Infection in vivo avec l’amazonense de Leishmania pour évaluer la virulence parasite chez les souris

Summary

Ici, nous présentons un protocole compilé pour évaluer l’infection cutanée des souris avec l’amazonensis de Leishmania. Il s’agit d’une méthode fiable pour étudier la virulence parasite, permettant une vue systémique de la réponse de l’hôte vertébré à l’infection.

Abstract

Leishmania spp. sont des parasites protozoaires qui causent des leishmaniose, maladies qui présentent un large éventail de manifestations cliniques des lésions cutanées aux lésions viscérales. Actuellement, on estime que 12 millions de personnes sont infectées par le Leishmania dans le monde et plus d’un milliard de personnes vivent à risque d’infection. L’amazonense de Leishmania est endémique en Amérique centrale et du Sud et mène habituellement à la forme cutanée de la maladie, qui peut être visualisée directement dans un modèle animal. Par conséquent, les souches de L. amazonensis sont de bons modèles pour les études de leishmaniose cutanée parce qu’elles sont également facilement cultivées in vitro. Les souris C57BL/6 imitent la progression de la maladie entraînée par L. amazonensisobservée chez l’homme et sont considérées comme l’un des meilleurs modèles de souches de souris pour la leishmaniose cutanée. Chez l’hôte vertébré, ces parasites habitent les macrophages malgré les mécanismes de défense de ces cellules. Plusieurs études utilisent des tests d’infection à macrophage in vitro pour évaluer l’infectiosité du parasite dans différentes conditions. Cependant, l’approche in vitro se limite à un système cellulaire isolé qui ne tient pas compte de la réponse de l’organisme. Ici, nous compilons une méthode in vivo d’infection de murine qui fournit un aperçu physiologique systémique de l’interaction hôte-parasite. Le protocole détaillé pour l’infection in vivo des souris de C57BL/6 avec L. amazonensis comprend la différenciation de parasite en amastigotes infectieux, l’inoculation cutanée de pied de souris, le développement de lésion, et la détermination de charge de parasite. Nous proposons cette méthode bien établie comme méthode la plus adéquate pour des études physiologiques des réponses immunitaires et métaboliques d’hôte à la leishmaniose cutanée.

Introduction

Les leishmanimes sont des maladies infectieuses parasitaires répandues dans le monde entier représentant des défis importants dans les pays en développement et sont reconnues comme l’une des maladies tropicales négligées les plus importantes par l’Organisation mondiale de la Santé^1,2. Les leishmaniose sont caractérisées par des manifestations cutanées, muqueuses et/ou viscérales. La leishmaniose cutanée est habituellement causée par L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica et L. aethiopica³. Cette forme de la maladie est souvent auto-guérison chez l’homme en raison de l’induction de la réponse immunitaire cellulaire protectrice. Cependant, la réponse immunitaire cellulaire peut échouer, et la maladie peut progresser à la leishmaniose cutanée disséminée^4,5. Il n’existe pas de vaccin disponible en raison de la diversité entre les espèces leishmanimanieuses et les milieux génétiques hôtes^6,7. Les options de traitement sont également limitées car la plupart des médicaments actuellement disponibles sont soit coûteux, toxiques, et / ou peuvent nécessiter un traitement à long terme^8,9. En outre, il ya eu des rapports de résistance aux médicaments contre les traitements disponibles^10,11.

L’agent causal des leishmanians est le parasite protozoaire Leishmania. Le parasite présente deux formes morphologiques distinctes dans son cycle de vie : les promastigotes, la forme flagellée trouvée dans les phandres ; et amastigotes, la forme intracellulaire trouvée dans les vacuoles parasitophores des macrophages d’hôte de mammifères^12,13. La capacité des amastigotes d’envahir, de survivre et de se répliquer malgré les mécanismes de défense des macrophages de l’hôte vertébré est sujette à de nombreuses études^14,15,16,17. Par conséquent, plusieurs groupes de recherche ont décrit des essais d’infection in vitro de macrophage pour évaluer l’impact des facteurs environnementaux spécifiques, aussi bien que des gènes parasites et d’hôte sur l’infectiosité parasite. Cet analyse présente plusieurs avantages, tels que la capacité d’adapter les études à un format de débit élevé, une période de temps relativement plus courte pour obtenir des résultats, et une réduction du nombre d’animaux de laboratoire sacrifiés¹⁸. Cependant, les résultats des essais in vitro sont limités parce qu’ils ne reproduisent pas toujours les études in vivo^14,19,20,21. Les essais in vivo fournissent un aperçu physiologique systémique de l’interaction hôte-parasite, qui ne peut pas être entièrement imité par des essais in vitro. Par exemple, les études immunologiques peuvent être exécutées par des essais immunohistochimiques des sections rassemblées de tissu de pied ou même des ganglions lymphatiques popliteal pour l’analyse des cellules immunitaires récupérées^22.

Les animaux sont souvent utilisés comme modèle pour les maladies humaines dans la recherche biologique et biomédicale pour mieux comprendre les mécanismes physiologiques sous-jacents des maladies²³. Dans le cas de la leishmaniose, l’itinéraire, le site, ou la dose d’inoculation influencent les résultats de la maladie^24,25,26,27. En outre, la susceptibilité et la résistance à l’infection chez l’homme et les souris sont fortement réglementées par les antécédents génétiques de l’hôte et le parasite^{4,5,22,28,29,30,31}. Les souris BALB/c sont très sensibles à l’infection cutanée de L. amazonensis, montrant une progression rapide de la maladie avec la dissémination des parasites aux ganglions lymphatiques, à la rate et au foie^32. Comme la maladie peut progresser vers des métastases cutanées, l’infection peut être mortelle. En revanche, les souris C57BL/6 développent souvent des lésions chroniques avec des charges parasites persistantes dans les essais d’infection de L. amazonensis ^33. Par conséquent, l’infection à L. amazonensis avec cette espèce particulière de souris a été considérée comme un excellent modèle pour étudier les formes chroniques de leishmaniose cutanée chez l’homme, parce qu’elle imite la progression de la maladie mieux que le modèle d’infection de souris BALB/c^5,34.

Par conséquent, nous proposons que l’infection in vivo de murine soit une méthode utile pour des études physiologiques de virulence de Leishmania applicables à la maladie humaine, permettant une vue systémique de l’interaction hôte-parasite. Revisiter les essais bien établis²², nous présentons ici un protocole compilé étape par étape de l’infection in vivo des souris C57BL/6 avec L. amazonensis qui comprend la différenciation parasite en amastigotes hachenique, souris footpad inoculation cutanée, développement de lésions, et la détermination de la charge parasite. Ce protocole peut être adapté à d’autres souches de souris et aux espèces de Leishmania qui causent des leishmanimes cutanés. En conclusion, la méthode présentée ici est cruciale pour identifier de nouvelles cibles de médicamentsanti-Leishmania et des vaccins, ainsi que dans les études physiologiques des réponses immunitaires et métaboliques de l’hôte à l’infection à Leishmania.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut de bioscience de l’Université de Sao Paulo (CEUA 342/2019), et ont été menées conformément aux recommandations et aux politiques relatives à l’entretien et à l’utilisation des animaux de laboratoire de l’État de Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) et le gouvernement brésilien (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Toutes les étapes décrites dans les sections 1…

Representative Results

Les parasites protozoaires de leishmaniose existent sous deux formes développementales au cours de leur cycle de vie chez les hôtes invertébrés et vertébrés : les promastigotes, les formes proliérantes trouvées dans le lumen de la mouche de sable femelle ; et amastigotes, les formes proliérantes trouvées dans les vacuoles parasitophores des cellules hôtes mammifères. Les promastigotes ont un corps allongé d’environ 1,5 m de large et 20 m de long, avec un dalle éme…

Discussion

L’analyse in vivo de l’infection décrite dans ce protocole permet à n’importe quel chercheur d’évaluer la leishmaniose cutanée in vivo compte tenu de l’interaction hôte-parasite dans un scénario systémique. Ces essais ont été utilisés par de nombreux groupes^{22,24,27,29,31,32,34…}

Materials

96-well plate	Greiner bio-ne	655180	A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine	Sigma	A8626	Supplement added to M199 cell culture media
caliper	Mitutoyo	700-118-20	A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask	Corning	353014	A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge	Eppendorf	5804R	An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C	Thermo Scientific	3110	An incubator for amastigotes differentiation
ethanol	Merck	K50237083820	A disinfectant for general items
fetal bovine serum	Gibco	12657-029	Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube	Thomas Scientific	3431 E04	A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose	Synth	G1008.01.AH	Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software	GraphPad		A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin	Sigma	H-2250	Supplement added to M199 cell culture media
HEPES	Promega	H5303	Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C	Fanem	347CD	An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope	Nikon	TMS	An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane			An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet	Veco	VLFS-09	A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media	Gibco	31100-035	A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube	Axygen	MCT150C	A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette	Labsystems	F61978	A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3	Merck	6329	Supplement added to M199 cell culture media
NaOH	Sigma	S8045	Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber	HBG	2266	A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope	Nikon	E200	An optical equipament used to count parasite
parafilm	Bemis	349	A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin	Gibco	15140122	Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes	TPP	93100	A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit	Gilson	F167360	A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale	Quimis	BG2000	An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel	Solidor	10237580026	A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL	Nest	327001	A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips	Axygen		A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue	Gibco	15250-061	A dye used to count viable parasites
trypticase peptone	Merck		Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe	BD	305945	A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension