Summary
Cardiomyocyt spredning efter skade er en dynamisk proces, der kræver en symfoni af ekstracellulære signaler fra ikke-myocyte cellepopulationer. Ved hjælp af afstamning sporing, passiv KLARHED, og tre-dimensionelle hel-mount konfokal mikroskopi teknikker, kan vi analysere indflydelsen af en række forskellige celletyper på hjerte reparation og regenerering.
Abstract
Hjerte-kar-sygdom overgår alle andre dødsårsager og er ansvarlig for en svimlende 31% af dødeligheden på verdensplan. Denne sygdom manifesterer sig i hjerteskade, primært i form af en akut myokardieinfarkt. Med lidt modstandskraft efter skade, den gang sundt hjertevæv vil blive erstattet af fibrøst, ikke-kontraktile arvæv og ofte være en optakt til hjertesvigt. For at identificere nye behandlingsmuligheder inden for regenerativ medicin har forskningen fokuseret på hvirveldyr med medfødte regenerative evner. En sådan model organisme er neonatal mus, som reagerer på hjerteskade med robust myokardieregenerering. For at fremkalde en skade i neonatal mus, der er klinisk relevant, har vi udviklet en operation for at okkludere den venstre anterior faldende arterie (LAD), spejling en myokardieinfarkt udløst af åreforkalkning i det menneskelige hjerte. Når matchet med teknologien til at spore ændringer både inden for kardiomyocytter og ikke-myocyte populationer, denne model giver os en platform til at identificere de mekanismer, der styrer hjerte regenerering. Få indsigt i ændringer i hjertecellepopulationer efter skade engang stolede stærkt på metoder såsom væv ssektioning og histologisk undersøgelse, som er begrænset til to-dimensionel analyse og ofte skader væv i processen. Desuden mangler disse metoder evnen til at spore ændringer i celleslægter, i stedet giver blot et øjebliksbillede af skadesreaktionen. Her beskriver vi, hvordan teknologisk avancerede metoder i afstamning sracing modeller, hele orgel clearing, og tre-dimensionelle (3D) hele mount mikroskopi kan bruges til at belyse mekanismer af hjertereparation. Med vores protokol for neonatal mus myokardieinfarkt kirurgi, væv clearing, og 3D hele organ imaging, de komplekse veje, der inducerer kardiomyocyt spredning kan optrævles, afslører nye terapeutiske mål for hjerte-regenerering.
Introduction
Hjertet har længe været anset for at være et post-mitotisk organ, men de seneste beviser viser, at kardiomyocyt fornyelse forekommer i det voksne menneskelige hjerte på omkring 1% om året1. Men, disse lave satser for kardiomyocyte omsætning er utilstrækkelige til at genopbygge den massive tab af væv, der opstår efter skade. Et hjerte, der har lidt en myokardieinfarkt vil miste omkring en milliard kardiomyocytter, ofte tjener som en optakt til hjertesvigt og pludselig hjertedød2,3. Med over 26 millioner mennesker ramt af hjertesvigt på verdensplan, er der et udækket behov for terapi, der kan vende de skader, som hjertesygdomme4.
For at bygge bro over denne kløft i terapeutisk, forskere er begyndt at undersøge evolutionært bevarede mekanismer, der ligger til grund endogen regenerering efter skade. En model til at studere pattedyr hjerteregenerering er neonatal mus. Inden for ugen efter fødslen har nyfødte mus et robust regenerativt respons efter hjerteskader5. Vi har tidligere vist, at neonatal mus kan regenerere deres hjerte via kardiomyocyt spredning efter en apikal resektion5. Selv om denne teknik kan fremkalde hjerteregenerering i nyfødte, mangler operationen klinisk relevans for menneskelige hjerteskader. For at efterligne en menneskelig skade i neonatal mus model, har vi udviklet en teknik til at fremkalde en myokardieinfarkt gennem en koronararterie okklusion6. Denne teknik kræver kirurgisk ligation af venstre anterior faldende arterie (LAD), som er ansvarlig for at levere 40%-50% af blodet til venstre ventrikulær myokardiet6,7. Således, operationen resulterer i en infarkt, der påvirker en betydelig del af venstre ventrikelvæg. Denne skade på myokardiet vil stimulere kardiomyocyt spredning og hjerte regenerering i nyfødte5.
Koronararterieokklusionkirurgi giver en meget reproducerbar og direkte translationel metode til at afdække de indre funktioner i hjerteregenerering. Den neonatal kirurgi paralleller koronararterie åreforkalkning i det menneskelige hjerte, hvor ophobning af plak inden for de indre vægge af arterierne kan forårsage en okklusion og efterfølgende myokardieinfarkt8. På grund af et tomrum i terapeutiske behandlinger for hjertesvigt patienter, en okklusion i LAD er forbundet med dødelighed en nåede op til 26% inden for et år efter skade9, og derfor er blevet kaldt "enke maker." Fremskridt inden for terapi kræver en model, der præcist afspejler de komplekse fysiologiske og patologiske virkninger af hjerteskade. Vores kirurgiske protokol for neonatal mus hjerteskade giver en platform, der giver forskerne mulighed for at undersøge de molekylære og cellulære signaler, der signalerer pattedyr hjerte regenerering efter skade.
Nyere forskning fremhæver det dynamiske forhold mellem det ekstracellulære miljø og prolifererende kardiomyocytter. For eksempel kan det postnatale regenerative vindue forlænges ved at mindske stivheden af den ekstracellulære matrix omkring hjertet10. Biomaterialer fra neonatal ekstracellulær matrix kan også fremme hjerte regenerering i voksne pattedyr hjerter efter hjerteskade11. Også ledsagende kardiomyocyt spredning er en angiogenic respons12,13; sikkerhedsstillelse arterie dannelse unikke for regenererende hjertet af neonatal musen viste sig at være afgørende for at stimulere hjerteregenerering12. Desuden har vores laboratorium vist, at nerve signalering regulerer kardiomyocyt spredning og hjerte regenerering via graduering af vækstfaktor niveauer, samt den inflammatoriske reaktion efter skade14. Disse resultater understreger behovet for at spore ikke-myocyt cellepopulationer som reaktion på hjerteskade. For at nå dette mål, har vi benyttet os af Cre-lox rekombinationssystem i transgene mus linjer til at indarbejde konstituerende eller betinget udtryk for fluorescerende reporter proteiner til afstamning sporing. Desuden kan vi bruge avancerede metoder til at bestemme klonale ekspansion mønstre med Rainbow muselinje, som er afhængig af stokastiske udtryk for Cre-afhængige, multi-farve fluorescerende journalister til at bestemme klonal udvidelse af målrettede cellepopulationer15. Beskæftiger afstamning opsporing med neonatal koronararterie okklusion kirurgi er et kraftfuldt værktøj til at dissekere de indviklede cellulære mekanismer hjerteregenerering.
Sporing afstamning af fluorescerende mærkede celler med tre-dimensionelle (3D) hele organ imaging er vanskeligt at opnå ved hjælp af traditionelle skæring og genopbygning teknik – især når cellepopulationer er skrøbelige, såsom nervefibre eller blodkar. Mens direkte hel-mount billeddannelse af orglet ved optisk skæring kan fange overfladiske cellepopulationer, strukturer, der bor dybt inde i vævet forbliver utilgængelige. For at omgå disse barrierer er der udviklet vævsrydningsteknikker for at reducere opaciteten af hele organvæv. For nylig, betydelige fremskridt er blevet gjort for at Clear Lipid-udvekslede Acrylamid-hybridiseret Rigid Imaging kompatible Tissue hYdrogel (CLARITY)-baserede metoder, som klare fast væv via lipid ekstraktion16. Der tages også skridt til at homogenisere brydningsindekset og derefter reducere lysspredning, mens billeddannelse17. En sådan metode er aktiv CLARITY, som fremskynder lipid nedbrydning ved hjælp af elektroforese at trænge ind i vaskemiddel i hele vævet18. Selv om effektiv, denne væv clearing metode kræver dyrt udstyr og kan forårsage vævsskader, hvilket gør tilgangen uforenelig med skrøbelige cellepopulationer såsom hjertenerver19. Således anvender vi den passive CLARITY tilgang, som er afhængig af varme til forsigtigt at lette vaskemiddel penetration, derfor medvirken i fastholdelsen af indviklede cellestrukturer20,21.
Passiv KLARHED menes typisk at være mindre effektiv end aktiv CLARITY18, da teknikken ofte ledsages af to store hindringer: den manglende evne til at rydde hele organdybden og den omfattende tid, der kræves for at rydde voksenvæv. Vores passive CLARITY tilgang overvinder begge disse barrierer med en fremskyndet clearing proces, der er i stand til fuldt ud at rydde neonatal og voksen hjertevæv. Vores passive CLARITY vævsrydningsteknik har nået en effektivitet, der gør det muligt at visualiseringaf en række hjertecellepopulationer, herunder sjældne populationer fordelt over hele det voksne hjerte. Når det ryddede hjerte er afbildet med konfokal mikroskopi, kan arkitekturen af celle-specifikke mønstre under udvikling, sygdom og regenerering belyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen for brug og pleje af laboratoriedyr og i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care and Use Committee i School of Medicine and Public Health ved University of Wisconsin-Madison. Alle metoder blev udført på vilde type C57BL/6J (B6) og transgene muselinjer fremstillet af Jackson Laboratories.
1. Koronararterie Okklusion (Myokardieinfarkt) Induceret via Ligation af venstre anterior faldende arterie (LAD) i 1-dags-gamle neonatal mus6
- Adskil de 1-dages gamle nyfødte hvalpe fra moderen ved at placere dem i et rent bur sammen med nogle af de oprindelige redemateriale.
- Placer halvdelen af buret på en varmepude indstillet til medium varme. Ungerne skal forblive på den uopvarmede side af buret, kun placeres på den opvarmede side efter operationen.
- Opret et sterilt kirurgisk område under et operationsmikroskop. Saml steriliseret kirurgisk udstyr (Tabel 1).
- Bedøve hvalpen via hypotermi: pak hvalpen ind i gaze for at undgå direkte hudkontakt med is og begrave den i en isseng i ca. 3-4 min. Kontroller jævnligt hyptermi af musene ved at udføre en tåknivspids. Nyfødte tåler hypotermi godt, dog, langvarig udsættelse for hypotermi kan resultere i forfrysninger og efterfølgende dødelighed.
- Når bestøvet, placere musen på det kirurgiske område i supine position, sikring af arme og ben med tape. Steriliser det kirurgiske område af musen med en antiseptisk opløsning.
- Find den nederste bryst region og gøre en tværgående snit i huden med små dissekere saks. For at udvide det kirurgiske udsyn af ribbenene skal du adskille huden fra musklen ved at løfte huden forsigtigt med et par bandagepincet og forsigtigt trykke mod de interkostale muskler med den lille saks i lukket position.
- Find det fjerde interkostale rum (Figur 1A) og lav en lille, overfladisk punktering med skarpe pincet, idet man er omhyggelig med ikke at punktere nogen indre organer. Udfør en stump dissektion ved at udvide området i mellem de interkostale muskler med dressing pincet. Korrekt anatomisk positionering af snittet er afgørende for passende adgang til hjertet.
- Forsigtigt guide hjertet ud af brysthulen ved at placere en finger og anvende stigende pres på venstre side af maven, mens du holder interkostale rum åbent med dressing pincet (Figur 1B). Når hjertet er uden for brystet, fjerne dressing pincet, lindre trykket, og lad hjertet til at hvile på de interkostale muskler.
- Find LAD som det område af hjertet, der har mindre poolet blod og er i den korrekte anatomiske position (Figur 1C). LAD kan kun ses under mikroskopet, hvis hjertet er adgang til inden for et par minutter efter operationens begyndelse.
- Udfør LAD ligation ved at suturere LAD med en 6-0 sutur (Figur 1D). Bind en firkantet knude to gange for at fremkalde myokardieinfarkt (Figur 1E). Dybden af suturen i myokardiet kan variere, men korrekt anatomisk positionering af LAD ligation er afgørende for reproducerbarhed. Når ligating LAD, bør suturen trækkes stramt, men omhyggeligt for ikke at afskære LAD. Blanchering i hjertets spids vil straks ses (Figur 1E)
- Lad hjertet glide tilbage i brysthulen; denne proces kan forsigtigt lettes med dressing pincet. Sutur ribbenene sammen med en kirurgknude efterfulgt af en firkantet knude, ved hjælp af stumpe pincet til at løfte det øverste sæt ribben, mens de passerer en 6-0 sutur gennem den øvre og nedre sæt ribben.
- Fjern båndet, der blev brugt til at sikre bagbenene på hvalpen.
- Fasthold huden sammen ved at placere en lille mængde hudlim på den øvre del af maven. Derefter, grab huden af underlivet med fine pincet og dække den eksponerede brystet regionen. Begræns mængden af overskydende lim, der forbliver på hvalpene, da dette kan øge sandsynligheden for afvisning og kannibalisme af moderen.
- Straks lette inddrivelse fra anæstesi ved at placere hvalpen på en varmepude indstillet til medium varme. Skifte regelmæssigt placeringen af nyfødte til jævnt varme alle dele af kroppen.
- Lad nyfødte forblive direkte på varmepladen i 10-15 min. Typisk genvindes bevægelsen inden for 5 minutter efter at være placeret på varme.
- Rengør restblod og lim med en alkohol tørre.
- Dæk udenlandske dufte på nyfødte ved at gnide hele kroppen med strøelse fra det oprindelige bur. Placer hvalpen ind i buret på den opvarmede side, mens andre operationer udføres.
- Når alle operationer er afsluttet, og hvalpene er varme og mobile, overføre kuldet sammen med den oprindelige redemateriale til moderens bur.
- Overvåg musene i 30-60 min efter operationen og hold øje med moderens accept af hvalpene ved redebygning og /eller grooming.
- Tjek musene morgenen efter operationen. Hvis mor er bedrøvet og ikke har indlejret hvalpene, overveje en plejemor til hvalpene.
2. Rydning af musehjertet med passiv klarhed21,,22,,23
- Bedøve musen med isofluran. Udfør en tåklemme for at sikre, at musen er helt bedøvet.
- Placer musen på et rent, kirurgisk område i supine position, sikring af arme og ben med tape.
- Vedligehold isofluran sedation på musen ved hjælp af en næse kegle, indtil hjertet er udvundet.
- Åbn den nederste bryst kasse ved at holde pelsen lige under xiphoid processen med væv pincet og gøre et snit spænder over bredden af brystkassen ved hjælp af den store dissekere saks.
- Skær sammen med de distale dele af brystkassen med kirurgisk saks.
- Eksponere mellemgulvet muskel ved at gribe xiphoid processen med væv pincet. Afmonter mellemgulvet ved hjælp af buede pincet.
- Samtidig opretholde en forståelse af xiphoid proces, trække vævet kranialt, indtil det bankende hjerte er tilgængelig.
- Tag fat i hjertet i bunden med buede pincet og dissekere hjertet fra brysthulen ved at skære aorta og overlegen vena cava med iridectomy saks.
- Mens hjertet stadig slår, placere hjertet i en petriskål fyldt med PBS, så hjertet pumper ud blodet inde, da det holder slå. Myokardieinfarkt kan bekræftes ved at kontrollere, at placeringen af suturen er i den rette anatomiske position for LAD ligation.
- Klem forsigtigt hjertet med pincet for at lade hjertet udvise det resterende blod.
- Overfør musehjertet til et engangsglashætteglas på 2,5 ml med 2 ml PBS. Vask restblod væk ved at inkubere hjertet på en shaker i 10 min ved stuetemperatur (RT) flere gange. Skift PBS-opløsningen hver gang, indtil PBS forbliver klar.
- Pbs'en kasseres, og hætteglasset fyldes med 2 ml kold 4% paraformaldehyd (PFA). Inkuber i 4 timer ved RT (Figur 2A).
- Efter inkubation ender PFA og hætteglasset med 2 ml PBS. Vask hjertet på en shaker i 10 min ved RT. Gentag vasketrinnet to gange, tøm og fyld hætteglasset med ny PBS hver gang for at vaske overskydende PFA helt væk.
- Opløsningen kasseres, og hætteglasset fyldes med 2 ml 4 % acrylamid og 0,5 % VA-044-opløsning. Inkuber natten over ved 4 °C.
- Den næste dag udføre polymerisering ved at overføre hætteglasset til en varmeblok sat til 37 °C i 3 timer.
- Hjertet overføres til et nyt glashætteglas, og trin 2.12 gentages (PBS-vaskecyklus).
- Opløsningen kasseres, og hætteglasset fyldes med 2 ml rydningsopløsning (tabel 2). Inkuber ved 37 °C, indtil hjertet er ryddet. Skift opløsningen ud og genopfyld med frisk rydningsløsning hver 2-3. Clearingprocessen kan tage op til flere uger (figur 2B-C).
BEMÆRK: P1 hjerter typisk tage omkring 3-5 dage, mens P21 hjerter kan tage næsten en måned før Clearing Solution inkubation er færdig. - Opløsningspbs gensmid og hætteglasset fyldes med 2 ml PBS og gentages trin 2.12 (PBS-vaskecyklus). Fyld hætteglasset op med frisk PBS og inkuber natten over ved 37 °C.
- Hvis der udføres immunfarvning, skal trin 2.21-2.22 springes over og fortsætte til afsnit 3 for immunfarvning. Hvis du udelukkende er afhængig af endogen fluorescens, skal du fortsætte med trin 2.21-2.22 og springe afsnit 3 over.
- Kassér PBS, og omskift opløsningen til Brydningsindeksmatchingsopløsning (RIMS) (tabel 3). Inkuber natten over ved 37 °C.
- Efter inkubation kan det rensede væv opbevares i RIMS-opløsning ved RT. Væv kan se ud til at være hvidt og uigennemsigtigt i midten, når det først overføres til RIMS. væv skal blive gennemsigtigt efter at være blevet inkuberet i RIMS ved stuetemperatur i flere uger (figur 2D).
3. Valgfrit: Immunhistokemi Farvning af hele Mount Mouse Heart
- Fjern det fjernede hjerte fra RIMS-opløsningen og anbringes i et rent 2,5 ml glasglas med 2 ml PBST (PBS med 0,1% Triton-X 100)
- Vask hjertet i PBST 3 gange på en orbital rotator med 30 min inkubationer på RT.
- Bloker ikke-specifik antistofbinding ved nedsænkning af hjertet i 2 ml 20% blokerende buffer (fortyndet i PBST) og inkuberes med rotation i 3 timer ved RT. Overførsel til 4 °C til pletten med rotation natten over.
BEMÆRK: Blokeringsbufferen er fremstillet af normalt serum, der matcher den art, hvori det sekundære antistof blev rejst. - Hjertet vaskes 3 gange med rotation i 5 min inkubationer ved RT.
- Der neddykkes hjertet i det primære antistof (fortyndet i 2% blokerende buffer med PBST) og undgå lyseksponering ved at pakke glashætteglasset ind i aluminiumsfolie. Inkuber med rotation natten over på RT.
BEMÆRK: Fra dette punkt og frem skal aluminiumsfolie kontinuerligt anvendes til at beskytte den sekundære mod eksponering for omgivende lys. - Inkuber i yderligere 24 timer med rotation ved 4 °C.
- Efter primær farvning gentages trin 3.2 (lang PBST-vaskecyklus) for at fjerne det ubundne primære antistof fra vævet. Vask en natten over inkubation med rotation på RT.
- Arbejde i et område med begrænset belysning for at forhindre sekundær antistoflyseksponering, hjertet nedsænkes i sekundært antistof (fortyndet i 2% blokerende buffer med PBST) og inkuberes med rotation i 3 timer ved RT. Overførsel til 4 °C for at plette med rotation natten over.
- Den næste dag gentages trin 3.2 (lang PBST-vaskecyklus) for at fjerne ubundet sekundært antistof.
- Udskift opløsningen med 2 % blokerende buffer (fortyndet i PBST). Fjern det resterende ubundne antistof ved at vaske natten over med rotation ved RT.
- Den næste dag skal det kontrolleres, at overskydende sekundært antistof er blevet fjernet ved hjælp af konfokal mikroskopi. Forlæng vasken efter behov og udskiftning af 2% blokerende bufferopløsning dagligt. Fortsæt en gang lidt at ingen ikke-specifikke sekundære er til stede.
- Opbevar det immunplettede hjerte i PBS ved 4 °C.
- Umiddelbart før hel-mount mikroskopi, inkubere hjertet i RIMS opløsning natten over ved 37 °C. Udvid inkubationen yderligere 24 timer, hvis vævet stadig ikke er helt ryddet.
- Opbevar det fuldt ryddede og immunbesværede hjerte i RIMS på RT.
4. Visualisering af ikke-myocyte populationer i 3D med single-foton konfokal mikroskopi imaging af ryddet mouse hjerte
BEMÆRK: Hvis musehjerter høstes embryonisk, skal du fortsætte med punkt 4.1. For musehjerter, der høstes postnatalt, skal du fortsætte med punkt 4.2.
- Billedbehandling af ryddet embryonale mouse hjerte
- Fyld mikroskopfordybningsdiaset med PBS-opløsningen.
- Forsigtigt afhente det ryddede hjerte med buede pincet og placere vævet på diaset.
- Monter slæden med en glasdæksel. Vævet kan nu afbildes under et konfokalt mikroskop.
- Imaging den ryddet postnatal Mouse Heart
- Fyld halvdelen af kammeret i fordybningsslidningen med PBS-opløsning. For at skabe et kammer stort nok til at passe en voksen mus hjerte, en 3D-trykt polypropylen depression dias var skræddersyet (Figur 4).
- Forsigtigt afhente det klare hjerte med buede pincet og placere vævet ind i kammeret. Fyld det resterende rumfang i kammeret med PBS.
- Fyld kammeret med PBS, så væskens overflade danner en kuppel over toppen af kammeret. Monter dækselsliden. Vævet kan nu afbildes under et opretstående konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ofte er de to mest udfordrende trin vejlede hjertet ud af brysthulen og ligating LAD. For at foretage fejlfinding af disse trin kan der foretages justeringer i placeringen af den indledende punktering mellem de fjerde interkostale muskler. Hvis punkteringen og den stumpe dissektion er for tæt på brystbenet, kan hjertet muligvis ikke forlade brysthulen (figur 1A).
Desuden kan øget pres på venstre mave være nødvendigt for at lette denne proces (Figur 1B). Komplikationer kan også opstå, når hvile hjertet på interkostale muskler. Vi fandt hjertet vil forblive uden for hulrummet uden at trække sig tilbage, når den stumpe dissektion holdes til en minimal størrelse og udføres hovedsageligt i vandret retning. Denne orientering giver også mulighed for klar visualisering og tilgængelighed til LAD (Figur 1C).
Når suturnålen placeres bag LAD'en, foreslås det at trænge dybt ind i den foranstående væg i venstre ventrikel, da en overfladisk ligation har mindre plads til justering i den endelige suturplacering (Figur 1D). Binde sutur omkring LAD bør udføres med kontrollerede, stabile bevægelser, som LAD er skrøbelig og afskære denne koronararterie og den anterior væggen vil forårsage dødelighed (Figur 1E). Inden for 5-10 minutter efter operationen er færdig, bør nyfødte være livlig og vejrtrækning normalt.
Når man går videre til den passive CLARITY protokol, hjerter høstet fra en mus linje, der indeholder en endogen fluorescerende reporter for celle afstamning sporing bør beskyttes mod lys (Figur 2), som kan opnås ved indpakning glashætteglasset i aluminiumsfolie. Under clearingtrinnet er den tid, der inkuberer i Clearing Solution, variabel afhængigt af musens alder, når hjertet blev høstet. Dette trin er fuldført, når hele vævet er konsekvent uigennemsigtigt, uden misfarvning i midten (Figur 2B-C). Hjerterne bliver mere og mere gennemsigtige efter opbevaring i RIMS-opløsning ved stuetemperatur i et par dage (Figur 2D). Det skal bemærkes, at væv ekspansion kan forekomme under clearingprocessen.
Vores passive CLARITY protokol tillader effektiv antistof penetration og er dermed kompatibel med immunhistokemi metoder til at mærke protein (r) af interesse. Dette blev valideret i Actl6bCre; Rosa26tdT transgene mus, som mærke modne neuroner med tdTomato (tdT) reporter protein. Hjertenerverne er hovedsageligt overfladiske, med nogle populationer bosat i epikardielaget, derfor brugte vi denne cellepopulation som en proof-of-principal model for reproducerbarheden af endogene reporter signal (Figur 3A), samt bevarelse af reporter protein kropsbygning før og efter CLARITY ( Figur3B-C). Vores repræsentative resultater fra Actl6bCre; Rosa26tdT mus viser, at det endogene tdT protein signal ses i nerver af en uklar P7 hjerte blev trofast opsummeret i nerver af både uklare og ryddet tdT immunmærket P7 hjerter (Figur 3). Til immunlabel tdT-positive nerver, en Rød fluorescerende Protein (RFP) primære antistof (kanin polyklonale; 1:200 fortynding; Rockland #600-401-379) blev brugt sammen med et Alexa Fluor 488 sekundært antistof (gedepolyklonal; 1:1000 fortynding; Invitrogen #A-11008). For at visualisere det ryddede hjerte med øjet under immunfarvning og billeddannelse trin, en ultraviolet lommelygte kan kortvarigt bruges til at belyse hjertet.
Figur 1: Induktion af myokardieinfarkt i neonatal mus gennem koronararterieokklusion af venstre anterior faldende arterie (LAD). (A) Det fjerde interkostale rum, angivet med en enkelt stjerne (*), er placeret, og der udføres en stump dissektion. (B) Der påføres tryk på venstre mave for at føre hjertet ud af brysthulen. (C) LAD'en, der er mærket af en dobbelt stjerne (**), identificeres som den fremherskende arterie og anatomisk position. (D, E) En sutur er derefter gået bag LAD og en firkantet knude er bundet omkring LAD at fremkalde en koronararterie okklusion og efterfølgende infarkt. (E) Når den er færdig, kan blanchering ses under suturen, i hjertets spids. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Progression af den passive CLARITY metode på en P14 Mouse Heart. Hjerter blev høstet fra P14 mus, (A) fast, og (B-D) gennemgik den passive CLARITY protokol. For hjerter taget på en P14 tidspunkt, Clearing Solution inkubation trin er (B) ufuldstændig, når misfarvning i midten af hjertet er tilsyneladende, set efter 6 dage, og (C) komplet, når hjertet vises jævnt uigennemsigtig, set efter 10 dage. (D) Når hjertet er gemt i RIMS, er vævet helt ryddet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: 3D-billeddannelse af P7 Mouse Hearts med konfokal mikroskopi. Repræsentative hele montere 3D-billeder fra P7 Actl6bCre; Rosa26tdT transgene mus hjerter er vist som maksimal intensitet fremskrivninger af z-stablet billeder. Hjerter blev afbildet for at vise (A) endogent tdTomato (tdT) fluorescens direkte efter høst (rød) (B) immunfarvning af tdT-positive nerver i et uklart hjerte (Alexa Fluor 488; grøn) og (C) reproducerbar immunmærkning af tdT-positive nerver i et ryddet hjerte (Alexa Fluor 488; grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: 3D Printed Polypropylen Depression Slides. At billedet de postnatale hjerteprøver, brugerdefinerede depression dias blev 3D trykt på polypropylen. Glidedimensionerne er 25 mm x 75 mm x 1 mm, med en glidefordybning sgodt 13 mm i diameter og enten (A) 6,5 mm eller (B) 17 mm i dybden. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Udstyrstype | Beskrivelse | Virksomhed | Katalognummer |
| Glashætteglas | 12 x 35 mm hætteglas med hætte | Fisherbrand (Fisherbrand) | 03-339-26A |
| 6-0 Prolene suturer | Polypropylen suturer | Ethicon (Etik) | 8889H |
| Skarpe pincet | Fine Tip, Straight, 4,25 i | Sigma-Adrich delte et link. | Z168777 |
| Dressing pincet | Dissekere, 4,5 i | Fisherbrand (Fisherbrand) | 13-812-39 |
| Nåleholder | Mayo-Hegar, 6 i | Fisherbrand (Fisherbrand) | 08-966 |
| Lille dissekeret saks | 30 mm skærkant | Walter Stern Inc. | 25870-002 |
| Væv pincet | Medium væv, 1X2 tænder | Excelta (Excelta) | 16050133 |
| Stor dissekerensaks | Lige, 6 i | Fisherbrand (Fisherbrand) | 08-951-20 |
| Iridektomi saks | 2 mm skærkant | Fine Science Tools | 15000-03 |
| Buede pincet | Halvt buet, savtakket, 4 i | Excelta (Excelta) | 16-050-146 |
Tabel 1: Kirurgisk udstyr.
| Rydningaf løsning | |||
| Reagens | Endelige | Beløb | Noter |
| Natriumdodelsulfat (SDS) | 8,0% m/v | 40 g | |
| Borsyre | 1,25% m/v | 6,25 g | |
| 1-thioglycerol | 0,5% m/v | 5 μL/ml | Tilføjet efter behov for løsning |
| Der tilsættes 400 ml ultrarent H20 til 1 L bægerglas. Blandes i SDS og Boric Acid med magnetisk omrøring. | |||
| PH justeres til 8,5 ved hjælp af 6M NaOH. Volumen et volumen på 500 ml og Autoklave. | |||
| Opbevar opløsningen ved stuetemperatur. | |||
| Andre CLARITY Reagenser | |||
| Reagens | Endelige | Lager | Noter |
| Pfa | 4.0% | 16% | Fortyndet i PBS |
| Acrylamid | 4.0% | 40% | Fortyndet i PBS |
| VA-044 | 0.5% | 10% | Tilføjet efter behov for løsning |
Tabel 2: Rydningsopløsning og andre CLARITY-reagenser.
| Reagens | Endelige | Beløb |
| Fosfatbuffer | 0,02 M | 90 ml |
| Histodenz (Histodenz) | 133,3% m/v | 120 g |
| Natrium azid | 0,05% m/v | 45 mg |
| Der tilsættes 90 ml 0,02 M Fosfatbuffer til 250 ml glasmedieflaske pakket ind i aluminiumsfolie. | ||
| Blandes i reagenser, der er opført med magnetisk omrøring. Lad komponenterne opløses natten over. | ||
| Vortex opløsning og filter renses med filtreringssystem i en steril 250 ml glasmedieflaske. | ||
| Wrap flaske i aluminiumsfolie og opbevare opløsning ved stuetemperatur. | ||
Tabel 3: Brydningsindeksmatchningsopløsning (RIMS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celle-celle interaktioner mellem kardiomyocytter og ikke-myocyt populationer er en afgørende faktor for, om hjertet vil gennemgå fibrose eller reparation efter skade. Opdagelser er blevet gjort viser, at en række celletyper, herunder nerver14, epikardieceller24, peritoneal makrofager25, arterioler12,13, og lymfeformet endotelceller26, alle spiller en væsentlig rolle i mægle hjertereparation. Disse celleslægter og andre af interesse kan spores genetisk under udvikling, sygdom og regenerering ved at anvende Cre-lox og CRISPR-Cas9 teknologier i mus. Når de kombineres med organclearing og avancerede mikroskopimetoder, kan bidragene fra ikke-myocytepopulationer vurderes nøjagtigt, hvilket åbner døren for at belyse cellulære og molekylære mål for myokardieregenerering efter skade.
Effektiviteten af protokollen er afhængig af konsekvent og reproducerbar ligation af LAD under koronararterie okklusion kirurgi. Neonatal mus er følsomme over for udvidet eksponering for hypotermi; Derfor skal operationen ikke kun udføres med nøjagtighed, men også inden for få minutter. Fra start til, bør myokardieinfarkt kirurgi tage mindre end 8 minutter. Vi anbefaler først at øve på flere kuld af samme baggrund som de eksperimentelle mus, indtil der opnås færdigheder.
Progression af hjertereparation kan vurderes ved hjælp af ekkokardiografi til måling af hjertefunktion (dvs. fraktioneret afkortning, udslyngningsfraktion, systolisk og diastolisk volumen) én gang inden for 3 til 7 dage efter operationen og igen kort før høst af hjertet , foreslog mellem 21- og 28-dage efter skaden. Hjerter kan indsamles til clearing på flere tidspunkter efter myokardieinfarkt kirurgi.
Clearingtrinnet (trin 2.17) er genstand for variation i varighed afhængigt af alder og stamme af musen, hvorfra hjertet blev høstet, hvilket kan resultere i forskelle i hjertestørrelse. For en B6-baggrundsmus estimeres clearingvarighed baseret på alder som følger: P1 (7-10 dage), P7 (14-17 dage), P14 (21-24 dage), P21 (28-31 dage), P28 (35-38 dage). Selv om det primære fokus for vores laboratorium er hjerteclearing, har vores passive CLARITY-metode været en succes til rydning af muslunger (ikke-offentliggjorte resultater), og vi forudser ingen grænse for bredt at anvende dette på andre organer. Samlet set er vores fremskyndede clearingproces højt værdsat for evnen til at rydde væv hurtigt og effektivt.
Det skal bemærkes, at der kan opstå komplikationer ved anvendelse af vævsrydningsteknikker i organer med endogene journalister i sjældne delpopulationer. Reporter signal i tætte cellepopulationer (såsom myocytter23) synes at være mere modstandsdygtige over for clearingprocessen og dermed signalet er typisk bevaret; andre mere følsomme cellepopulationer (såsom hjertenerver) er dog tilbøjelige til at have endogenfluorescerende proteinsignal slukket efter langvarig fiksering eller rydning. Dette blev tydeligt i Actl6bCre; Rosa26tdT reporter mus model, hvor P7 hjerter fast kort i 15 minutter viste stærke tdT signal (Figur 3A), men dette fluorescerende signal blev slukket efter fiksering i 1 time eller natten inkubation i Clearing Solution (data ikke vist). I scenariet med tabt reporter signal, antistof farvning rettet mod reporter protein er forenelig med væv clearing at forstærke signalet (Figur 3). Tilføjelsen af et immunmærkningstrin kan være fordelagtigt for væv, der gennemgår omfattende billeddannelse, da konjugerede antistoffer er blegemiddelresistente og giver et stabilt, langsigtet udtryk. Med evnen til at spore proteiner endogent og gennem immunfarvning, vores protokol entydigt giver mulighed for præcis lokalisering af sjældne hjertecellepopulationer, der bor dybt inde i hjertet.
Ryddet hjerter kan gennemgå afstamning sporing eller fluorescerende protein udtryk analyse ved hjælp af hele mount 3D konfokal mikroskopi. Det konfokale mikroskop er udstyret med laserlinjer, der er optimeret til at ophidse lysstofreportere (eller konjugerede sekundære antistoffer), for eksempel: BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555) og APC (Cy5, Alexa Fluor 647) ved henholdsvis 405 nm, 488 nm, 561 nm og 683 nm. For hjerteprøver ude af stand til at passe ind i en depression dias - fælles, hvis hjertet høstet postnatalt - en brugerdefineret depression dias kan foretages ved 3D-udskrivning på polypropylen. Brugerdefinerede objektglas fulgte dimensionerne af et mikroskopfordybningsdias (25 mm x 75 mm x 1 mm), der varierede brønddybden til enten 6,5 mm eller 17 mm (Figur 4).
For at visualisere reporter cellelinjer i 3D, er det konfokale mikroskop indstillet til at erhverve z-stablede billeder i hele hjertet. Når billeddannelse større hjerter, kan hele hjertet ikke være i stand til at blive fanget i en enkelt z-stablet billede selv med en lav forstørrelse mål. I dette scenario kan en række flere z-stablede billeder taget på forskellige hjerteområder sys sammen ved hjælp af en stor billedfunktion. Dette opnås ved at kalibrere mikroskopet til den relevante objektive linse og angive feltet for det store billedscanningsområde. Derefter gennemgår z-stablede billeder 3D-rekonstruktion ved hjælp af et volumengengivelsesprogram og maksimal intensitetsprojektion (Figur 3). De højopløsningsbilleder, der erhverves, kan analyseres for at bestemme præcise 3D-rumcellemønstre for målrettede cellepopulationer.
Kollektivt, denne protokol giver et kraftfuldt molekylært værktøj til at forstå de dynamiske cellulære ændringer, der opstår under hjertereparation og regenerering. Denne metode beskriver trinene til at fremkalde en myokardieinfarkt, udføre hele organclearing, spore cellespecifikke populationer og analysere 3D-cellemønstre. Tilsammen giver disse teknikker adgang til sporcellepopulationer, der tidligere var utilgængelige på grund af deres sparsomme tilstedeværelse eller placering i vævet. Dette vil gøre det muligt yderligere undersøgelse af spørgsmål, der er af afgørende betydning for at fremme terapeutiske tilgange til regenerativ medicin, især dem, der har til formål at stimulere endogen hjerteregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har modstridende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansieringen af dette projekt blev ydet af UW School of Medicine and Public Health fra Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), og en American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
- Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
- Lusis, A. J.
- MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
- Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
- Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
- Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
- Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
- Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).
