פוספט (PBS) בצלחת 6 ס מ.
- קלף את העור הזנב על ידי חתך חד מהבסיס לקצה הזנב לאורך העור הזנב, ולאחר מכן לקלף בעדינות את העור הזנב עם מספריים. האוהב את העור בגודל של 1 מ"מ3 באמצעות אזמל סטרילי ולהעביר את רקמת העור טחון לצלחת 6 ס"מ בינוני חיוני מינימלי של דולבקה/Ham ' s F12 (dmem/F12) המכיל 0.1% קולגן הרביעי ו-1 U/mL של dispase.
- לעכל את רקמת העור בצלחת תרבות עבור 2 h ב 37 ° c בחממה 5% CO2 .
- מעיל צלחת 6-באר עם fibronectin ו 0.2% ג'לטין (1 מ ל של fibronectin ב 199 mL של 0.2% ג'לטין; רשימת חומרים) ו הדגירה ב 37 ° c עבור 1 h.
- הנתק את רקמת העור מתעכל עם הטיפ 1 mL pipet ולהעביר את הרקמה supernatant לצינור הצנמה סטרילי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 217 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר, למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות את הגלולה ב 1.5 mL של בינונית פיברובלסט (טבלת חומרים).
- התרבות כדורי כולל רקמת עור מתעכל לא מושלם משלב 1.5 על צלחת 6-הבאר מצופה עם fibronectin ו 0.2% ג'לטין משלב 1.4 ב 37 ° c, 5% בחממה2 . החליפו את המדיום 24 שעות לאחר הציפוי הראשוני להסרת תאים שאינם מחוברים, ושנה את המדיום כל 48 h.
2. מתיכנות משני של עור העכבר לתוך iPSCs
- יומיים לפני התמרה, לעכל את העכבר העיכול פיברותקיעות משלב 1.6 עם פתרון ניתוק התא (טבלה של חומרים) בחממה 37 ° c עם האווירה מחולל לחות של 5% CO2 עבור 5 דקות.
- ספירת תאים באמצעות hemacytometer צנטריפוגה ב 217 x g עבור 3 דקות.
- תאי הזרע בצפיפות של 1 עד 2 x 105 תאים לכל טוב על צלחת 6-באר ותרבות עם בינונית פיברוהפיצוץ (לוח חומרים) בחממה 37 ° c עם האווירה לחות של 5% CO2.
- ביום התמרה (יום 0), הערכת התאים ולחשב את עוצמת הקול של כל וירוס הנדרש כדי להגיע לריבוי היעד של זיהום (המשרד העצמי) של 5, 5, ו 3 (כלומר, KOS מארה = 5, הhc-Myc ממוי = 5, hKlf4 מוי = 3) לפי המדריך המסחרי.
- הפשרת שלושה צינורות סנדאי באמבטיית מים בגודל 37 ° c לחמישה-עשר, והוסיפו את הכרכים המחושבים של כל אחד משלושת צינורות סנדאי ל-1 מ ל של בינונית (שולחן חומרים).
- להסיר את המדיום פיברוהפיצוץ משלב 2.3 ולהוסיף את תערובת וירוס מתיכנות לבארות המכילות את התאים. מודיית את התאים לילה בחממה 37 ° c עם האווירה לחות של 5% CO2.
- החלף את המדיום עם בינוני בפיברוסט טרי 24 שעות לאחר התמרה. מתרבות את התאים לשבוע אחד. עם החלפת בינוניות בכל יום
- הקציר מושפע העכבר הנגוע ביום 7 לאחר התמרה עם 0.05% טריפסין/EDTA ומקום על מנות כי הם מצופים בעבר עם fibronectin ו 0.2% ג'לטין.
- התרבות הנגועה בעכבר הנגוע משלב 2.6 באמצעות העכבר המלא מתחלקים תא גזע (ES) הצמיחה בינונית (שולחן החומרים) בחממה 37 ° c עם אווירה מחולל לחות של 5% CO2 ולשנות בינונית מדי יום.
- מיום 8, שימו לב לצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך בכל יום אחר כדי לזהות את המראה של גושי תאים עם המבנה של העכבר ES.
3. באמצעות פוספספטאז אלקליין לחיות כתם וזרימה cy, לנסות לכמת את יעילות התיכנות
- הסר את מדיית התרבות מכל באר ושטוף באמצעות הפקודה DMEM דיה/F-12 עבור 2 עד 3 דקות.
- החל 2 מ ל של 1x בסיסי פוספספטאז (AP) חיים כתמים הפתרון העבודה (1:500 דילול ב-DMEM/F-12) אל התאים החסיד, ו דגירה ב 37 ° c חממה עם אווירה מחולל לחות של 5% CO2 עבור 30 דקות.
- ולשטוף פעמיים עם ה-PBS. במשך 5 דקות כל אחד
- לעכל את התאים עם פתרון הניתוק התא (טבלה של חומרים) בחממה 37 ° c עם האווירה מחולל לחות של 5% CO2 עבור 5 דקות. לבצע את הזרימה cy, נסה לקבוע את יעילות התיכנות מראש.
4. בחירה ואיסוף תאים בעלי מערך ES
- בדוק את המושבות משלב 2.8. תחת מיקרוסקופ הפוך
- סמן את המושבות בתחתית הצלחת עם סמן אובייקט בדיו עצמית.
- החלת טבעות שיבוט משומן כדי לכסות את מושבות התא המסומנות. הוסף 100 μL של 0.05% טריפסין/EDTA לכל טבעת שיבוט ב 37 ° צ' עבור 5 דקות, ולאחר מכן להעביר את התאים מתעכל עם 100 הטיפים μL ל48 היטב לוחיות התרבות המכילות את מדיום הצמיחה של mES.
- מודיית את התאים ב 48-היטב לוחיות התרבות ב 37 ° c בחממה עם אווירה מחולל לחות של 5% CO2. מעבר את התאים 6 ס"מ צלחת כאשר הם מגיעים 70% המפגש.
- חזור על שלבים 4.3 ו 4.4 במשך כמה פעמים עד מעונות אחיד בצורת שיבוטים מתקבלים.
5. הקפאת iPSCs לקריוגנית
- הנתק את iPSCs הנבחר משלב 4.5 עם טריפסין, versene, ו פלזמה אפרוח (TVP; רשימת חומרים) פתרון ב 37 ° c בחממה 5% CO2 עבור 30 דקות.
- לאסוף את התאים בצינור והצנטריפוגה של 15 מ ל מעוקר בשעה 217 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- משף את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של העכבר ES קפוא בינונית (טבלת חומרים) כדי להשיג 1 mL לכל קריובקבוקון.
- הוסף תאים לקריוצלוחיות והקפא באמצעות מיכל המקפיא המספק את קצב הצינון הקריטי, החוזר על 1 ° c ומינימום הנדרש לקריופיפריזציה ב-80 ° c למשך הלילה.
- העבר מבחנות קפואות. למיכל חנקן נוזלי
6. כתמים אימונולואורונסנציה עבור סמנים תא גזע ב iPSCs
- Seed iPSCs משלב 5.1 התרבותי עם mES medium לתוך שקופית קאמרית של 8 שנים מצופה עם פולי-D-ליזין/מלמינציה (לוח חומרים) בצפיפות המתאימה כדי להשיג בין 1 לבין 2 x 104 תאים לכל טוב ו דגירה בחממה 37 ° c עם מ לחות האווירה של 5% CO2 עבור 48 h.
- לטבול את השקופיות 4% פורמלדהיד עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לטבול את השקופיות ב-PBS פעמיים עבור 5 דקות בכל פעם.
- מקטעים באמצעות העכבר מגיב באמצעותהמוצר (טבלת חומרים), ו 5% סרום עז 1 h בטמפרטורת החדר.
- לדלל את הנוגדנים העיקריים מדלל חלבון (העכבר-anti-SSEA1, 1:100, ארנב-anti-ננוg, 1:500; ארנב-anti-POU מחלקה 5 [SOX2], 1:500; ארנב-anti-SRY-box 2 [], 1:500; ארנב נגד לין-28 הומויומן [Lin28A], 1:400) (לוח חומרים). החלת נוגדנים על התאים ו הדגירה ב 4 ° c לילה בחדר מחולל.
- להיפטר פתרון הנוגדן העיקרי ולשטוף את השקופיות 3x ב-PBS.
- החלת נוגדנים השני (Alexa488-מצושל עז נגד העכבר נוגדן ו Alexa555-מצועם עז-אנטי ארנבת, 1:400 כל אחד) ב M.O.M. חלבון דילול על שקופיות ו-דגירה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטוף את השקופיות 3 x ב-PBS ו-mount מקטעים עם בינוני הרכבה המכיל 4 ' 6-diamidino-2-פנילילינדול (DAPI).
- צלם תמונות עם. מיקרוסקופ קונקונוס
7. חקירת הפלאואון של iPSCs בvivo
- הנתק את iPSCs משלב 5.1 לתוך תאים בודדים באמצעות TVP פתרון בחממה 37 ° c עם אווירה מחולל לחות של 5% CO2 עבור 30 דקות.
- ספירת תאים באמצעות hemacytometer צנטריפוגה ב 217 x g עבור 3 דקות.
- מזליד את supernatant ולהשעות את הגלולה עם מדיום mES בצינור הצנטריפוגה 1.5 mL סטרילי בריכוז של 5 x 105 תאים/30 μl עבור השתלת תא.
- הסרת שיער הן הגפיים האחוריות של עכברים חיסוני באמצעות קוצץ שיער.
- עכברים מורדם עם קטמין (100 mg/ק"ג) ולנקות את אתר ההזרקה עם 75% אלכוהול.
- הכנס 30 μL של iPSC השעיה משלב 7.3 בתוך הבית ה, באמצעות מחט של 31 גר'.
- שבועיים לאחר ההזרקה, הקציר הלחץ העכבר ולהטביע בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מתחם, להקפיא הקפאה לחתוך לסעיפים 5-μm15,16.
- לתקן מקטעים ב 4% פורמלדהיד עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף את השקופיות פעמיים ב-PBS עבור 5 דקות בכל פעם.
- לחסום את התאים עם 5% סרום עז מדלל חלבון עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- הוסף נוגדן ראשוני מדולל (ארנב נגד AFP, 1:50; ארנב נגד SMA, 1:50; ארנב נגד TH, 1:50) לשקופיות ו-מודלת ב 4 ° c לילה בחדר מחולל.
- להיפטר פתרון הנוגדן העיקרי, לשטוף את התאים 3x (5 דקות/לשטוף) ב-PBS, להוסיף 1:400 מדולל עז אנטי ארנבת נוגדן לשקופיות, ו דגירה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף שקופיות 3 x (5 דקות/לשטוף) ב-PBS, ואת מקטעי הר עם בינונית הרכבה המכילה DAPI.
8. בנייה של crispr/Cas9 וקטור מיקוד וקטורי מטרה החוצה הדיסטרופין לאקסון 23
- עיצוב שני זוגות של grna oligos מיקוד intron-מוקף הדיסטרופין לאקסון 23 באמצעות http://crispor.tefor.net/crispor.py.
הערה: הצמדים המתוכננים הם כדלקמן:
i22sense: 5 '-מדריך למנהל התעשייה-3 '
i22anti-היגיון: 5 '-מיזוגאוויר C-3 '
i23sense: 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 '
i23anti-sense: 5 '-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3 '). - לעכל ולתת לאחר 5 μg של הנגיף הפלסטי (לנטי-CRISPRv2-הפיצוץ [מתנה ממוהאן באבו) ו לנטי-מדריך-Hygro-iRFP670 [מתנה מקריסטן Brennand]) (טבלת חומרים) עם BsmB1/Esp3I עבור 30 דקות ב 37 ° c. עבור 5 μg של פלמידים, להוסיף 3 μL של BsmB1 הגבלת אנזים, 3 μL של מהיר בסיסי פוספספטאז, 6 μL של מאגר תקציר האנזים 10x ו-0.6 μL של 100 mM DTT ב 60 μL התגובה).
- לטעון את התגובות על 0.8% agarose ג'ל. הפעל את הג ב-100 עד 150 וולט במשך 30 דקות.
- טיהור בתוך ג'ל מתעכל באמצעות ערכת החילוץ ג'ל (טבלת חומרים) ו-elute ב 20 μl של H2O.
- זרחניות, והוא מכיל כל זוג של מחלת הגראוונודה המכילה 1 μL של כל מחלת הסידן ב 100 μM, 1 μL של מאגר הדו T4 בגודל 10x, 0.5 μL של T4 פולינוטייז קינאז (PNK), 6.5 μL של ddH2O ב-37 ° צ' למשך 30 דקות, ולאחר מכן 95 ° c עבור 5 דקות ולאחר מכן השיפוע במרחק של 25 ° c ב-5 ° צ'/מינימום.
- ליגייט 1:200 דילול של gRNA olig, הגאות לתוך plentiCRISPR V2 הפיצוץ או בשפע מדריך-Hygro-iRFP670. מערבבים 50 ng של BsmB1/Esp3I וקטורים מתעכל עם 1 μl של דופלקס oligo מדולל ו-5 μl של מאגר 2x ליגאז פלוס 1 μl של ליגאז ב 11 מערכת תגובה μl ו-דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לבצע שינוי עם 3 μL של המוצר לקשר לתוך 50 μL תאים מוכשרים (טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
- הפיצו את התאים המוסמכים השתנה בצלחת אגר עם 100 μg/mL carbenicillin ו-דגירה ב 31.5 ° צ' עבור 18 h.
- לבחור מושבות עם 10 μL הצנרת סטרילי טיפים ותרבות ב 5 מ ל של ציר מצוין (הטבלה של חומרים) המכיל 100 μg/mL carbenicillin ב 31.5 ° צ', 185 rpm בחממה שייקר עבור 21 h.
- לטהר את ה-DNA הפלמיד באמצעות מיני להתכונן ו-midi-להכין ערכות (טבלת חומרים).
- אמת את מיני ההכנה המצומצמת על-ידי עיכול הגבלה. עבור 20 התגובות, של מערכת התגובה add 1 μg של ה-DNA באמצע, 2 μL של מאגר התגובה לעכל (הטבלה של חומרים) ו 1 μl של תערובת אנזים הגבלה (0.5 Μl של KPNI-hf ו 0.5 Μl של AGEI-Hf עבור plentiCRISPR V2-הפיצוץ-i22; 0.5 Μl של NOTI-hf ו 0.5 Μl של ecori-hf שפע-מדריך-Hygro-iRFP670-i23). מודיית את מערכת התגובה. בשעה 37 מעלות צלזיוס
- לטעון את התגובות על 0.8% agarose ג'ל. הפעל את הג ב-100 עד 150 וולט במשך 30 דקות.
הערה: הלהקות הנכונות עבור plentiCRISPR V2-הפיצוץ-i22 צריך להיות 622 bp ו 12.2 kb, ואת להקות הנכון שפע-Hygro-iRFP670-i23 צריך להיות 2.6 kb ו 7.1 kb.
9. מארז וקטורי לנטינגיט
- תרבות 7 x 105 293ft תאים ב 5 מ ל של מדיה dmem המכיל 10% סרום העובר העוברי בצלחת 6 ס"מ לילה ב 37 ° c, 5% CO2.
- להכין קוקטייל (1 μg of plentiCRISPR V2-הפיצוץ-i22 או שפע מדריך-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng של האריזה psPAX2 זיווד, 250 ng של pMD2. G מעטפה פלאמיד, ו-5 μL של הזיהום מגיב [טבלת חומרים] ב 100 μl של הסרום מופחת מדיה.
- הכינו תערובת של 5 μL של העברה מגיב B (הטבלה של חומרים) ב 100 μl של מדיה מופחתת זיכרון מופחת.
- הוסף 100 μL של התערובת מגיב B לתערובת פלאבין בשלב 9.2 ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף את הקומפלקס DNA-ליפיד (משלב 9.4) dropwise לתאים 293FT. דגירה לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
- הוספת משפר ייצור וירוסים (500x) (טבלה של חומרים) על כל מנה ביום למחרת ו דגירה עבור 24 h ב 37 ° c, 5% CO2.
- לאסוף בינוני מתאים באמצעות פיפטות ביומיים הבאים ולסנן את המדיום באמצעות מסנן 0.45 יקרומטר כדי להסיר את התאים.
10. ריכוז וטיהור של וקטורים מאונגיליים
- מזרז וקטור ויראלי במדיום של שלב 9.7 לילה ב 4 ° צ' עם פוליאתילן 5x גליקול 4000 (PEG4000, 8.5% הריכוז הסופי) ו 4 M הנאל 0.4 (הריכוז הסופי M).
- צנטריפוגה את התקשורת הנגיפית המכילה את הפתרון PEG4000 ב 2,095 x g ו 4 ° צ' עבור 30 דקות, להסיר ולמחוק את supernatant.
- השהה מחדש את כדורי עם 500 μL של סרום מופחת מדיה מופחתת (הנגיף: lenti-CRISPR V2-gRNAi22:1.56 x 108, Lenti-IRFP670-gRNAi23:1.3 x 108, LENTI-crispr v2-שליטה: 3.13 x10,lenti-iRFP670-control: 5.9 x 107 ). חנות at-80 ° צ' עד השימוש.
11. מחיקת אקסון 23 בעכבר iPSCs עם שני rnas מדריך (grnas) ביחד עם Cas9
- צלחת העכבר iPSCs משלב 4.5 בצלחת 24-באר מצופה עם fibronectin ו ג'לטין.
- לאחר התאים להגיע 50% המפגש, לעבור אל התרבות הטרייה בינונית (העכבר המלא מתחלקים הצמיחה תא גזע בינוני) המכיל 8 μg/mL polybrene).
- להוסיף 100 μL של פתרון חלקיק ויראלי משלב 10.3 כולל lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 ושליטה (וקטור ריק: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) לעכבר iPSCs. התאים הדגירה 3 ימים ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
- בחר תאים נגועים באופן בלתי נשכח עם מדיה המכילה 2.5 μg/mL בלאסיפידין ו 100 μg/mL hygromycin B על-ידי קביעת הריכוז המינימלי של בלטות ו hygromycin B נדרש כדי להרוג את התא בלתי נגוע.
הערה: התאים הנגועים במחלה יוהרגו על ידי בלטות וhygromycin בי. - לעכל את העכבר שנבחר iPSCs עם 0.5 mL של הפתרון TVP כל טוב (24-באר צלחת) ו דגירה תאים עבור 30 דקות ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
- הנתק את iPSCs לתוך תאים בודדים על ידי ליטוף, לספור תאים עם תא ספירת תאים ולאחר מכן לדלל על 150 תאים בודדים מתעכל עם mES בינונית לתוך 10 ס מ צלחת עבור תרבות ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
- לאחר כעשרה ימים, לבחור מושבות יחיד תחת מיקרוסקופ הפוך באמצעות 10 μL הצנרת סטרילי טיפים (96 המושבות צריך להיבחר).
- להעביר את המושבות שנאסף לתוך 50 μL של הפתרון TVP כל טוב (96-צלחת לוחית, מושבה אחת כל טוב), לעכל ב 37 ° צ' עבור 30 דקות, ולאחר מכן זרע את התאים מתעכל לתוך 2 96-ובכן לוחיות התרבות כדי לשמור על התרבות (אחד עבור הגנוזה).
- מודטה בחממה של CO2 ב-37 ° c עד 70% בחיבור.
12. זיהוי מושבות iPSC עם מחיקת exon23
- הסר את המדיום בצלחת 96-באר כאשר מושבות התא להגיע 70% המפגש.
- הוסף 25 μL של מגיב לפירוק (טבלה של חומרים) המכיל את הפתרון הפרוטאינאז k (1 מ ל של הפרוטאינאז k ב 100 mL של מגיב לפירוק) כל טוב, ולהעביר את ליפוסט לצלחת 96-היטב PCR.
- חותם את צלחת ה-PCR ו מודקת את הצלחות ב 55 ° c עבור 30 דקות, ולאחר מכן ב 95 ° c עבור 45 דקות כדי lyse את התאים ואת הספרות הפרוטאינאז K.
- בצע תגובת PCR עם 2 μL של ליפוסט משלב 12.3. עבור תגובה 20 μl PCR, להוסיף 2 μl של ליפוסט, 10 μl של 2x DNA פולימראז פריאז (טבלת חומרים), 7 μl of dnase-מים חינם, ו 1 μl של dmd אקסון 23 התחל (שולחן 1).
- השתמש בפרמטרים הבאים עבור תגובת ה-PCR: 98 ° c עבור 1 דקות, 35 מחזורים של 98 ° צ' עבור 10 s, 60 ° c עבור 15, 72 ° c עבור 30, והארכה סופית ב-72 ° c עבור 1 דקות.
- העמיסו את תגובת ה-PCR. על ג'ל של 2% הפעל את הג ב-100 עד 150 וולט במשך 30 דקות.
- בדוק את ג'ל תחת אור UV (יעילות הנוקאאוט הוא 3/94).
13. שימוש במערכת ההפעלה של מערכת MyoD כדי להבדיל במישרין את iPSC לתאי קדמון מיוגניים (MPC)
- חבילת LV-TRE-VP64-עכבר MyoD-T2A-dsRedExpress2 ו-LV-TRE-VP16 עכבר MyoD-T2A-dsRedExpress2 (מתנה מצ גרסבאך) (טבלת חומרים) כפי שתוארה בעבר עבור Lenti-CRISPRv2-הפיצוץ ו Lenti-Grna-iRFP670 וקטורים בסעיפים . תשע ועשר
- להדביק את העכבר iPSC עם הנגיף-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 או לווירוס-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 כפי שמתואר בעבר ל-lenti-CRISPRv2-הפיצוץ ו lenti-gRNA-iRFP670 וקטורים בשלבים 11.1-ל-18.2.
- בחירת תאים עם 1 μg/mL puromycin לאחר שלושה ימים של זיהום כדי לקבל התמרה טהורה של התאים הסלולריים.
- הוסף 3 מיקרומטר μg/mL לתוך התקשורת התרבותית (10% FBS Dמאמ) כדי MPC בידול. החלפת בינוני טרי שיושלם עם דוקסיציקלין מדי יומיים.
14. היפוך כמותי שעתוק PCR להערכת בידול שריר דינמי dmd אקסון 22-24 ביטוי
- לחלץ RNA הסלולר לאחר 0, 3, 6, ו 10 ימים לאחר הטיפול דוקסיציקלין באמצעות הבידוד RNA מגיב, התהודה להפוך RNA לתוך cDNA באמצעות ערכתהסינתזה הראשוןסטרנד cdna (טבלת חומרים).
- עבור מערכת התגובה 20 μl qpcr, להוסיף 1 μl של cdna, 10 μl של מאגר התגובה PCR (טבלת חומרים), 8 μl של DNA H2O, ו 1 μl של תערובת של קדימה והפוך התחל (גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז [החוצה], שריר השלד [ACTA1 OCT4 ו-dmd exon22, DMD exon23 ו-DMD exon24, ראה טבלה 1).
- השתמש בפרמטרים הבאים עבור תגובת ה-PCR: 50 ° c עבור 2 דקות, 95 ° c עבור 2 דקות, 40 מחזורים של 95 ° c עבור 15, 60 ° c במשך 1 דקות, להמיס עקומת בתוך מעלות צלזיוס עד 65.0 ° c, להגדיל 95.0 ° c.
15. immunofluorescence כתמים של שרשרת כבדה רירן 2 (MYH2) וביטוי חלבון הדיסטרופין
- לוחית דוקסיציקלין הנגרמת, לנטי-TRE-MyoD תאים שונה משלב 13.4 אל 8-היטב שקופיות התרבות.
- תקן תאים ב 4% פורמלדהיד עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטוף את השקופיות פעמיים ב-PBS עבור 5 דקות בכל פעם.
- לחסום את התאים עם 5% סרום עז מדלל חלבון עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- הוסף הארנב נגד הדיסטרופין נוגדן (1:300) ו-MYH2 נוגדן העכבר (1:100) לשקופיות, מודטה ב 4 ° c לילה בחדר מחולל.
- להיפטר פתרון הנוגדן העיקרי, לשטוף את התאים 3x (5 דקות/לשטוף) ב-PBS, להוסיף 1:400 מדולל Alexa488-מצושל עז אנטי ארנבת נוגדן ו Alexa555-מצועם אנטי העכבר נוגדן לשקופיות, ו דגירה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטוף את השקופיות 3 x (5 דקות/לשטוף) ב-PBS, ואת מקטעי הר עם בינונית הרכבה המכילה DAPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקמת מערכת העור של Dmdmdx שמקורם ipsc. הדגמנו את היעילות של יצירת העכבר iPSCs מ Dmd מעכבריםmdx נגזר העור פיברופיצוץ באמצעות שילוב חינם וקטורים תכנות. איור 1A הפגינו כי המראה של תא גזע עובריים (ESC)-כמו מושבות בשלושה שבועות לאחר ההדבקה. אנו מעריכים את היעילות של האינדוקציה iPSC ידי לחיות פוספספטאז אלקליין (AP) הכתם; איור 1B מראה שאחוזי התאים של AP-חיוביים היו סביב 1.8% על-ידי ניתוח facs. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 ו SOX2, סמנים pluripotency לתאי גזע מעובריים של העכבר, היו חיוביים עבור מושבות iPSC על ידי immunofluorescent כתמים (איור 1C). כדי לחקור את שלושת germline הבידול של iPSCs ב vivo, אנחנו מוזרקים בתוך הiPSCs אל העכבר. הבחנו כי iPSCs הזריק מובחנים לתאי הכבד (אנדועור), תאי שריר חלקה (מזופה), ותאי עצב אדרארגיים (ectoderm) (איור 1D), מצביע על העוצמה של iPSCs.
Crispr/Cas9-תיווך exon23 מחיקה. עיצבנו שני מדריך מוביל. שאגף את המוטציה 23 לאחר Cas9-בתיווך כפול תקועים הפסקות (dsb) והוא לא הומוולוגי להצטרף (nhej), מוטציה אקסון 23 נמחק, המאפשר מקוצץ אך פונקציונלי הדיסטרופין הייצור (איור 2a). כדי לזהות אקסון 23 העכבר הנמחק ipsc, התאים היו שנזרע בדלילות, והמושבות הבודדות נאספה והופץ. DNAs גנומית שחולצו ממושבות אלה היו חשופים גנוהקלדה של ה-PCR. איור 2b הפגינו כי המושבה #1 ו#2 יש אקסון 23 מחיקות המציינות מחיקה מוצלחת של אקסון 23.
מבדילים העכבר iPSCs לתוך השושלת מיוגנית ושחזור הביטוי הדיסטרופין. אנו משתמשים טטרציקלין-inducible MyoD הביטוי המערכת כדי לגרום לבידול מיוגניים של iPSCs. דוקסיציקלין היה שימוש כדי לגרום הביטוי MyoD ב iPSCs. איור 3A מראה את מסלול הזמן של בידול שרירים ב-iPSCs מטופלים חמצון. רביעיית ה-PCR הראו כי רמת mRNA של OCT4, סמן הפלאוריטי, ירד בהדרגה, בעוד הביטוי של ACTA1, סמן שריר השלד, גדל לאחר האינדוקציה החמצון. כמו כן, הבחנו במערך היויוטים בשבועיים לאחר טיפול החמצון (איור 3B). חשוב מכך, שיטת רביעיית-PCR הראתה את ההתאוששות של dmd אקסון 24 ביטוי mrna בהשפעת החמצון, Cas9-תיווך Exon23 למחוק בהשוואה לקו Cas9-control (איור 3c). בלתי מתאים עם רביעיית-PCR, מכתים אימונוofor, מראה את הדיסטרופין הCas9-בתיווך אקסון 23 תאים שנמחקו, בעוד הביטוי הדיסטרופין לא היה בתאי שליטה (איור 3d).
איור 1: לתיכנות משנה את העור מפני בiPSCs.
(א) דמות ייצוגית של מושבות ES-כמו (סרגלבקנהמידה = 200 μm). (ב) facs ניתוח של יעילות התיכנות מראש של עור העכבר הiPSCs לאחר 8 ימים של התמרה וירוס סנדאי על ידי כתמים לחיות AP. (ג) אימונוofor, כתמים של SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4, SOX2 ב iPSCs (סרגל קנה מידה = 50 μm). (ד) אימונואופלווראוזים עבור afp (אנדופופיל), SMA (מזופה), ו טירולי הידרוקלז (ה) (העור) של טרטומה 2 שבועות לאחר הזרקת ipsc לתוך הגקטמייה (סרגל קנה מידה = 20 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מחיקה exon23 בתיווך CRISPR/Cas9.
(א) תרשים סכמטי של CRISPR/Cas9 בתיווך 23 מחיקות. Cas9 נוקלאז מטרות אינטרון 22 ו אינטרון 23 על ידי שני grnas. הפסקות כפולות (DSBs) ב-Cas9 מתוצאות בריתה של המוטציה 23. הקצוות המרוחק מתוקנים על ידי הצטרפות לא הומוולוגי (NHEJ), וכתוצאה מכך שחזור של מסגרת הקריאה של הגן הדיסטרופין. (ב) PCR מנתח הקלדה של האקסון 23. החץ מציין את מוצר ה-PCR של אקסון 23. המלון משמש כאסמכתא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הבחנה עכבר iPSCs לתוך השושלת המוגני ושחזור הביטוי הדיסטרופין.
(א) רביעיית-PCR הראה את מסלול הזמן של רמת mrna של Oct4 ו ACTA1 ב חמצון מטופלים אקסון 23-נמחק dmdmdx ipsc (* P < 0.05 vs D0, D6, D10, #P < 0.05 vs D0, d3, D10, $P < 0.05 לעומת D0, d3, D6, n = 4 עבור Oct4) (* P < 0.05 vs D6 ו D10 , #P < 0.05 לעומת D0, D3, ו D10, $P < 0.05 vs D0, D3, ו D6, n = 3 עבור ACTA1). (ב) משמאל: דימוי מייצג של היווצרות מיושפופרת מן העכבר המושרה iPSCs (סרגל בקנה מידה = 200 μm). מימין: ניתוח מרפאולוורדורף של MYH2 במבנה מיוכי מiPSCs האנטי-חמצון (סרגל קנה מידה = 20 μm). (ג) עליון: העמדות ה-PCR עבור Dmd Exon22, Exon23 וExon24; למטה: ניתוח של רביעיית ה-PCR של רמת mRNA של DMD Exon22, Exon23 וביטוי Exon24 ב-MPC (* * * * P < 0.0001, n = 3). (ד) אימונוללוורדורף ניתוח של ביטוי הדיסטרופין ב-mpc הנגרמת על-ידי ה-IpscCas9-Ctrl ו-IpscCas9-grna (סרגל קנה מידה = 50 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מדריך התחל | |
| חוש i22 | 5 '-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA-3 ' |
| i22 אנטי-סנס | 5 '-מחלקה 2 ' |
| חוש i23 | 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 ' |
| I23 אנטי-סנס | 5 '-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC -3 ' |
| צבעי היסוד המולקולארית | |
| OCT4-קדימה | 5 '-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA -3 ' |
| OCT4-הפוך | 5 '-TCTCATTGTTGTCGGCTTCCTCCA -3 ' |
| ACTA1-קדימה | 5 '-מגגאכקקיקאקקטוק -3 ' |
| ACTA1-הפוך | 5 '-הקטגתחנת 3 ' |
| Exon22-קדימה | 5 '-TTACCACCAATGCGCTATCA -3 ' |
| Exon22-הפוך | 5 '-CCGAGTCTTCCTCC-3 ' |
| Exon23-קדימה | 5 '-CCAAGAAAGCACCTTCAGAAATATG -3 ' |
| Exon23-הפוך | 5 '-מדריך שלוש ' |
| Exon24-קדימה | 5 '-AAC CTT גה ATG גת GGC-3 ' |
| Exon24-הפוך | 5 '-הקטקק1-3 ' |
| העברה שוטפת | 5-כמוסות מגנט-3 |
| הפוך לחוצה-DH | 5 '-שלוש מנות |
. שולחן 1: רצף פריימר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניוון שרירים duchenne (dmd) היא מחלה תורשתית הרסנית בסופו של דבר מאופיין על ידי חוסר של הדיסטרופין, המוביל ניוון שרירים פרוגרסיבי1,2. התוצאות שלנו להפגין הדיסטרופין המשוחזר הביטוי הגן בתוך Dmdmdx ipsc-נגזר בתאי הקדמון על ידי הגישה של CRISPR/Cas9-תיווך exon23 מחיקה. לגישה זו יש שלושה יתרונות.
ראשון, שיצרנו iPSCs מ Dmdmdx העכבר נגזר פיברופיצוצים באמצעות וקטור RNA שאינו משולב. מגוון של שיטות פותחו כדי ליצור iPSCs, כגון וקטורים הרטרונגינגיליים, אשר לשלב לתוך כרומוזומים מארחים כדי לבטא גנים מתיכנות מחודש, ובכך הנושאת חששות בטיחות. DNA-מבוססי וקטורים כגון וקטורים פלביניים, וירוסים הקשורים adeno ו אדנוירוסים קיימים באופן לא משולב; עם זאת, הם עשויים עדיין להשתלב בכרומוזום המארח בתדר נמוך. במחקר זה, השתמשנו שונה, דבקות וירוס סנדאי, שאינם משולבים וקטור RNA, כדי בבטחה וביעילות לספק תא גזע שעתוק גורמים לפיברותקיעות עבור תכנות מחודש.
הבא, אנו משתמשים CRISPR בתיווך הגנום מחיקה, במקום CRISPR/Cas9-תיווך מדויק תיקון גנטי, כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין ב iPSCs. שיטה זו היא אפשרית ויעילה; קל לעצב gRNAs מרובים כדי למחוק exons מוטנטים מרובים, אשר מתרחשים בחולים רבים DMD האנושי17. מחיקת exon מנצל את הדרך יעילה יחסית הלא הומוולוגי הצטרפות מסלול, ואת השיטה גם נמנעת הצורך לספק תבנית תיקון DNA. לכן, בהשוואה Cas9 בתיווך תיקון דיוק, Cas9 – מתווך אקסון מחיקה מתאים לחולים dmd עם מוטציות גנים מרובים.
בסופו של דבר, אנו המושרה iPSCs מובחן לתוך תאים קדמון מיוגניים, אשר עשוי להפחית את הסיכון של טווריגנזה הנגרמת על ידי iPSCs. בפרוטוקול זה, הצלחנו ביטוי myod באמצעות inducible טטרציקלין מוסדר (ט-On) מערכת וקטורית כדי להבדיל iPSCs לתוך שריר השלד ושלתי18,19.
לסיכום, שילוב של CRISPR/Cas9 הגנום עריכה עם ט-on MyoD הפעלה מערכת עשויה לספק בטוח, ריאלי, אסטרטגיה יעילה עבור מחיקה DMD-Exon23 מוטציה בתאי גזע עבור השתלת תאים בחולים DMD.
כדי לבחור ולמסוק תאים כמו ES ביעילות, אנחנו צריכים לזהות את התאים iPSC מובחן באמצעות הכיפה שלהם כמו מורפולוגיה, ו סמן אובייקט בדיו יכול לעזור לנו תווית שיבוטים בודדים מהחלק התחתון של צלחת התרבות עם מעגל 1.8 mm סביב iPSC שיבוטים. כדי למנוע דליפה של פתרון טריפסין, עלינו למרוח גריז באופן שווה לתחתית הטבעות. כמו כן, לאחר הצבת טבעות מצופה גריז על החלק העליון של מושבות התא מתויג, הטיפול צריך להילקח לא לגעת בטבעות. אחרת, שיבוטים iPSC יהיה מנותק.
לפרוטוקול יש מגבלות; לדוגמה, אנחנו בחרנו מערכת שאינה משולבת RNA וקטורי להפקת iPSCs. עם זאת, השתמשנו במערכת crispr/Cas9 ויראלי כדי למחוק dmd אקסון 23 ו-מערכת הפעלה myod מבוסס-מסתורי כדי לגרום לבידול ipsc מיוגני; לווקטורים האינטגרטיביים הללו יש חששות בטיחותיים. עם זאת, בעיות אלה ניתן לפתור על ידי יישום של מתחם ribonucleoprotein (rnp) המורכב רקומביננטי, טוהר גבוהה S. pyogenes Cas9 נוקלאז עם crrna: tracrrna דופלקס; אנחנו יכולים לבחור שינוי כימית MyoD mRNA הזיהום כדי להבדיל ישירות iPSCs לתוך ושלתי מיוגניים, למרות היעילות עשויה להיות מאתגרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
טאנג וינטרוב תמכו בחלקם על ידי NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
