यहां, हम लीशमेनिया अमेज़ॅनसिसके साथ चूहों के कटनेस संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए एक संकलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह परजीवी उग्रता का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है, जिससे संक्रमण के लिए कशेरुकी मेजबान प्रतिक्रिया का प्रणालीगत दृश्य होता है।
लीशमेनिया स्पीपी प्रोटोज़ोन परजीवी हैं जो लीशमैनियास, बीमारियों का कारण बनते हैं जो कटनीस से आंत के घावों तक नैदानिक अभिव्यक्तियों का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम पेश करते हैं। वर्तमान में, दुनिया भर में लीशमैनिया से १२,०००,०००,००० लोगों के संक्रमित होने का अनुमान है और १,०००,०००,००० से अधिक लोग संक्रमण के खतरे में रहते हैं । लीशमेनिया अमेज़ॅन मध्य और दक्षिण अमेरिका में स्थानिक है और आमतौर पर रोग के कटनेस रूप की ओर जाता है, जिसे सीधे पशु मॉडल में कल्पना की जा सकती है। इसलिए, एल amazonensis उपभेदों cutaneous leishmaniasis अध्ययन के लिए अच्छे मॉडल हैं, क्योंकि वे भी आसानी से विट्रो में खेती कर रहे हैं । C57BL/6 चूहों एल amazonensisसंचालित रोग प्रगति मनुष्यों में मनाया नकल और cutaneous leishmaniasis के लिए सबसे अच्छा चूहों उपभेदों मॉडल में से एक माना जाता है । कशेरुकी मेजबान में, ये परजीवी इन कोशिकाओं के रक्षा तंत्र के बावजूद मैक्रोफेज में रहते हैं। कई अध्ययन विभिन्न परिस्थितियों में परजीवी संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो मैक्रोफेज संक्रमण परखकाका उपयोग करते हैं। हालांकि, इन विट्रो दृष्टिकोण एक अलग कोशिका प्रणाली तक सीमित है जो जीव की प्रतिक्रिया को अस्वीकार करता है। यहां, हम वीवो म्यूरीन संक्रमण विधि में संकलित करते हैं जो मेजबान-परजीवी बातचीत का प्रणालीगत शारीरिक अवलोकन प्रदान करता है। एल amazonensis के साथ C57BL/6 चूहों के वीवो संक्रमण में विस्तृत प्रोटोकॉल में संक्रमित amastigotes, चूहों फुटपैड cutaneous टीका, घाव विकास, और परजीवी लोड निर्धारण में परजीवी भेदभाव शामिल है । हम मेजबान प्रतिरक्षा के शारीरिक अध्ययन के लिए सबसे पर्याप्त विधि के रूप में इस अच्छी तरह से स्थापित विधि का प्रस्ताव करते हैं और कटनीस लीशमैनियासिस के लिए मेटाबोलिक प्रतिक्रियाएं।
लीशमैनियाज दुनिया भर में प्रचलित परजीवी संक्रामक रोग हैं जो विकासशील देशों में महत्वपूर्ण चुनौतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं और विश्व स्वास्थ्य संगठन1,2द्वारा सबसे महत्वपूर्ण उपेक्षित उष्णकटिबंधीय रोगों में से एक के रूप में पहचाने जाते हैं । लीशमैनियास को cutaneous, म्यूकोसल और/या आंत अभिव्यक्तियों की विशेषता है। क्यूटेनियस लीशमैनियासिस आमतौर पर एल अमेजन, एल मैक्सिकोना,एल ब्राजीलियन्सिस, एल गुयानेंसिस, एल मेजर, एल ट्रॉपिका और एल एथिओपिका3के कारण होता है। रोग का यह रूप सुरक्षात्मक सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के शामिल होने के कारण मनुष्यों में अक्सर आत्म-उपचार होता है। हालांकि, सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विफल हो सकती है, और रोग4,5के प्रसारित करने के लिए प्रगति कर सकता है। लीशमेनिया प्रजाति और मेजबान आनुवंशिक पृष्ठभूमि6,7के बीच विविधता के कारण कोई टीका उपलब्ध नहीं है . उपचार के विकल्प भी सीमित हैं क्योंकि वर्तमान में उपलब्ध अधिकांश दवाएं या तो महंगी, विषाक्त हैं, और/या दीर्घकालिक उपचार8,9की आवश्यकता हो सकती है । इसके अलावा, उपलब्ध उपचार10,11के खिलाफ दवा प्रतिरोध की रिपोर्ट ें आई हैं ।
लीशमैनियाज़ का कारक एजेंट प्रोटोज़ोन परजीवी लीशमेनियाहै । परजीवी अपने जीवन चक्र में दो अलग-अलग रूपात्मक रूपों को प्रस्तुत करता है: प्रोमास्टिगोट्स, सैंडफ्लियों में पाया जाने वाले ध्वजांकित रूप; और amastigotes, इंट्रासेल्युलर फार्म स्तनधारी मेजबान मैक्रोफेज12,13के पैरासिटोफोरस vacuoles में पाया । कशेरुकी मेजबान के मैक्रोफेज के रक्षा तंत्र के बावजूद आक्रमण करने, जीवित रहने और दोहराने की Amastigotes की क्षमता कई अध्ययनों के अधीन हैं14,15,16,17। नतीजतन, कई अनुसंधान समूह विशिष्ट पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के साथ-साथ परजीवी संक्रमण पर परजीवी और मेजबान जीन का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो मैक्रोफेज संक्रमण परखों का वर्णन कर रहे हैं। यह परख कई फायदे प्रस्तुत करता है, जैसे अध्ययन को उच्च थ्रूपुट प्रारूप में ढालने की क्षमता, परिणाम प्राप्त करने के लिए अपेक्षाकृत कम समय अवधि, और प्रयोगशाला जानवरों की कम संख्या18का बलिदान। हालांकि इन विट्रो परखों के निष्कर्ष सीमित हैं क्योंकि वे हमेशा वीवो स्टडीज14,19,20,21में नकल नहीं करते हैं । वीवो में परख मेजबान परजीवी बातचीत का एक प्रणालीगत शारीरिक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं, जिसे इन विट्रो परखों द्वारा पूरी तरह से नकल नहीं की जा सकती है। उदाहरण के लिए, इम्यूनोलॉजिकल अध्ययन एकत्र फुटपैड ऊतक वर्गों से या यहां तक कि बरामद प्रतिरक्षा कोशिकाओं22के विश्लेषण के लिए पॉपलाइटल लिम्फ नोड्स से इम्यूनोहिस्टोकेमिकल परख के माध्यम से किया जा सकता है।
पशुओं को अक्सर जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान में मानव रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जाता है ताकि23रोगों के अंतर्निहित शारीरिक तंत्र को बेहतर ढंग से समझा जा सके । लीशमैनिसिस के मामले में, टीका का मार्ग, साइट या खुराक रोग परिणाम24,25,26,27को प्रभावित करता है। इसके अलावा, मनुष्यों और चूहों में संक्रमण के प्रति संवेदनशीलता और प्रतिरोध मेजबान और परजीवी4,5,22,28,29,30,31की आनुवंशिक पृष्ठभूमि द्वारा अत्यधिक विनियमित किया जाता है। बाल्ब/सी चूहों एल amazonensis cutaneous संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, लिम्फ नोड्स, तिल्ली, और जिगर३२के लिए परजीवी के प्रसार के साथ एक तेजी से रोग प्रगति दिखा । चूंकि रोग क्यूटीनेस मेटास्तास में प्रगति कर सकता है, संक्रमण घातक हो सकता है। इसके विपरीत, C57BL/6 चूहों अक्सर एल amazonensis संक्रमण परख३३में लगातार परजीवी भार के साथ पुरानी घावों का विकास । इस प्रकार, इस विशेष माउस प्रजातियों के साथ एल amazonensis संक्रमण मनुष्यों में cutaneous leishmaniasis के पुराने रूपों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल माना जाता है, क्योंकि यह बालब/सी चूहों संक्रमण मॉडल5,३४से बेहतर रोग प्रगति की नकल करता है ।
इसलिए, हम प्रस्ताव करते हैं कि वीवो संक्रमण में मूत्र मानव रोग पर लागू लीशमेनिया उग्रता शारीरिक अध्ययनों के लिए एक उपयोगी तरीका है, जिससे मेजबान-परजीवी बातचीत के प्रणालीगत दृश्य की अनुमति मिलती है। अच्छी तरह से स्थापित परख22पर पुनर्विचार, हम यहां एल amazonensis के साथ C57BL/6 चूहों के वीवो संक्रमण में एक संकलित कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें परजीवी भेदभाव को एक्सनिक एमास्टिगोट्स, चूहों फुटपैड कटनेयस अकूश, घाव विकास और परजीवी लोड निर्धारण में शामिल किया गया है। इस प्रोटोकॉल को अन्य चूहों के उपभेदों और लीशमैनिया प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो cutaneous लीशमैनियास का कारण बनते हैं। निष्कर्ष में, यहां प्रस्तुत विधि नए विरोधीलीशमेनिया दवा लक्ष्यों और टीकों की पहचान करने के साथ-साथ लीशमेनिया संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिरक्षा और मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं के शारीरिक अध्ययन में महत्वपूर्ण है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित वीवो संक्रमण परख किसी भी शोधकर्ता को प्रणालीगत परिदृश्य में मेजबान-परजीवी बातचीत पर विचार करते हुए वीवो क्यूटिनियस लीशमैनियासिस में मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। इन परख?…
The authors have nothing to disclose.
हम सहयोग के लिए साओ पाउलो विश्वविद्यालय के बायोमेडिकल साइंसेज इंस्टीट्यूट के एनिमल सेंटर से प्रो डॉ नील्स ऑलसेन सरैयावा कामरा और ग्लास टिश्यू ग्राइंडर उपलब्ध कराने के लिए प्रो डॉ सिल्विया रेनी उलियाना को धन्यवाद देना चाहेंगे । इस काम को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (FAPESP-MFLS ‘ अनुदान 2017/23933-3) द्वारा समर्थित किया गया था ।
96-well plate | Greiner bio-ne | 655180 | A flat-bottom plate for limiting dilution assay |
adenine | Sigma | A8626 | Supplement added to M199 cell culture media |
caliper | Mitutoyo | 700-118-20 | A caliper to measure the thickness of footpad |
cell culture flask | Corning | 353014 | A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite |
centrifuge | Eppendorf | 5804R | An equipament used for separating samples based on its density |
CO2 incubator 34 °C | Thermo Scientific | 3110 | An incubator for amastigotes differentiation |
ethanol | Merck | K50237083820 | A disinfectant for general items |
fetal bovine serum | Gibco | 12657-029 | Supplement added to M199 cell culture media |
glass tissue grinder tube | Thomas Scientific | 3431 E04 | A tube to collect and disrupt infected footpad tissue |
glucose | Synth | G1008.01.AH | Supplement added to M199 cell culture media |
GraphPad Prism Software | GraphPad | A software used to plot the data and calculate statistical significance | |
hemin | Sigma | H-2250 | Supplement added to M199 cell culture media |
HEPES | Promega | H5303 | Supplement added to M199 cell culture media |
incubator 25 °C | Fanem | 347CD | An incubator for promastigotes cultivation |
inverted microscope | Nikon | TMS | An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures |
isoflurane | An inhalant anesthetics for mice (3-5%) | ||
laminar flow cabinet | Veco | VLFS-09 | A biosafety cabinet used for aseptical work area |
M199 cell culture media | Gibco | 31100-035 | A cell culture media for Leishmania cultivation |
microcentrifuge tube | Axygen | MCT150C | A microtube used for sample collection, processing and storage |
multichanel pipette | Labsystems | F61978 | A multichannel pipette used for limiting dilution assay |
NaHCO3 | Merck | 6329 | Supplement added to M199 cell culture media |
NaOH | Sigma | S8045 | Supplement added to M199 cell culture media |
Neubauer chamber | HBG | 2266 | A hemocytometer to count the parasite suspension |
optical microscope | Nikon | E200 | An optical equipament used to count parasite |
parafilm | Bemis | 349 | A flexible and resistant plastic to seal the plate |
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Supplement added to M199 cell culture media |
Petri dishes | TPP | 93100 | A sterile dish to dissect the footpad tissue |
pipetman kit | Gilson | F167360 | A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000) |
scale | Quimis | BG2000 | An equipament used to weigh collected footpad lesions |
scalpel | Solidor | 10237580026 | A scalpel to cut and collect footpad tissue |
serological pipette 10 mL | Nest | 327001 | A sterile pipette used for transfering mililiter volumes |
tips | Axygen | A pipette tip used for transfering microliter volumes | |
Trypan blue | Gibco | 15250-061 | A dye used to count viable parasites |
trypticase peptone | Merck | Supplement added to M199 cell culture media | |
tuberculin syringe | BD | 305945 | A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension |