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Immunology and Infection

चूहों में परजीवी विरुलेंस का मूल्यांकन करने के लिए लीशमेनिया अमेज़ॅनसिस के साथ वीवो संक्रमण में

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

यहां, हम लीशमेनिया अमेज़ॅनसिसके साथ चूहों के कटनेस संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए एक संकलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह परजीवी उग्रता का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है, जिससे संक्रमण के लिए कशेरुकी मेजबान प्रतिक्रिया का प्रणालीगत दृश्य होता है।

Abstract

लीशमेनिया स्पीपी प्रोटोज़ोन परजीवी हैं जो लीशमैनियास, बीमारियों का कारण बनते हैं जो कटनीस से आंत के घावों तक नैदानिक अभिव्यक्तियों का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम पेश करते हैं। वर्तमान में, दुनिया भर में लीशमैनिया से १२,०००,०००,००० लोगों के संक्रमित होने का अनुमान है और १,०००,०००,००० से अधिक लोग संक्रमण के खतरे में रहते हैं । लीशमेनिया अमेज़ॅन मध्य और दक्षिण अमेरिका में स्थानिक है और आमतौर पर रोग के कटनेस रूप की ओर जाता है, जिसे सीधे पशु मॉडल में कल्पना की जा सकती है। इसलिए, एल amazonensis उपभेदों cutaneous leishmaniasis अध्ययन के लिए अच्छे मॉडल हैं, क्योंकि वे भी आसानी से विट्रो में खेती कर रहे हैं । C57BL/6 चूहों एल amazonensisसंचालित रोग प्रगति मनुष्यों में मनाया नकल और cutaneous leishmaniasis के लिए सबसे अच्छा चूहों उपभेदों मॉडल में से एक माना जाता है । कशेरुकी मेजबान में, ये परजीवी इन कोशिकाओं के रक्षा तंत्र के बावजूद मैक्रोफेज में रहते हैं। कई अध्ययन विभिन्न परिस्थितियों में परजीवी संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो मैक्रोफेज संक्रमण परखकाका उपयोग करते हैं। हालांकि, इन विट्रो दृष्टिकोण एक अलग कोशिका प्रणाली तक सीमित है जो जीव की प्रतिक्रिया को अस्वीकार करता है। यहां, हम वीवो म्यूरीन संक्रमण विधि में संकलित करते हैं जो मेजबान-परजीवी बातचीत का प्रणालीगत शारीरिक अवलोकन प्रदान करता है। एल amazonensis के साथ C57BL/6 चूहों के वीवो संक्रमण में विस्तृत प्रोटोकॉल में संक्रमित amastigotes, चूहों फुटपैड cutaneous टीका, घाव विकास, और परजीवी लोड निर्धारण में परजीवी भेदभाव शामिल है । हम मेजबान प्रतिरक्षा के शारीरिक अध्ययन के लिए सबसे पर्याप्त विधि के रूप में इस अच्छी तरह से स्थापित विधि का प्रस्ताव करते हैं और कटनीस लीशमैनियासिस के लिए मेटाबोलिक प्रतिक्रियाएं।

Introduction

लीशमैनियाज दुनिया भर में प्रचलित परजीवी संक्रामक रोग हैं जो विकासशील देशों में महत्वपूर्ण चुनौतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं और विश्व स्वास्थ्य संगठन1,2द्वारा सबसे महत्वपूर्ण उपेक्षित उष्णकटिबंधीय रोगों में से एक के रूप में पहचाने जाते हैं । लीशमैनियास को cutaneous, म्यूकोसल और/या आंत अभिव्यक्तियों की विशेषता है। क्यूटेनियस लीशमैनियासिस आमतौर पर एल अमेजन, एल मैक्सिकोना,एल ब्राजीलियन्सिस, एल गुयानेंसिस, एल मेजर, एल ट्रॉपिका और एल एथिओपिका3के कारण होता है। रोग का यह रूप सुरक्षात्मक सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के शामिल होने के कारण मनुष्यों में अक्सर आत्म-उपचार होता है। हालांकि, सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विफल हो सकती है, और रोग4,5के प्रसारित करने के लिए प्रगति कर सकता है। लीशमेनिया प्रजाति और मेजबान आनुवंशिक पृष्ठभूमि6,7के बीच विविधता के कारण कोई टीका उपलब्ध नहीं है . उपचार के विकल्प भी सीमित हैं क्योंकि वर्तमान में उपलब्ध अधिकांश दवाएं या तो महंगी, विषाक्त हैं, और/या दीर्घकालिक उपचार8,9की आवश्यकता हो सकती है । इसके अलावा, उपलब्ध उपचार10,11के खिलाफ दवा प्रतिरोध की रिपोर्ट ें आई हैं ।

लीशमैनियाज़ का कारक एजेंट प्रोटोज़ोन परजीवी लीशमेनियाहै । परजीवी अपने जीवन चक्र में दो अलग-अलग रूपात्मक रूपों को प्रस्तुत करता है: प्रोमास्टिगोट्स, सैंडफ्लियों में पाया जाने वाले ध्वजांकित रूप; और amastigotes, इंट्रासेल्युलर फार्म स्तनधारी मेजबान मैक्रोफेज12,13के पैरासिटोफोरस vacuoles में पाया । कशेरुकी मेजबान के मैक्रोफेज के रक्षा तंत्र के बावजूद आक्रमण करने, जीवित रहने और दोहराने की Amastigotes की क्षमता कई अध्ययनों के अधीन हैं14,15,16,17। नतीजतन, कई अनुसंधान समूह विशिष्ट पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के साथ-साथ परजीवी संक्रमण पर परजीवी और मेजबान जीन का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो मैक्रोफेज संक्रमण परखों का वर्णन कर रहे हैं। यह परख कई फायदे प्रस्तुत करता है, जैसे अध्ययन को उच्च थ्रूपुट प्रारूप में ढालने की क्षमता, परिणाम प्राप्त करने के लिए अपेक्षाकृत कम समय अवधि, और प्रयोगशाला जानवरों की कम संख्या18का बलिदान। हालांकि इन विट्रो परखों के निष्कर्ष सीमित हैं क्योंकि वे हमेशा वीवो स्टडीज14,19,20,21में नकल नहीं करते हैं । वीवो में परख मेजबान परजीवी बातचीत का एक प्रणालीगत शारीरिक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं, जिसे इन विट्रो परखों द्वारा पूरी तरह से नकल नहीं की जा सकती है। उदाहरण के लिए, इम्यूनोलॉजिकल अध्ययन एकत्र फुटपैड ऊतक वर्गों से या यहां तक कि बरामद प्रतिरक्षा कोशिकाओं22के विश्लेषण के लिए पॉपलाइटल लिम्फ नोड्स से इम्यूनोहिस्टोकेमिकल परख के माध्यम से किया जा सकता है।

पशुओं को अक्सर जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान में मानव रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जाता है ताकि23रोगों के अंतर्निहित शारीरिक तंत्र को बेहतर ढंग से समझा जा सके । लीशमैनिसिस के मामले में, टीका का मार्ग, साइट या खुराक रोग परिणाम24,25,26,27को प्रभावित करता है। इसके अलावा, मनुष्यों और चूहों में संक्रमण के प्रति संवेदनशीलता और प्रतिरोध मेजबान और परजीवी4,5,22,28,29,30,31की आनुवंशिक पृष्ठभूमि द्वारा अत्यधिक विनियमित किया जाता है। बाल्ब/सी चूहों एल amazonensis cutaneous संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, लिम्फ नोड्स, तिल्ली, और जिगर३२के लिए परजीवी के प्रसार के साथ एक तेजी से रोग प्रगति दिखा । चूंकि रोग क्यूटीनेस मेटास्तास में प्रगति कर सकता है, संक्रमण घातक हो सकता है। इसके विपरीत, C57BL/6 चूहों अक्सर एल amazonensis संक्रमण परख३३में लगातार परजीवी भार के साथ पुरानी घावों का विकास । इस प्रकार, इस विशेष माउस प्रजातियों के साथ एल amazonensis संक्रमण मनुष्यों में cutaneous leishmaniasis के पुराने रूपों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल माना जाता है, क्योंकि यह बालब/सी चूहों संक्रमण मॉडल5,३४से बेहतर रोग प्रगति की नकल करता है ।

इसलिए, हम प्रस्ताव करते हैं कि वीवो संक्रमण में मूत्र मानव रोग पर लागू लीशमेनिया उग्रता शारीरिक अध्ययनों के लिए एक उपयोगी तरीका है, जिससे मेजबान-परजीवी बातचीत के प्रणालीगत दृश्य की अनुमति मिलती है। अच्छी तरह से स्थापित परख22पर पुनर्विचार, हम यहां एल amazonensis के साथ C57BL/6 चूहों के वीवो संक्रमण में एक संकलित कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें परजीवी भेदभाव को एक्सनिक एमास्टिगोट्स, चूहों फुटपैड कटनेयस अकूश, घाव विकास और परजीवी लोड निर्धारण में शामिल किया गया है। इस प्रोटोकॉल को अन्य चूहों के उपभेदों और लीशमैनिया प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो cutaneous लीशमैनियास का कारण बनते हैं। निष्कर्ष में, यहां प्रस्तुत विधि नए विरोधीलीशमेनिया दवा लक्ष्यों और टीकों की पहचान करने के साथ-साथ लीशमेनिया संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिरक्षा और मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं के शारीरिक अध्ययन में महत्वपूर्ण है।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को साओ पाउलो विश्वविद्यालय (सीयूए 342/2019) के जैव विज्ञान संस्थान में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और साओ पाउलो राज्य (लेई एस्टाडुल 11.977) की प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग की सिफारिशों और नीतियों के अनुसार आयोजित किया गया था, de 25/08/2005) और ब्राजील सरकार (Lei संघीय ११.७९४, de 08/10/2008) । धारा1-5 में वर्णित सभी चरणों को लैमिनार प्रवाह अलमारियों के अंदर एसेप्टिक रूप से किया जाना चाहिए। लाइव लीशमेनिया परजीवी को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग किया जाना चाहिए।

1. एल अमेजन प्रोमास्टिगोट्स के विट्रो विडियेशन में एक्सनिक एमास्टिगोट्स15, 20,35,36,37,38

नोट: एल amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269)(ला)परजीवी इस परख में इस्तेमाल किया गया था । अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर, संक्रमित परजीवी रूप या तो एक घनत्व ढाल का उपयोग करके मेटासाइक्लिक रूप की शुद्धि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जैसा कि पहलेवर्णित 14,या निम्नलिखित प्रोटोकॉल के अनुसार एक्सनिक एमास्टिगोट्स में प्रोमास्टिगोट्स के अंतर से।

  1. एक 25 सेमी2 सेल संस्कृति फ्लास्क में ला प्रोमास्टिगोट्स उगाएं जिसमें प्रोमास्टिगोट्स (प्रो-मीडियम) (पीएच = 7.0) के लिए मध्यम के 10 मिलील होते हैं।
  2. 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: परजीवियों की उग्रता और एन्यूप्लाइडी परिवर्तन ों के नुकसान से बचने के लिए 10x से कम विट्रो में पारित की गई प्रोमास्टिगोट संस्कृतियों का उपयोग करें39,40,41,42,43,44.
  3. एक नए 25 सेमी2 फ्लास्क में लोगरिथमिक विकास चरण प्रोमास्टिगोट संस्कृति के पिपेट 5 मिलील।
  4. एक्सनिक एमास्टिगोट्स (अमा-मीडियम) (पीएच = 5.2) के लिए मध्यम के 5 मिलील जोड़ें।
  5. 3-4 दिनों के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 1:3 के अनुपात में अमा-माध्यम के साथ एक नए 25 सेमी2 फ्लास्क में कमजोर करके संस्कृति को विभाजित करें।
  7. 3-5 दिनों के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: 5 दिनों तक के लिए एक्सनिक amastigotes incubate, क्योंकि यह परिपक्वता३७के अंत का प्रतिनिधित्व करता है ।

2. C57BL/6 फुटपैड संक्रमण एल amazonensis के साथ

नोट: महिला C57BL/6 चूहों (6-8 सप्ताह पुराने) प्राप्त किया गया और साओ पाउलो विश्वविद्यालय के जैव चिकित्सा विज्ञान संस्थान के पशु केंद्र में बनाए रखा । जानवरों को भोजन और पानी विज्ञापन लिपटम प्राप्त हुआ।

  1. पीबीएस में पतला परजीवी निलंबन के एक एलिकोट को एक न्यूबॉयर कक्ष (यानी, हीमोसाइटोमीटर) में स्थानांतरित करके एक्सनिक एमास्टिगोट्स की संस्कृति की गणना करें। गैर-ध्वजांकित परजीवी गिनें, जो एमास्टिगोट्स रूपों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ट्राइपैन ब्लू (1:1) का उपयोग व्यवहार्य amastigotes की संख्या की गणना के लिए किया जा सकता है (यानी, ट्रिपैन नीले रंग से दाग नहीं वाले)।
  2. वांछित इनोकुलम खुराक और इच्छित टीका की संख्या (पीबीएस के 50 माइक्रोन में 1 x 106 एक्सनिक एमास्टिगोट्स की सिफारिश) के अनुसार पीबीएस में एक्सनिक एमास्टिगोट्स को पतला करें।
  3. तैयार परजीवी निलंबन के साथ 27 जी सुई के साथ एक कंद प्रकार सिरिंज लोड।
  4. एनेस्थेटाइज़ एक C57BL/6 माउस 3-5% isoflurane का उपयोग कर, के रूप में जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति४५द्वारा सिफारिश की । एक अंगूठे की चुटकी के लिए माउस की प्रतिक्रिया का परीक्षण करके संवेदनाक गहराई का आकलन करें।
  5. बाएं हिंद फुटपैड के उपप्लांटर ऊतक में समरूप परजीवी निलंबन (1 x 106 एक्सनिक एमास्टिगोट्स या वांछित इनोक्यूलम खुराक) के 50 माइक्रोन का टीका लगाया गया है, जो पहले से लोड किए गए ट्यूबरक्यूलिन सिरिंज (चरण 2.3) का उपयोग करके था।

3. माउस फुटपैड घाव विकास

  1. एक कैलिपर का उपयोग करके बाएं (संक्रमित) और दाएं (गैर संक्रमित) फुटपैड की मोटाई को मापकर सप्ताह में एक बार घाव की प्रगति को मापें।
  2. घाव प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए साप्ताहिक बाएं और दाएं हिंद फुटपैड के बीच मोटाई के अंतर की गणना करें।
  3. वाई-एक्सिस और एक्स-एक्सिस पर संक्रमण के समय पर गणना किए गए मतभेदों को प्लॉट करें और सांख्यिकीय महत्व की गणना करें।
    नोट: पशु देखभाल और उपयोग समितियों की सिफारिशों के अनुसार, संक्रमित घाव अल्सर हो जाता है इससे पहले कि जानवरों का बलिदान किया जाना चाहिए, क्योंकि त्वचा अल्सर माध्यमिक संक्रमण का कारण बन सकता है । जैसा कि अनुपूरक चित्र 1में दिखाया गया है, घावों को परजीवी खुराक (106 एक्सनिक एमास्टिगोट्स) और मेजबान तनाव (C57BL/6) के साथ अल्सर के लक्षण पेश करने में लगभग 10 सप्ताह लगते हैं जो इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाते हैं। चूहों को घाव निकालने के लिए बलिदान किया जाना चाहिए इससे पहले कि अल्सर के लक्षण देखे जाते हैं।

4. चूहों फुटपैड घाव निष्कर्षण और परजीवी कमजोर पड़ने सीमित

  1. सीमित कमजोर पड़ने परख46,47 के लिए एक 96 अच्छी प्लेट (फ्लैट नीचे) तैयार करें सभी कुओं में प्रो-मीडियम के 180 माइक्रोन जोड़कर।
    नोट: प्रत्येक जानवर के लिए चार प्लेट लेन (थाली का आधा) का उपयोग करें, चौगुनी परख का प्रतिनिधित्व (यानी, पशु 1 = लेन ए-डी; पशु 2 = लेन ई-एच)।
  2. एक ग्लास टिश्यू ग्राइंडर ट्यूब प्रति घाव में प्रो-मीडियम का 1 mL जोड़ें और ट्यूब का वजन करें।
    नोट: ट्यूब बाँझ रखा जाना चाहिए, तो एक बाँझ ढक्कन का उपयोग करें और बंद ढक्कन के साथ ट्यूब वजन, अगर लैमिनार प्रवाह कैबिनेट के बाहर वजन ।
  3. पशु देखभाल और उपयोग समितियों की सिफारिशों के बाद, एक सीओ2 कक्ष में जानवर का बलिदान करें। 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव करके जानवर को कीटाणुरहित करना।
  4. संक्रमित फुटपैड निकालने और कीटाणुशोधन के लिए फुटपैड पर 70% इथेनॉल स्प्रे करने के लिए इस पर जानवर के पैर को उत्पादित करें। कैंची और संदंश की नसबंदी 70% इथेनॉल में भिगोकर सुनिश्चित करें।
  5. संक्रमित फुटपैड को बाँझ पेट्री डिश में रखें और सभी नरम ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए बाँझ संदंश और एक स्केलपेल का उपयोग करके विच्छेदन करें। हड्डियों को त्याग दें।
    नोट: विच्छेदन चरण में एकरूपता पक्षपातपूर्ण ऊतक वसूली से बचने के लिए सिफारिश की है।
  6. एकत्र ित ऊतकों को प्रो-मीडियम के साथ ग्लास टिश्यू ग्राइंडर ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर घाव के वजन को निर्धारित करने के लिए ट्यूब को फिर से तौलें।
    नोट: संदंश और स्केलपेल को सीधे माध्यम में रखने से बचें, क्योंकि छोटी मात्रा को हटाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक वजन कम करके आंका जाता है। घाव के वजन की गणना केवल प्रो-मीडियम वाले ट्यूब के वजन से एकत्र ऊतक के साथ प्रो-मीडियम युक्त ट्यूब के वजन को घटाकर की जाती है।
  7. पूर्ण ऊतक व्यवधान के लिए ग्राइंडर का उपयोग कर ऊतक 10x को समरूप करें।
  8. मिश्रण को 10 मिन के लिए तलछट की अनुमति दें, फिर सुपरनेटेंट के 20 माइक्रोन एकत्र करें।
  9. चरण 4.1 में तैयार 96 अच्छी प्लेट के 1सेंट लेन के 1सेंट कॉलम में सुपरनेटेंट का लोड 20 माइक्रोन। अगले तीन लेन के लिए इसे दोहराएं प्रत्येक जानवर के लिए चौगुनी (यानी, पशु के लिए 1 प्रत्येक कुएं में 20 माइक्रोन जोड़ें और ए 1, बी 1, सी 1 और डी 1 लेबल)।
  10. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके 1सेंट कॉलम 10x में प्रत्येक को अच्छी तरह से समरूप करें। इसके बाद 1सेंट कॉलम से पतला नमूनों में से 20 माइक्रोन को 2कॉलम में ट्रांसफर करें।
    नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से 10x को एक कॉलम से अगले तक समरूप बनाना महत्वपूर्ण है।
  11. अंतिम कॉलम (12th)तक सभी शेष स्तंभों के लिए चरण 4.10 दोहराएं और पतला नमूने के अंतिम 20 माइक्रोन को त्यागें।
    नोट: पार संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के बाद सुझावबदलें।
  12. एक फिल्म के साथ प्लेटों को सील करें और आर्द्र कक्ष में 7 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

5. घाव परजीवी लोड निर्धारण

  1. प्रत्येक लेन के लिए अच्छी तरह से पिछले परजीवी युक्त निर्धारित करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करऊष्णके 7 दिनों के बाद प्लेटों का विश्लेषण करें।
    नोट: माध्यम के रंग परिवर्तन और टर्बिडिटी के दृश्य विश्लेषण से परजीवी, या कोशिका घनत्व के विकास का संकेत होना भी संभव है।
  2. घाव वजन प्रति कमजोर पड़ने कारक को विभाजित करके प्रत्येक लेन के लिए परजीवी ऊतक लोड की गणना करें।
    नोट: एक विशिष्ट लेन में, यदि परजीवी केवल कॉलम 1-5 (यानी, वेल्स A1-A5 परजीवी विकास के लिए सकारात्मक हैं) में मौजूद हैं, तो इसका मतलब है कि कॉलम 5 में केवल 1 परजीवी, कॉलम 4 में 10 परजीवी शामिल थे, और इसी तरह, दस के गुणकों में। कॉलम 1 में 104 परजीवी होंगे, जो सुपरनेटेंट के शुरुआती 20 माइक्रोन (चरण 4.7 में गैर-पतला नमूना) में परजीवी की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। क्योंकि इस 20 μL प्रो-मीडियम के 180 माइक्रोन के साथ पतला किया गया था, प्रारंभिक ट्यूब में 5 x 105 परजीवी थे: (1 x 104)/ (0.02 मिलील) = 5 x 105 परजीवी/1 मीटर। फिर, उस घाव में परजीवी भार की गणना घाव के वजन द्वारा परजीवी की प्रारंभिक एकाग्रता को विभाजित करके की जा सकती है: (5 x 105)/ घाव वजन (चरण 4.6 देखें)।
  3. लॉग वाई-स्केल वाले प्रत्येक जानवर के लिए चौगुनी परिणाम के औसत को प्लॉट करें।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. प्रतिकृति के रूप में प्रति प्रयोगात्मक समूह में कम से कम पांच जानवरों का उपयोग करके औसत ± मानक विचलन के रूप में डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  2. पी वैल्यू एंड एलटी; 0.05 को महत्वपूर्ण मानते हुए अनपेयर टू-पूंछ परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

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Representative Results

लीशमेनिया प्रोटोज़ोआन परजीवी अकशेरुकी और कशेरुकी मेजबानों में अपने जीवन चक्र के दौरान दो विकासात्मक रूपों में मौजूद हैं: प्रोमास्टिगोट्स, महिला सैंडफ्लाई के लुमेन में पाए जाने वाले प्रसारपूर्ण रूप; और एमास्टिगोट्स, स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं के परजीवी वाष्पीमें पाए जाने वाले प्रसारशील रूप। प्रोमास्टिगोट्स में लगभग 1.5 माइक्रोन चौड़ा और 20 माइक्रोन लंबा एक लंबा शरीर होता है, जिसमें एक फ्लैगलम आमतौर पर पूर्वकाल छोर से उभरता है। Amastigotes की लंबाई में 2-6 माइक्रोन और चौड़ाई में 1.5-3 माइक्रोन से आकार में एक गोल या अंडारहित शरीर होता है, और एक अस्पष्ट फ्लैगलम12,13 (चित्रा 1ए)के अधिकारी होते हैं। रक्त भोजन के दौरान अकशेरुकी मेजबान, परिवार साइकोडिडाई की एक हेमाटोफैगस कीट, लीशमैनिया अमास्टिगोट्स से संक्रमित मैक्रोफेज प्राप्त करती है। एक बार जब ये कोशिकाएं सैंडफ्लाई पाचन ट्यूब तक पहुंच जाती हैं, तो एमास्टिगोट्स जारी किए जाते हैं और प्रोसाइक्लिक प्रोमास्टिगोट्स(चित्रा 1ए)में अंतर करते हैं। ये रूप बाइनरी डिवीजन द्वारा गैर-संक्रमित और गुणा होते हैं और कीट वेक्टर की पाचन ट्यूब को उपनिवेश बनाते हैं। प्रोसाइक्लिक रूप तब मेटासाइक्लिक रूपों, एक संक्रमित और तेजी से चलने वाले रूप में अंतर करते हैं, जो एक पतले शरीर और लम्बी ध्वजेलम(चित्रा 1ए)पेश करते हैं। मेटासाइक्लिक रूप सैंडफ्लाई के घेघा और प्रोमेट्रिकुलस के पूर्वकाल भागों पर आक्रमण करते हैं, ताकि अपने अगले रक्त भोजन के दौरान, पुनरुत्थान इन संक्रमित रूपों को एक नए कशेरुकी मेजबान में टीका सुनिश्चित करता है। कशेरुकी मेजबान के तेग में, परजीवी मैक्रोफेज द्वारा फैगोसाइट्स को फागोसाइटोस करते हैं और परजीवी वाष्पीकरण के अंदर एमास्टिगोट्स में अंतर करते हैं, जहां एमास्टिगोटबाइनरी डिवीजन द्वारा गुणा होते हैं और लीशमेनिया12,13के जीवन चक्र को पूरा करते हैं।

एक्सनिक स्थितियां परजीवी आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए विट्रो में विभिन्न मेजबान वातावरण का अनुकरण कर सकती हैं। एमास्टिगोट्स के लिए एक्सनिक स्थितियों को पहले मैक्रोफेज के पैरासिटोफोरस वैक्यूल वातावरण का अनुकरण करने और एमास्टिगोट फॉर्म37में विट्रो विडिगोट में प्रोमास्टिगोट को ट्रिगर करने का वर्णन किया गया था। ये स्थितियां अम्लीय वातावरण (पीएच = 5.5) और कशेरुकी मेजबानों (34 डिग्री सेल्सियस) के बढ़े हुए तापमान की नकल करती हैं। चित्रा 1बी संस्कृति में इन स्थितियों को बदलकर एमास्टिगोट्स में अंतर करता है। इन एक्सनिक एमास्टिगोट्स की व्यवहार्यता का विश्लेषण ट्राइपैन ब्लू धुंधला द्वारा किया जा सकता है, सिद्धांत पर आधारित एक विधि जो जीवित कोशिकाओं में बरकरार झिल्ली होती है जो कुछ रंगों को बाहर करती हैं, जबकि मृत कोशिकाएं48नहीं होती हैं। वैकल्पिक रूप से, हमने तटस्थ पीएच में स्थानांतरित होने पर प्रोमास्टिगोट्स में वापस बदलने की उनकी क्षमता की पुष्टि करने वाले एक्सनिक एमास्टिगोट्स की व्यवहार्यता का विश्लेषण किया और 25 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 1बी)पर इनक्यूबेट किया।

यहां हम विभिन्न लीशमेनिया उपभेदों की उग्रता का मूल्यांकन करने के लिए वीवो संक्रमण विधि में एक प्रस्ताव करते हैं। चित्रा 2ए C57BL/6 चूहों फुटपैड के cutaneous घाव विकास दिखा रहा है कि जंगली प्रकार(ला-WT)और Leishmania आयरन रेगुलेटर 1 नॉकआउट (ला-LIR1-/) एल amazonensis शुद्ध मेटासाइक्लिक्स से संक्रमित थे परख में एक का प्रतिनिधित्व करता है । LIR1 लीशमैनिया में इंट्रासेलर आयरन के स्तर को नियंत्रित करता है जो लौह निर्यात में मध्यस्थता करता है और इसके इंट्रासेलर संचय को विषाक्त स्तर14तक रोकता है । संक्रमित बनाम गैर-संक्रमित फुटपैड की मोटाई मतभेदों की प्रगति को देखते हुए, हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि ला-LIR1/-संक्रमित चूहों ने ला-डब्ल्यूटीसंक्रमित चूहों(चित्रा 2ए)की तुलना में छोटे घावों को प्रस्तुत किया। उन निष्कर्षों से पता चला है कि LIR1 वीवो उग्रता में एल amazonensis के लिए आवश्यक है । यह लीशमेनिया-संचालितकटनेकी बीमारियों के मतभेदों का आकलन करने में इस विधि के महत्व और प्रभावकारिता को दर्शाता है। चित्रा 2बी गैर संक्रमित (दाएं) और संक्रमित (बाएं) फुटपैड और घाव विकास ७३ दिन पोस्टइंफेक्शन दिखाता है, जिसमें ला-डब्ल्यूटीऔर ला-LIR1-/-संक्रमित चूहों की सूजन और घाव प्रगति में अंतर दिखाई देता है ।

लीशमैनिया संक्रमण की प्रगति में न केवल घाव विकास होता है, जो भड़काऊ प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है, बल्कि परजीवी की इंट्रासेलर प्रतिकृति भी है। परजीवी प्रतिकृति का मूल्यांकन करने के लिए, घावों का परजीवी भार संक्रमित घाव निकालने के द्वारा निर्धारित किया गया था, जिसके बाद 96 अच्छी प्लेट(चित्रा 3ए)में एक सीमित कमजोर पड़ने की परख थी। चित्रा 3बी संक्रमण के ७३ दिनों के बाद ला-डब्ल्यूटीऔर ला-LIR1-/-संक्रमित चूहों से फुटपैड घावों के परजीवी लोड विश्लेषण को दिखाता है । सीमित कमजोर पड़ने परख से, हमने ला-LIR1के घाव में १०६गुना कम परजीवी का पतालगाया-/-ला-डब्ल्यूटी की तुलना में संक्रमित चूहों ने खुलासा किया कि LIR1 की अनुपस्थिति14के इंट्रासेल्यूसिलेशन प्रतिकृति को रोकती है ।

घाव विकास और परजीवी लोड दोनों का मूल्यांकन करने के फायदों में से एक परजीवी इंट्रासेलर प्रतिकृति और मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रिया के संभावित मतभेदों का पता लगाना है। हमने ऐड-बैक LIR1 (ला-LIR1एबी)का उपयोग करके इन दो फेनोटाइप के बीच मतभेदों को देखा, जो ला-LIR1है/-LIR1 ORF के साथ राइबोसोमल लोकस 14में वापस एकीकृत । जब ला-LIR1एबी को माउस के फुटपैड में इंजेक्ट किया गया था, तो हमने ला-LIR1-/-और ला-डब्ल्यूटीसंक्रमणों की तुलना में मध्यवर्ती आकार के घावों को देखा लेकिन ला-डब्ल्यूटीफेनोटाइप(अनुपूरक चित्रा 2)का एक उल्लेखनीय पूर्ण परजीवी लोड बचाव। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ला-LIR1एबी परजीवी वीवो संक्रमण में लंबे समय में ला-डब्ल्यूटीपरजीवी की तरह दोहराने में सक्षम थे। हालांकि, माउस भड़काऊ प्रतिक्रिया ला-डब्ल्यूटीसंक्रमण के रूप में नहीं थी क्योंकि घाव काफी छोटे थे।

इस तरह, यहां वर्णित विधि को स्तनधारी मेजबानों में सफल एमास्टिगोट इंट्रासेलुलर प्रतिकृति और cutaneous घाव विकास के लिए आवश्यक एल अमेज़ॅन्सिस विरुलेंस कारक की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक दिखाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: एल amazonensis promastigotes और amastigotes की आकृति विज्ञान । (A) लीशमेनियाके विभिन्न रूपात्मक रूपों के चित्र: प्रोसाइक्लिक प्रोमास्टिगोट, मेटासाइक्लिक प्रोमास्टिगोट, और एमास्टिगोट। स्केल बार = 2 माइक्रोन। (ख)इन विट्रो एल amazonensis संस्कृतियों की तस्वीरें । एक्सनिक एमास्टिगोट्स में प्रोमास्टिगोट्स के विट्रो भेदभाव में, और एक्सनिक एमास्टिगोट्स पीएच और तापमान की स्थिति को बदलकर प्रोमास्टिगोट्स में वापस आ जाते हैं, जैसा कि कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल में वर्णित है। तस्वीरें उल्टे माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करते हुए ली गई थीं । स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: LIR1 नॉकआउट स्पष्ट रूप से वीवो घाव विकास में एल amazonensis कम कर देता है । C57BL/6 चूहों को बाएं हिंद फुटपैड में एल अमेजन वाइल्ड टाइप (ला-डब्ल्यूटी) और एल अमेजन सलि1 नॉकआउट (ला-LIR1-/-) के१०६ शुद्ध मेटासाइक्लिक्स के साथ टीका लगाया गया था । (A) ला-डब्ल्यूटीऔर ला-LIR1-/-संक्रमित चूहों की फुटपैड cutaneous घाव प्रगतिसाप्ताहिक विश्लेषण किया । डेटा संक्रमित फुटपैड के औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है जो प्रत्येक समूह में पांच अलग-अलग चूहों से गैर-संक्रमित फुटपैड मोटाई से घटाया जाता है (लारंजीरा-सिल्वा एट अल14से अनुकूलित)। (ख) ला-डब्ल्यूटीऔर ला-LIR1 के गैर-संक्रमित और संक्रमित फुटपैड कीतस्वीरें-/संक्रमित चूहों सूजन में अंतर दिखा ७३ दिन पोस्टइंफेक्शन (Laranjeira-सिल्वा एट अल से अनुकूलित 14)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: LIR1 नॉकआउट स्पष्ट रूप से वीवो इंट्रासेलुलर प्रतिकृति में एल amazonensis कम कर देता है । (A) एल amazonensis जंगली प्रकार(ला-WT)और LIR1 नॉकआउट (ला-LIR1-/) से संक्रमित बरामद फुटपैड ऊतकों के 10x धारावाहिक कमजोरियों का प्रतिनिधित्व करने वाली 96 अच्छी प्लेट का एक उदाहरण। पंक्तियां ए-डी ला-डब्ल्यूटी-फुटपैड घाव के नमूने के धारावाहिक कमजोर पड़ने के चौगुनी का प्रतिनिधित्व करती हैं। पंक्तियां ई-एच ला-LIR1 के धारावाहिक कमजोर पड़ने के चौगुनी का प्रतिनिधित्वकरते हैं-/फुटपैडघाव के नमूने । ग्रे के विभिन्न रंग प्रति अच्छी तरह से मनाए गए सेल घनत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं (यानी, हल्का रंग का मतलब कम परजीवी होता है)। लाल रंग में चिह्नित कुएं पिछले कुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनमें प्रति परजीवी प्रति परजीवी होते हैं। (ख)C57BL/6 चूहों के बरामद फुटपैड ऊतकों में परजीवी लोड एल amazonensis जंगली प्रकार(ला-WT)और एल amazonensis LIR1 नॉकआउट (ला-LIR1-/) निर्धारित ७३ दिनों के बाद संक्रमण के १०६ शुद्ध मेटासाइक्लिकल्स से संक्रमित चूहों । डेटा प्रत्येक समूह में पांच अलग-अलग चूहों से परजीवी लोड प्रति मिलीग्राम ऊतक के औसत का प्रतिनिधित्व करता है (लारंजेरा-सिल्वा एट अल14से अनुकूलित)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 1
पूरक चित्रा 1: एक माध्यमिक संक्रमण के संकेत के रूप में त्वचा अल्सर। C57BL/6 चूहों के प्रतिनिधि चित्र एल amazonensis जंगली प्रकार(ला-WT)से संक्रमित फुटपैड ८० दिन पोस्टइंफेक्शन लिया । लाल तीर अल्सर के संकेतों को इंगित करते हैं, यह दर्शाता है कि प्रयोग को समाप्त किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक चित्रा 2: वीवो घाव विकास और इंट्रासेलर परजीवी प्रतिकृति में LIR1 की भूमिका। C57BL/6 चूहों को बाएं हिंद फुटपैड में एल amazonensis जंगली प्रकार (ला-WT), एल amazonensis LIR1 नॉकआउट (ला-LIR1-/-), और एल amazonensis LIR1 ऐड-बैक(ला-LIR1AB)के शुद्ध मेटासाइक्लिक्स के साथ टीका लगाया गया था । (A)ला-डब्ल्यूटी, ला-LIR1-/- औरला-LIR1 एबी संक्रमित चूहों की फुटपैड cutaneous घाव प्रगति साप्ताहिक विश्लेषण किया । डेटा संक्रमित फुटपैड के औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है जो प्रत्येक समूह में पांच अलग-अलग चूहों से गैर-संक्रमित फुटपैड मोटाई से घटाया जाता है (लारंजीरा-सिल्वा एट अल14से अनुकूलित)। (ख)ला-डब्ल्यूटी, ला-LIR1-/- याला-LIR1 एबी संक्रमित चूहों से बरामद फुटपैड ऊतकों में परजीवी लोड ७३ दिनों के बाद संक्रमण निर्धारित किया । डेटा प्रत्येक समूह में पांच अलग-अलग चूहों से परजीवी लोड प्रति मिलीग्राम ऊतक के औसत का प्रतिनिधित्व करता है (लारंजेरा-सिल्वा एट अल14से अनुकूलित)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित वीवो संक्रमण परख किसी भी शोधकर्ता को प्रणालीगत परिदृश्य में मेजबान-परजीवी बातचीत पर विचार करते हुए वीवो क्यूटिनियस लीशमैनियासिस में मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। इन परखों का इस्तेमाल कई समूहों ने22,24,27,29,31,32,34,49 और यहां हमने कुछ समूहों की बुनियादी ढांचे की सीमाओं पर विचार करते हुए इस विधि को मानकीकृत करने के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल संकलित किया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग वीवो बायोइमेजिंग50,51,52द्वारा ट्रांसजेनिक लीशमेनिया परजीवी की उग्रता का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है । किसी भी अन्य प्रयोगात्मक प्रक्रिया के रूप में, इस परख में निष्पादित करने के लिए सीमाएं और महत्वपूर्ण कदम हैं, जैसे कि प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है जो चूहों के साथ काम करने में सहज हैं और आकस्मिक संक्रमण से बचने के लिए उपप्लांटर इंजेक्शन प्रदर्शन करने में अनुभव रखते हैं। पक्षपातपूर्ण परिणामों से बचने और विभिन्न अनुसंधान समूहों के बीच तुलनीय परिणाम पैदा करने के लिए मानकीकरण प्रोटोकॉल अत्यंत महत्वपूर्ण है।

कटनीस लीशमैनिसेस के लिए एक मॉडल के रूप में एल amazonensis का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है क्योंकि इस प्रजाति के कारण फुटपैड घाव का आसानी से चूहों में मूल्यांकन किया जा सकता है। यहां वर्णित विधि द्वारा निर्धारित फुटपैड की सूजन दो संक्रमण फेनोटाइप के योग का प्रतिनिधित्व करती है: मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रिया और परजीवी प्रतिकृति। दोनों फेनोटाइप का अलग-अलग मूल्यांकन परजीवी ऊतक लोड विधि को जोड़कर किया जा सकता है जो घाव मोटाई प्रगति के निर्धारण के साथ परजीवी इंट्राकोशियलर प्रतिकृति को दर्शाता है। एक और फायदा यह है कि एल अमेजनके प्रोमास्टिगोट्स की खेती आसानी से इन विट्रो में की जाती है। इन्हें देखते हुए कोई भी रिसर्च ग्रुप अपनी जरूरत ों के हिसाब से इस लीश्मेनिया प्रजाति में हेरफेर कर सकता है। एल अमेजन के अध्ययनोंके निष्कर्षों की तुलना अन्य लीशमेनिया प्रजातियों से की जा सकती है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या एक विशिष्ट मार्ग विकासवादी रूप से संरक्षित है याअलग 21,53,54है ।

प्राकृतिक चक्र में, कशेरुकी मेजबान ी के लिए लीशमेनिया संचरण रक्त भोजन के दौरान संक्रमित रेत फ्लाई के काटने से होता है। रेत की फ्लाई आमतौर पर कीट की लार में कुछ सौ लीश्मेनिया मेटासाइक्लिक प्रोमास्टिगोट रूपों का बीमा करती है। वीवो संक्रमण में प्रयोगात्मक में, टीका की सबसे लगातार साइट जानवर के फुटपैड22है । कान में इन्ट्रेडरमल इंजेक्शन या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर टीका की वैकल्पिक साइटें हैं क्योंकि प्रत्येक साइट विभिन्न फागोसाइटिक सेल प्रकार24,56प्रस्तुत करती है । इसलिए, कुछ शोध समूह प्राकृतिक संचरण56,57,58,59की नकल करने के लिए जानवर के कान डर्मिस को संक्रमित करने के लिए प्रयोगशाला-संक्रमित रेत मक्खियों का उपयोग करते हैं। हालांकि, यह प्रोटोकॉल कुछ प्रतिबंध प्रस्तुत करता है, जैसे रेत फ्लाई कॉलोनियों का रखरखाव, जिसके लिए अधिकांश शोध समूहों के लिए उपलब्ध सुविधाओं की आवश्यकता नहीं होती है।

ला-LIR1 के साथ वीवो C57BL/6 संक्रमण में वर्णन मूल कामशुद्ध मेटासाइक्लिक प्रोमास्टिगोट्स रूपों14का इस्तेमाल किया है । हालांकि, लीशमेनिया आनुवंशिक हेरफेर या तो एक्सनिक एमास्टिगोट्स14 में या मेटासाइक्लिक संक्रमित रूपों में प्रोमास्टिगोट्स के भेदभाव को14या मेटासाइक्लिक संक्रमित रूपों में ख़राब कर सकता है। इसलिए, लीशमेनिया तनाव के आधार पर, शोधकर्ता को अपने अध्ययन के लिए व्यवहार्य संक्रमित परजीवी रूपों को प्राप्त करने के लिए सबसे पर्याप्त विधि निर्धारित करनी चाहिए। यहां वर्णित प्रोमास्टिगोट संस्कृतियों से अलग होने वाले एक्सनिक एमास्टिगोट्स का प्रोटोकॉल एक आसान विकल्प हो सकता है, जिससे कई मामलों में19,20,35, 37,38,64के तुलनीय परिणाम पैदा हो सकते हैं । यह दृष्टिकोण अन्य तरीकों के उपयोग से बचता है जो आमतौर पर संक्रमित परजीवी की कम पैदावार का परिणाम देते हैं, जैसे कि मेटासाइक्लिक प्रोमास्टिगोटशुद्धि के लिए विशिष्ट लेकिन व्यापक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी65 के साथ प्रोमास्टिगोट्स को इनक्यूबेटिंग करना, या मेटासाइक्लिक्स एलपीजी अभिव्यक्ति18,66के घनत्व ढाल निर्भर द्वारा। अमास्टिन-फैमिली जीन64,67की अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण करके विभेदन प्रोटोकॉल की दक्षता का मूल्यांकन किया जा सकता है। एस्टिन एक संरक्षित जीन परिवार के सदस्य हैं जो लीशमैनिया जीवन चक्र68 के दौरान अलग रूप से संग्राहक हैं और परजीवी उग्रता और रोगजनन67,69,70से जुड़े हुए हैं . अन्य मार्कर का उपयोग प्रोमास्टिगोट रूपों से एमास्टिगोट को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, gp63 amastigotes में डाउनरेकेटेड है, क्योंकि इसकी भूमिका कीट के पाचन एंजाइमों71से प्रोमास्टिगोट्स की रक्षा करना है।

वीवो संक्रमण प्रोटोकॉल में मानकीकृत विकसित करते समय माउस तनाव का चुनाव एक और महत्वपूर्ण कदम है। चूहों में लीशमेनिया संक्रमण के प्रति संवेदनशीलता और प्रतिरोध मुख्य रूप से आनुवंशिक पृष्ठभूमि29,30,55द्वारा विनियमित किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में, C57BL/6 तनाव चुना गया था क्योंकि एल amazonensis के लिए अपनी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बारीकी से मनुष्यों में मिश्रित Th1-Th2 प्रतिक्रिया से संबंधित है७२,७३। एल amazonensis के साथ प्रयोगात्मक मूत्र संक्रमण अन्य चूहों उपभेदों28,34,74की तुलना में C57BL/6 चूहों में मध्यम घावों का कारण बताया गया है। हालांकि, परजीवी तनाव के आधार पर, घाव के आकार में अंतर केवल बाल्ब/सी36जैसे अतिसंवेदनशील चूहों उपभेदों में पता लगाने योग्य है। संक्रमण के समय पर भी विचार करने और चुने गएचूहों के साथ सहसंबंध बनाने की आवश्यकता है। अल्सर फुटपैड से हमेशा बचा जाना चाहिए क्योंकि यह माध्यमिक संक्रमणों का प्रतिनिधित्व कर सकता है और अक्सर संक्रमण की लंबी अवधि में मनाया जाता है, विशेष रूप से अतिसंवेदनशील चूहों उपभेदों के साथ प्रयोगों में। संक्रमण शुरू करने के लिए दिन के समय को नामित करना एक और कदम है जिस पर विचार किया जाना है। जैसा कि एल amazonensisके साथ पिछले अध्ययनों में प्रदर्शित किया गया है, परजीवी इनोकुलम के दिन का समय घाव के विकास को प्रभावित करता है क्योंकि मेजबान परजीवी बातचीत75दिन के अंधेरे समय के दौरान पाइनेल-रिलीज मेलाटोनिन द्वारा सर्कैडियन तरीके से प्रभावित होती है।

वीवो संक्रमण विधि का बड़ा नुकसान यह है कि प्रयोग के लिए पर्याप्त संख्या में प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग की आवश्यकता होती है और इन विट्रो संक्रमण विधि18की तुलना में अंतिम परिणाम प्राप्त करने में अधिक समय लगता है । हालांकि, इस बाद के पहलू को एक लाभ के रूप में भी माना जा सकता है क्योंकि वीवो परिणामों में इन विट्रो संक्रमण से प्राप्त परिणामों की तुलना में रोग प्रगति के प्राकृतिक समय पाठ्यक्रम को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित करता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, वीवो संक्रमण में एल amazonensis से निष्कर्ष केवल परजीवी उग्रता में क्षणिक परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं, लेकिन यह भी मेजबान और उसके सभी खिलाड़ियों की प्रणालीगत स्थिति को स्वीकार करते हैं । इसलिए, ऊपर उल्लिखित कई कारकों पर विचार करते हुए, इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि को अन्य लक्ष्यों और उग्रता से संबंधित उपचारों के लक्षण वर्णन के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक जरूरतों को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो cutaneous leishmaniasis नियंत्रण के लिए नई अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम सहयोग के लिए साओ पाउलो विश्वविद्यालय के बायोमेडिकल साइंसेज इंस्टीट्यूट के एनिमल सेंटर से प्रो डॉ नील्स ऑलसेन सरैयावा कामरा और ग्लास टिश्यू ग्राइंडर उपलब्ध कराने के लिए प्रो डॉ सिल्विया रेनी उलियाना को धन्यवाद देना चाहेंगे । इस काम को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (FAPESP-MFLS ' अनुदान 2017/23933-3) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

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चूहों में परजीवी विरुलेंस का मूल्यांकन करने के लिए <em>लीशमेनिया अमेज़ॅनसिस</em> के साथ वीवो संक्रमण में
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Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R.… More

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