Summary

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

Published: December 18, 2019
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Summary

Este protocolo descreve a microdissecção da captação do laser para a isolação da cartilagem e do osso das seções congeladas frescas do embrião do rato. Cartilagem e osso podem ser rapidamente visualizados por manchas violetas cresyl e coletados precisamente para produzir RNA de alta qualidade para análise transcriptômica.

Abstract

A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos específicos de células ou regiões de interesse de tecidos heterogêneos. A complexidade celular e molecular de elementos esqueléticos aumenta com o desenvolvimento. A heterogeneidade tecidual, como na interface de elementos cartilaginosos e osseos uns com os outros ou com tecidos circundantes, é um obstáculo para o estudo do desenvolvimento de cartilagem e osso. Nosso protocolo fornece um método rápido de processamento de tecidos e isolamento de cartilagem e osso que produz RNA de alta qualidade para análise de expressão gênica. Os tecidos congelados frescos de embriões do rato são seccionados e a mancha violeta breve do cresyl é usada para visualizar a cartilagem e o osso com as cores distintas dos tecidos circunvizinhos. Slides são então rapidamente desidratados, e cartilagem e osso são isolados posteriormente por LCM. A minimização da exposição a soluções aquosas durante este processo mantém a integridade do RNA. A cartilagem e osso mandibular do rato Meckel na E16.5 foram coletados com sucesso e a análise da expressão gênica mostrou expressão diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteócitos, osteoclastos e condrocitos. O RNA de alta qualidade também foi isolado de uma variedade de tecidos e idades embrionárias. Este protocolo detalha a preparação da amostra para LCM que inclui o cryoembedding, seção, coloração e desidratação de tecidos congelados frescos, e a isolação precisa da cartilagem e do osso por LCM tendo por resultado o RNA de alta qualidade para a análise transcriptomic.

Introduction

O sistema musculoesquelético é um sistema multicomponente composto de músculo, tecido conjuntivo, tendão, ligamento, cartilagem e osso, interno e vascularizado pelos vasos sanguíneos1. Os tecidos esqueléticos desenvolvem-se com o aumento da heterogeneidade celular e complexidade estrutural. Cartilagem e osso se desenvolvem a partir da mesma linhagem osteochondroprogenitor e são altamente relacionados. Cartilagem embrionária e osso se desenvolvem em associação com músculos, nervos, vasos sanguíneos e mesenchyme indiferenciado. A cartilagem também pode ser cercada por ossos, como a cartilagem de Meckel e cartilagem condylar dentro do osso mandibular. Estes tecidos são anatomicamente associados e interagem uns com os outros através de sinais extracelulares durante o desenvolvimento. No estudo da expressão gênica no desenvolvimento de cartilagem e osso, um obstáculo é a heterogeneidade de estruturas esqueléticas compostas por múltiplos tipos de tecido. O isolamento preciso do tecido específico de interesse é fundamental para uma análise transcricional bem-sucedida.

A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos de células ou regiões de interesse dentro de tecidos heterogêneos, e é reproduzível e é sensível ao nível de célula única2. Ele pode precisamente alvo e capturar células de interesse para uma ampla gama de ensaios a jusante em transcriptômica, genômica e proteômica3,4. A qualidade do RNA, DNA ou proteína isolado pode ser avaliada com um bioanalisador ou plataforma equivalente. Por exemplo, a qualidade do RNA é indicada pelo número de integridade do RNA (RIN)5.

Aqui, nós fornecemos um protocolo para a coloração rápida e isolamento da cartilagem e osso por LCM de tecidos congelados frescos. Usamos o embrião do camundongo para demonstrar que este protocolo produz RNA de alta qualidade para análise transcriptômica subsequente, como sequenciamento de RNA (RNA-seq).

Protocol

Tecidos de camundongos foram obtidos de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, e protocolos de estudo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Icahn School of Medicine no Monte Sinai. 1. Preparação de espécime congelado fresco Dissecar o embrião ou tecido de interesse. Incorporar a amostra em um molde de incorporação descartável com temperatura de corte ideal (OCT) composto. Ajuste a orientação …

Representative Results

As seções coronais de tecidos frescos do rato congelado em E16.5 foram usadas para demonstrar a isolação e a coleção da cartilagem de Meckel (MC), da cartilagem condylar, e do osso mandibular por LCM. Embriões de camundongos na E16.5 foram dissecados e embutidos em moldes criogênicos com composto OCT. As amostras nos moldes foram congeladas ràpida em um gelo seco e em um banho metil-2-butano e armazenadas em -80 °C. Para demonstrar a coloração violeta do cresyl da cartilagem e do o…

Discussion

O LCM permite o isolamento de populações de células enriquecidas ou homogêneas de tecidos heterogêneos. Suas vantagens incluem a captura rápida e precisa de células em seu contexto in vivo, enquanto as desvantagens potenciais incluem que seja demorado, caro e limitado pela necessidade de o usuário reconhecer subpopulações distintas dentro de uma amostra especificada30. Este protocolo fornece detalhes de LCM da cartilagem embrionária do rato e do osso, destacando o uso da mancha…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (R01DE022988) e pelo Instituto Nacional eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (P01HD078233). Os autores agradecem ao Núcleo de Biorepositório e Patologia pelo acesso à plataforma Leica LMD 6500 na Escola de Medicina Icahn, no Monte Sinai.

Materials

2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736

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Cite This Article
Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).

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