Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vivo Infectie met Leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

Hier presenteren we een samengesteld protocol om de cutane infectie van muizen met Leishmania amazonensiste evalueren. Dit is een betrouwbare methode voor het bestuderen van parasietvirulentie, waardoor een systemische weergave van de gewervelde gastheer respons op de infectie.

Abstract

Leishmania spp. zijn protozoan parasieten die leishmaniases veroorzaken, ziekten die een breed spectrum van klinische manifestaties van cutane tot viscerale laesies presenteren. Momenteel, 12 miljoen mensen worden geschat te zijn besmet met Leishmania wereldwijd en meer dan 1 miljard mensen leven op het risico van infectie. Leishmania amazonensis is endemisch in Midden- en Zuid-Amerika en leidt meestal tot de cutane vorm van de ziekte, die direct kan worden gevisualiseerd in een diermodel. Daarom zijn L. amazonensis stammen goede modellen voor cutane leishmaniasis studies omdat ze ook gemakkelijk worden gekweekt in vitro. C57BL/6 muizen bootsen de L. amazonensis-gedrevenziekteprogressie na die bij mensen wordt waargenomen en worden beschouwd als een van de beste muizenstammenmodel voor cutane leishmaniasis. In de gewervelde gastheer bewonen deze parasieten macrofagen ondanks de afweermechanismen van deze cellen. Verschillende studies gebruiken in vitro macrofaag infectie testen om de parasiet infectiviteit te evalueren onder verschillende omstandigheden. De in vitro benadering is echter beperkt tot een geïsoleerd celsysteem dat de reactie van het organisme negeert. Hier compileren we een in vivo murineinfectiemethode die een systemisch fysiologisch overzicht biedt van de interactie tussen gastheer en parasiet. Het gedetailleerde protocol voor de in vivo infectie van C57BL/6 muizen met L. amazonensis omvat parasietdifferentiatie in besmettelijke amastigoten, muizen voetpad cutane inenting, laesie ontwikkeling, en parasiet belasting bepaling. Wij stellen deze gevestigde methode voor als de meest geschikte methode voor fysiologische studies van de gastheer immuun- en metabole reacties op cutane leishmaniasis.

Introduction

Leishmaniases zijn wereldwijd voorkomende parasitaire infectieziekten die belangrijke uitdagingen in ontwikkelingslanden vertegenwoordigen en worden door de Wereldgezondheidsorganisatie1,2erkend als een van de belangrijkste verwaarloosde tropische ziekten. De leishmaniasen worden gekenmerkt door cutane, slijmvlies, en / of viscerale manifestaties. Cutane leishmaniasis wordt meestal veroorzaakt door L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica en L. aethiopica3. Deze vorm van de ziekte is vaak zelfherstellend bij de mens als gevolg van de inductie van beschermende cellulaire immuunrespons. Echter, de cellulaire immuunrespons kan mislukken, en de ziekte kan vooruitgang boeken om te verspreiden cutane leishmaniasis4,5. Er is geen vaccin beschikbaar vanwege de diversiteit onder Leishmania soorten en gastheer genetische achtergronden6,7. Behandelingsopties zijn ook beperkt omdat de meeste momenteel beschikbare geneesmiddelen duur, giftig en/of langdurige behandeling vereisen8,9. Bovendien zijn er meldingen van resistentie tegen geneesmiddelen tegen de beschikbare behandelingen10,11.

De veroorzaker van leishmaniases is de protozoan parasiet Leishmania. De parasiet presenteert twee verschillende morfologische vormen in zijn levenscyclus: promastigoten, de flagellated vorm gevonden in zandvliegen; en amastigoten, de intracellulaire vorm gevonden in de parasitophoreuze vacuoles van de zoogdiergastheer macrofagen12,13. Amastigotes ' vermogen om binnen te vallen, overleven, en repliceren, ondanks de verdediging mechanismen van de gewervelde gastheer macrofagen zijn onderworpen aan vele studies14,15,16,17. Bijgevolg hebben verschillende onderzoeksgroepen in vitro macrofaaginfectietests beschreven om de impact van specifieke omgevingsfactoren te evalueren, evenals parasiet- en gastheergenen op infectiviteit van parasieten. Deze test biedt verschillende voordelen, zoals het vermogen om studies aan te passen aan een hoog doorvoerformaat, een relatief kortere periode om resultaten te verkrijgen en een verminderd aantal geofferde proefdieren18. De bevindingen van in vitro tests zijn echter beperkt omdat ze niet altijd repliceren in vivo studies14,19,20,21. In vivo testen bieden een systemisch fysiologisch overzicht van de host-parasiet interactie, die niet volledig kan worden nagebootst door in vitro testen. Immunologische studies kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd door middel van immunohistochemische testen van verzamelde delen van het voetpadweefsel of zelfs van popliteale lymfeklieren voor analyse van de teruggewonnen immuuncellen22.

Dieren worden vaak gebruikt als model voor menselijke ziekten in biologisch en biomedisch onderzoek om de onderliggende fysiologische mechanismen van de ziekten beter te begrijpen23. In het geval van leishmaniasis beïnvloedt de route, de plaats of de dosis inenting de uitkomst van de ziekte24,25,26,27. Bovendien worden de gevoeligheid en de weerstand tegen de infectie bij mensen en muizen sterk gereguleerd door de genetische achtergronden van de gastheer en parasiet4,5,22,28,29,30,31. BALB/c muizen zijn zeer gevoelig voor L. amazoneensinfectie, die een snelle ziekteprogressie vertonen met de verspreiding van de parasieten naar de lymfeklieren, milt en lever32. Aangezien de ziekte kan vorderen tot cutane metastasen, kan de infectie fataal zijn. C57BL/6 muizen ontwikkelen daarentegen vaak chronische laesies met aanhoudende parasietbelastingen in L. amazonensis-infectie assays33. Daarbij, L. amazonensis infectie met deze bijzondere muissoort is beschouwd als een uitstekend model om chronische vormen van cutane leishmaniasis bij de mens te bestuderen, omdat het bootst de ziekte progressie beter dan de BALB / c muizen infectie model5,34.

Daarom stellen we voor dat de murine in vivo infectie een nuttige methode is voor Leishmania virulentie fysiologische studies die van toepassing zijn op de menselijke ziekte, waardoor een systemisch beeld van de interactie tussen gastheer en parasiet mogelijk is. Herbezoeken gevestigde assays22, presenteren we hier een gecompileerde stap-voor-stap protocol van de in vivo infectie van C57BL / 6 muizen met L. amazonensis die de parasiet differentiatie in axenic amastigotes, muizen voetpad cutane inenting, laesie ontwikkeling, en parasiet belasting bepaling omvat. Dit protocol kan worden aangepast aan andere muizenstammen en Leishmania soorten die cutane leishmaniases veroorzaken. Tot slot, de hier gepresenteerde methode is cruciaal bij het identificeren van nieuweanti-Leishmania drug doelen en vaccins, evenals in fysiologische studies van de gastheer immuun en metabole reacties op Leishmania infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn en gebruik van het Instituut voor Biowetenschappen van de Universiteit van São Paulo (CEUA 342/2019), en werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen en het beleid voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de staat São Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) en de Braziliaanse regering (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle stappen beschreven in secties 1-5 moeten aseptisch worden uitgevoerd in laminaire stroomkasten. Persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gebruikt tijdens het hanteren van levende Leishmania parasieten.

1. In Vitro Differentiatie van L. amazonensis Promastigotes in Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

OPMERKING: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) parasiet werd gebruikt in deze test. Afhankelijk van het onderzoeksdoel kan de infectieve parasietvorm worden verkregen door zuivering van de metacyclische vorm met behulp van een dichtheidsgradiënt, zoals eerder beschreven14, of door differentiatie van promastigoten in axenic amastigoten, volgens het volgende protocol.

  1. Kweek La promastigoten in een 25 cm2 celkweekkolf met 10 mL medium voor promastigoten (pro-medium) (pH = 7.0).
  2. Incubeer 3 dagen bij 25 °C.
    OPMERKING: Gebruik promastigote culturen die werden doorgegeven in vitro minder dan 10x om het verlies van virulentie en aneuploïdie veranderingen van parasieten39,40,41,42,43,44.
  3. Pipette 5 mL logaritmische groeifase promastigote cultuur in een nieuwe 25 cm2 kolf.
  4. Voeg 5 mL medium toe voor axenic amastigoten (ama-medium) (pH = 5.2).
  5. Incubeer 34 °C gedurende 3-4 dagen.
  6. Splits de cultuur door te verdunnen met ama-medium bij een verhouding van 1:3 in een nieuwe kolf van 25 cm2.
  7. Incubeer 34 °C gedurende 3-5 dagen.
    OPMERKING: Broed de axenic amastigoten voor maximaal 5 dagen, omdat het het einde van de rijping37vertegenwoordigt.

2. C57BL/6 Footpad Infectie met L. amazonensis

OPMERKING: Vrouwelijke C57BL/6 muizen (6-8 weken oud) werden verkregen en onderhouden in het Animal Center van het Biomedical Sciences Institute van de Universiteit van São Paulo. Dieren kregen voedsel en water ad libitum.

  1. Tel de cultuur van axenic amastigoten door het overbrengen van een aliquot van de parasiet schorsing verdund in PBS naar een Neubauer kamer (dat wil zeggen, hemocytometer). Tel de niet-flagellated parasieten, die amastigotes vormen vertegenwoordigen.
    OPMERKING: Als alternatief kan Trypan blauw (1:1) worden gebruikt voor het tellen van het aantal levensvatbare amastigoten (d.w.z. die niet bevlekt met Trypan blauw).
  2. Verdun de axenic amastigoten in PBS volgens de gewenste entculumdosis en het aantal beoogde endoortingen (1 x 106 axenic amastigoten in 50 μL PBS wordt aanbevolen).
  3. Laad een tuberculinespuit met een 27 G naald met de voorbereide parasietsuspensie.
  4. Verdoven een C57BL / 6 muis met behulp van 3-5% isoflurane, zoals aanbevolen door Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Beoordeel de verdovingsdiepte door de reactie van de muis op een teensnuifje te testen.
  5. Inenting 50 μL van de gehomogeniseerde parasietsuspensie (1 x 106 axenic amastigoten of de gewenste inoculumdosis) in het subplantaire weefsel van het linker achtervoetpad, met behulp van de eerder geladen tuberculinespuit (stap 2.3).

3. Muis voetpad Laesie Ontwikkeling

  1. Meet de progressie van de laesie één keer per week door de dikte van de linker (geïnfecteerde) en de rechter (niet-geïnfecteerde) voetzolen te meten met behulp van een remklauw.
  2. Bereken het verschil van de dikte tussen de linker en rechter achtervoetkussens per week om laesieprogressie te evalueren.
  3. Plot de berekende verschillen op de Y-as en de tijd van infectie op de X-as en bereken de statistische significantie.
    OPMERKING: In overeenstemming met de aanbevelingen van de Comités voor dierenverzorging en gebruik moeten dieren worden geofferd voordat de besmette laesie wordt zweren, omdat huidzweren kunnen leiden tot secundaire infectie. Zoals blijkt uit aanvullende figuur 1, duurt het ongeveer 10 weken voordat de laesies tekenen van ulceratie vertonen met de parasietdosis (106 axenic amastigoten) en gastheerstam (C57BL/6) die in dit protocol worden gebruikt. De muizen moeten worden geofferd voor laesieextractie voordat de tekenen van ulceratie worden waargenomen.

4. Muizen Voetpad Laesie extractie en parasiet beperken verdunning

  1. Bereid een 96 putplaat (platte bodem) voor de beperkende verdunningstest46,47 door 180 μL pro-medium aan alle putten toe te voegen.
    OPMERKING: Gebruik vier plaatstroken (de helft van de plaat) voor elk dier, wat neerkomt op vierdubbele testen (d.w.z. dier 1 = rijstroken A-D; dier 2 = rijstroken E-H).
  2. Voeg 1 mL pro-medium toe in een glasweefselmolenbuis per laesie en weeg de buis.
    LET OP: De buis moet steriel worden gehouden, dus gebruik een steriel deksel en weeg de buis met het gesloten deksel, bij het wegen buiten de laminaire stroomkast.
  3. Offer het dier op in een CO 2-kamer, volgens de aanbevelingen van de Comités voor Dierenverzorging en Gebruik. Desinfecteer het dier door te spuiten met 70% ethanol.
  4. Accijns de voet van het dier op de hielen om het geïnfecteerde voetpad te extraheren en spray 70% ethanol op het voetpad voor desinfectie. Zorg voor de sterilisatie van scharen en tangen door ze gedrenkt te houden in 70% ethanol.
  5. Plaats het geïnfecteerde voetpad in een steriele petrischaal en ontleed met behulp van steriele tangen en een scalpel om alle zachte weefsels te verzamelen. Gooi de botten weg.
    OPMERKING: Uniformiteit in de dissectie stap wordt aanbevolen om bevooroordeeld weefsel herstel te voorkomen.
  6. Breng de verzamelde weefsels met pro-medium over op de buis van de glasweefselmolen en weeg de buis opnieuw om het laesiegewicht te bepalen.
    OPMERKING: Vermijd het plaatsen van de tangen en scalpel direct in het medium, als kleine volumes kunnen worden verwijderd, wat resulteert in een onderschat weefsel gewicht. Het gewicht van de laesie wordt berekend door het gewicht van de buis die pro-medium bevat met het verzamelde weefsel af te trekken van het gewicht van buis die alleen pro-medium bevat.
  7. Homogeniseren van het weefsel 10x met behulp van de molen voor volledige weefselverstoring.
  8. Laat het mengsel 10 min sediment en verzamel vervolgens 20 μL van het supernatant.
  9. Laad 20 μL van de supernatant in de1e kolom van de1e rijstrook van de 96 goedplaat bereid in stap 4.1. Herhaal dit voor de volgende drie rijstroken om quadruplicaten te hebben voor elk dier (d.w.z. voor dier 1 voeg 20 μL toe aan elke put en label A1, B1, C1 en D1).
  10. Homogeniseren elke put in de1e kolom 10x met behulp van een multichannel pipet. Breng vervolgens 20 μL van de verdunde monsters over van de1e kolom naar de2e kolom.
    OPMERKING: Het is belangrijk om elke put 10x van de ene kolom naar de volgende te homogeniseren.
  11. Herhaal stap 4.10 voor alle resterende kolommen tot de laatste kolom (12e)en gooi de laatste 20 μL verdund monster weg.
    OPMERKING: Verander de tips na elke verdunning om kruisbesmetting te voorkomen.
  12. Sluit de platen 7 dagen lang af met een folie en incubeer bij 25 °C in een vochtige kamer.

5. Laesie Parasiet Load Bepaling

  1. Analyseer de platen na 7 dagen incubatie met behulp van een omgekeerde microscoop om de laatste parasiet-bevattende goed voor elke rijstrook te bepalen.
    OPMERKING: Het is ook mogelijk om een indicatie te hebben van de groei van de parasieten, of celdichtheid, door visuele analyse van de kleurveranderingen en troebelheid van het medium.
  2. Bereken de belasting van het parasietweefsel voor elke rijstrook door de verdunningsfactor per laesiegewicht te delen.
    OPMERKING: In een specifieke rijstrook, als parasieten alleen aanwezig zijn in kolommen 1-5 (d.w.z. putten A1-A5 zijn positief voor de groei van parasieten), betekent dit dat kolom 5 slechts 1 parasiet bevatte, kolom 4 10 parasieten bevatte, enzovoort, in veelvouden van tien. Kolom 1 zou 104 parasieten bevatten, wat het aantal parasieten in de eerste 20 μL supernatant (het niet-verdunde monster in stap 4.7) vertegenwoordigt. Omdat deze 20 μL werd verdund met 180 μL pro-medium, bevatte de initiële buis 5 x 105 parasieten: (1 x 104) / (0,02 mL) = 5 x 105 parasieten/1 mL. Vervolgens kan de parasietbelasting in die laesie worden berekend door de initiële concentratie van de parasiet te delen door het laesiegewicht: (5 x 105) / laesiegewicht (zie stap 4.6).
  3. Plot het gemiddelde van het vierdubbele resultaat voor elk dier met een log Y-schaal.

6. Statistische analyse

  1. Vertegenwoordig de gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie met ten minste vijf dieren per experimentele groep als repliceert.
  2. Voer statistische analyse uit met behulp van ongepaarde tweezijdige tests, waarbij een p-waarde < 0,05 als significant wordt gezien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Leishmania protozoan parasieten bestaan in twee ontwikkelingsvormen tijdens hun levenscyclus in ongewervelde en gewervelde gastheren: promastigoten, de proliferative vormen gevonden in het lumen van de vrouwelijke zandvlieg; en amastigoten, de proliferative vormen gevonden in de parasitophoreuze vacuoles van de zoogdiergastheercellen. Promastigoten hebben een langwerpig lichaam van ongeveer 1,5 μm breed en 20 μm lang, met een flagellum die meestal uit de voorste extremiteit tevoorschijn komt. Amastigoten hebben een afgeronde of eivormige lichaam variërend in grootte van 2-6 μm in lengte en 1,5-3 μm in breedte, en bezitten een onaanschijn flagellum12,13 (Figuur 1A). Tijdens de bloedmaaltijd verwerft de ongewervelde gastheer, een hematofaal insect van de familie Psychodidae, macrofagen die besmet zijn met Leishmania amastigoten. Zodra deze cellen de sandfly spijsverteringsbuis bereiken, worden amastigoten vrijgegeven en onderscheiden zich van procyclische promastigoten(figuur 1A). Deze vormen zijn niet-infectieuze en vermenigvuldigen zich intensief door binaire deling en koloniseren de spijsverteringsbuis van de insectenvector. De procyclische vormen maken vervolgens onderscheid naar metacyclische vormen, een besmettelijke en snel bewegende vorm, die een dunner lichaam en langwerpige flagellum(figuur 1A)presenteert. De metacyclische vormen dringen de voorste gedeelten van de slokdarm en proventriculus van de zandvlieg binnen, zodat tijdens de volgende bloedmaaltijd regurgitatie de inenting van deze infecterende vormen in een nieuwe gewervelde gastheer garandeert. In het tegument van de gewervelde gastheer worden de parasieten gefagocytosed door de macrofagen en onderscheiden ze zich in amastigoten in de parasitophoreuze vacuoles, waar de amastigoten zich vermenigvuldigen met binaire deling en de levenscyclus van Leishmania12,13voltooien.

Axenic voorwaarden kunnen simuleren verschillende host omgevingen in vitro, het behoud van de parasiet morfologie en levensvatbaarheid. Axenic voorwaarden voor amastigoten werden eerder beschreven simuleren van een macrofaag parasitophorous vacuole milieu en triggering promastigote in vitro differentiatie in de amastigote vorm37. Deze omstandigheden bootsen de zure omgeving (pH = 5,5) en de verhoogde temperatuur van de gewervelde gastheren (34 °C) na. Figuur 1B illustreert promastigoten die op amastigoten zijn onderscheiden door deze omstandigheden in de cultuur te veranderen. De levensvatbaarheid van deze axenic amastigoten kan worden geanalyseerd door Trypan blauwe vlekken, een methode gebaseerd op het principe dat levende cellen intacte membranen bezitten die bepaalde kleurstoffen uitsluiten, terwijl dode cellen niet48. Als alternatief analyseerden we de levensvatbaarheid van axenic amastigoten die hun vermogen om terug te keren naar promastigoten verifiëren wanneer ze worden overgebracht naar neutrale pH en geïncubeerd bij 25 °C (Figuur 1B).

Hier stellen we een in vivo infectiemethode voor om de virulentie van verschillende Leishmania-stammen te evalueren. Figuur 2A vertegenwoordigt een in vivo infectie test waaruit blijkt dat de cutane laesie ontwikkeling van C57BL / 6 muizen voetblokken die besmet waren met wild type (La-WT) en Leishmania Iron Regulator 1 knock-out (La-LIR1-/-) L. amazonensis gezuiverde metacyclik. LIR1 reguleert het intracellulaire ijzergehalte in Leishmania dat de uitvoer van ijzer bemiddelt en voorkomt dat de intracellulaire accumulatie ervan tot toxische niveaus wordt bereikt14. Het observeren van de progressie van de dikte verschillen van de geïnfecteerde vs niet-geïnfecteerde voetkussens, waren we in staat om aan te tonen dat de La-LIR1-/- geïnfecteerde muizen gepresenteerd kleinere laesies dan La-WT geïnfecteerde muizen (Figuur 2A). Uit deze bevindingen bleek dat LIR1 essentieel is voor L. amazonensis in vivo virulentie. Dit toont het belang en de werkzaamheid van deze methode aan bij het beoordelen van de verschillen tussen Leishmania-gedrevencutane ziekten. Figuur 2B illustreert de niet-geïnfecteerde (rechts) en geïnfecteerde (linker)voetkussens en laesieontwikkeling 73 dagen na infectie, waaruit de verschillen in zwelling en laesieprogressie van La-WT en La-LIR1-/- geïnfecteerde muizen worden weergegeven.

De progressie van de Leishmania-infectie bestaat niet alleen uit de laesieontwikkeling, die de ontstekingsreactie vertegenwoordigt, maar ook de intracellulaire replicatie van de parasiet. Om de replicatie van parasieten te evalueren, werd de parasietbelasting van de laesies bepaald door het extraheren van de geïnfecteerde laesie, gevolgd door een beperkende verdunningstest in een 96-putplaat (figuur 3A). Figuur 3B toont de analyse van de parasietbelasting van de voetpadlaesies van La-WT en La-LIR1-/- geïnfecteerde muizen na 73 dagen infectie. Uit de beperkende verdunningstest ontdekten we 106-voudigeikenprocessierupsen in de laesie van de La-LIR1-/- geïnfecteerde muizen in vergelijking met La-WT, waaruit blijkt dat afwezigheid van LIR1 intracellulaire replicatie van de amastigoten14voorkomt.

Een van de voordelen van het evalueren van zowel laesieontwikkeling als parasietbelasting is het detecteren van mogelijke verschillen van parasiet intracellulaire replicatie en de gastheer ontstekingsreactie. We zagen verschillen tussen deze twee fenotypes met behulp van de add-back LIR1 (La-LIR1AB), dat is de La-LIR1-/- met de LIR1 ORF geïntegreerd terug in de ribosomal locus14. Toen La-LIR1AB werd geïnjecteerd in het voetpad van een muis, zagen we tussenliggende laesies in vergelijking met La-LIR1-/- en La-WT infecties, maar een opmerkelijke volledige parasiet lading redding van de La-WT fenotype ( AanvullendeFiguur 2). Deze resultaten geven aan dat La-LIR1AB parasieten in staat waren om te repliceren als La-WT parasieten in een lange termijn in vivo infectie. De ontstekingsreactie van de muis was echter niet zo verergerd als La-WT-infecties omdat de laesies aanzienlijk kleiner waren.

Daarbij bleek de hier beschreven methode essentieel te zijn voor de identificatie en karakterisering van een L. amazonevitiefactor die nodig is voor de succesvolle amastigote intracellulaire replicatie en cutane laesieontwikkeling in de zoogdiergastheren.

Figure 1
Figuur 1: Morfologie van L. amazonensis promastigoten en amastigoten. (A) Illustraties van de verschillende morfologische vormen van Leishmania: procyclische promastigote, metacyclische promastigote en amastigote. Schaalbalk = 2 μm. (B) Foto's van in vitro L. amazoneculturen. In vitro differentiatie van promastigoten in axenic amastigoten, en van axenic amastigoten terug naar promastigoten door het veranderen van de pH en temperatuur voorwaarden, zoals beschreven in de stap-voor-stap protocol. De foto's zijn genomen met behulp van een omgekeerde microscoop. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: LIR1 knock-out vermindert duidelijk L. amazonensis in vivo laesie ontwikkeling. C57BL/6 muizen werden ingeënt in het linker achtervoetpad met 106 gezuiverde metacyclics van L. amazonensis wild type (La-WT) en L. amazonensis LIR1 knock-out (La-LIR1-/-). (A) Footpad cutane laesie progressie van La-WT en La-LIR1-/- geïnfecteerde muizen wekelijks geanalyseerd. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van het geïnfecteerde voetpad afgetrokken door niet-geïnfecteerde voetpaddikte van vijf verschillende muizen in elke groep (aangepast van Laranjeira-Silva et al.14). (B) Foto's van de niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde voetkussens van La-WT en La-LIR1-/- geïnfecteerde muizen die de verschillen in zwelling 73 dagen na infectie laten zien (aangepast van Laranjeira-Silva et al.14). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: LIR1 knock-out vermindert duidelijk L. amazonensis in vivo intracellulaire replicatie. (A) Een illustratie van een 96 putplaat die de 10x seriële verdunningen van de teruggevonden voetpadweefsels die met L. amazonensis wild type(La-WT) en LIR1 knock-out(La-LIR1-/-) besmet zijn. Rijen A-D vertegenwoordigen het vierdubbele van de seriële verdunningen van het La-WT-voetpad letselmonster. Rijen E-H vertegenwoordigen het vierdubbele van de seriële verdunningen van het La-LIR1-/--voetpadlaesiemonster. De verschillende grijstinten vertegenwoordigen de waargenomen celdichtheden per goed (d.w.z. lichtere kleur betekent minder parasieten). De putten gemarkeerd in rood vertegenwoordigen de laatste putten die parasieten per repliceren bevatten. (B) Parasiet belasting in herstelde voetpad weefsels van C57BL / 6 muizen besmet met 106 gezuiverde metacyclics van L. amazonensis wild type (La-WT) en L. amazonensis LIR1 knock-out (La-LIR1-/-) bepaald 73 dagen postinfectie. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van de parasietbelasting per mg weefsel van vijf verschillende muizen in elke groep (aangepast van Laranjeira-Silva et al.14). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary Figure 1
Aanvullende figuur 1: Huidzweer als indicatief voor een secundaire infectie. Representatieve foto's van C57BL/6 muizen voetblokken besmet met L. amazonensis wild type(La-WT) genomen 80 dagen postinfectie. Rode pijlen wijzen op tekenen van ulceratie, wat aangeeft dat het experiment moet worden beëindigd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary Figure 2
Aanvullende figuur 2: De rol van LIR1 op in vivo laesieontwikkeling en intracellulaire parasietreplicatie. C57BL/6 muizen werden ingeënt in het linker achtervoetpad met 106 gezuiverde metacyclics van L. amazonensis wild type (La-WT), L. amazonensis LIR1 knock-out (La-LIR1-/-), en L. amazonensis LIR1 add-back (La-LIR1AB). (A) Footpad cutane laesie progressie van La-WT, La-LIR1-/-, en La-LIR1AB geïnfecteerde muizen geanalyseerd wekelijks. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van het geïnfecteerde voetpad afgetrokken door niet-geïnfecteerde voetpaddikte van vijf verschillende muizen in elke groep (aangepast van Laranjeira-Silva et al.14). (B) Parasiet belasting in herstelde voetpad weefsels van La-WT, La-LIR1-/-, of La-LIR1AB geïnfecteerde muizen bepaald 73 dagen nainfectie. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van de parasietbelasting per mg weefsel van vijf verschillende muizen in elke groep (aangepast van Laranjeira-Silva et al.14). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De in vivo infectietest beschreven in dit protocol stelt elke onderzoeker in staat om in vivo cutane leishmaniasis te evalueren, gezien de interactie tussen gastheer en parasiet in een systemisch scenario. Deze tests zijn gebruikt door vele groepen22,24,27,29,31,32,34,49 en hier hebben we een stapsgewijze protocol samengesteld om deze methode te standaardiseren, rekening houdend met de infrastructuurbeperkingen die sommige groepen kunnen hebben. Dit protocol kan ook worden gebruikt om virulentie van transgene Leishmania parasieten te evalueren door in vivo bioimaging50,51,52. Zoals elke andere experimentele procedure, deze test heeft beperkingen en kritische stappen uit te voeren, zoals die opgeleid personeel dat comfortabel werken met muizen en hebben ervaring in het uitvoeren van subplantaire injecties om toevallige infecties te voorkomen. Het standaardiseren van protocollen is uiterst belangrijk om bevooroordeelde resultaten te voorkomen en vergelijkbare resultaten te behalen onder verschillende onderzoeksgroepen.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van L. amazonensis als een model voor cutane leishmaniases is omdat het voetpad laesie veroorzaakt door deze soort kan gemakkelijk worden beoordeeld bij muizen. De zwelling van het voetpad bepaald door de hier beschreven methode vertegenwoordigt de som van twee infectie fenotypes: gastheer ontstekingsreactie en parasiet replicatie. Beide fenotypes kunnen afzonderlijk worden geëvalueerd door de parasietweefselbelastingmethode te associëren die parasiet intracellulaire replicatie weerspiegelt met de bepaling van de laesiedikteprogressie. Een ander voordeel is dat l. amazonensis'promastigoten gemakkelijk in vitro worden gekweekt. Gezien deze, elke onderzoeksgroep kan manipuleren deze Leishmania soort op basis van hun behoeften. De bevindingen uit l. amazonensis' studies kunnen vervolgens worden vergeleken met andere Leishmania soorten om te bepalen of een specifiek pad evolutionair wordt geconserveerd of divergent21,53,54.

In de natuurlijke cyclus, Leishmania transmissie naar de gewervelde gastheer vindt plaats door de beet van een besmette zandvlieg tijdens de bloedmaaltijd. De zandvlieg inoculeert gewoonlijk een paar honderd Metacyclisch promastigotevormen van het insect. Bij experimentele in vivo infecties is de meest voorkomende plaats van inenting het voetpad van het dier22. Intradermale injectie in het oor of intraperitoneale injectie zijn alternatieve plaatsen van inenting, afhankelijk van het onderzoeksdoel, omdat elke site verschillende fagocytische celtypen24,56presenteert. Daarom gebruiken sommige onderzoeksgroepen met laboratoriumbesmette zandvliegen om de oordermis van het dier te infecteren om de natuurlijke transmissie56,57,58,59na te bootsen. Dit protocol bevat echter een aantal beperkingen, zoals het onderhoud van zandvliegkolonies, waarvoor faciliteiten nodig zijn die niet beschikbaar zijn voor de meeste onderzoeksgroepen.

Het oorspronkelijke werk dat in vivo C57BL/6-infectie met La-LIR1-/- beschrijft, heeft gezuiverde metacyclische promastigoten formulieren14gebruikt. Leishmania genetische manipulatie kan echter afbreuk doen aan de differentiatie van de promastigoten in axenic amastigoten14 of in metacyclische infectieve vormen20. Daarom moet de onderzoeker, afhankelijk van de Leishmania-stam, de meest geschikte methode bepalen om levensvatbare infectieuze parasietvormen voor hun studie te verkrijgen. Het protocol van axenic amastigoten onderscheiden van hier beschreven promastigoteculturen kan een gemakkelijker alternatief zijn, wat vergelijkbare resultaten oplevert in veel gevallen19,20,35,37,38,64. Deze aanpak vermijdt het gebruik van andere methoden die doorgaans leiden tot lagere opbrengsten van infectieve parasieten, zoals het uitbroeden van promastigoten met specifieke maar niet breed beschikbare antilichamen65 voor metacyclische promastigotenzuivering, of door dichtheidsgradiënt afhankelijk van de LPG-expressie van metacyclics18,66. De efficiëntie van het differentiatieprotocol kan worden geëvalueerd door het bepalen van de expressieniveaus van amastin-familiegenen64,67. Amastinen zijn lid van een geconserveerde genfamilie die differentieel gemoduleerd zijn tijdens de Leishmania levenscyclus68 en worden geassocieerd met parasiet virulentie en pathogenese67,69,70. Andere markeringen kunnen ook worden gebruikt om amastigote te onderscheiden van promastigote vormen. Gp63 is bijvoorbeeld downregulated in amastigoten, omdat het de rol ervan is om de promastigoten te beschermen tegen de spijsverteringsenzymen van het insect71.

De keuze van de muis stam is een andere kritische stap te overwegen bij het ontwikkelen van een gestandaardiseerd in vivo infectie protocol. Gevoeligheid en resistentie tegen Leishmania infectie bij muizen worden voornamelijk gereguleerd door genetische achtergrond29,30,55. In dit protocol werd gekozen voor de C57BL/6-stam omdat de immuunrespons op L. amazonensis nauw verwant is aan de gemengde Th1-Th2-respons bij mensen72,73. Experimentele murineinfecties met L. amazonensis zijn beschreven om matige laesies in C57BL/6 muizen veroorzaken in vergelijking met andere muizenstammen28,34,74. Afhankelijk van de parasietstam zijn verschillen in de laesiegrootte echter alleen detecteerbaar bij gevoelige muizenstammen, zoals BALB/c36. Het verloop van de infectie moet ook worden overwogen en correleert met de gekozen muizenstam29,26,60,61,62,63,75. Zwerende voetkussens moeten altijd worden vermeden omdat het secundaire infecties kan vertegenwoordigen en vaak worden waargenomen bij langdurige perioden van infectie, vooral in experimenten met gevoelige muizenstammen. Het aanwijzen van het tijdstip van de dag om de infectie te starten is een volgende stap te overwegen. Zoals aangetoond in eerdere studies met L. amazonensis, beïnvloedt het tijdstip van de dag van parasiet inoculum de ontwikkeling van laesie omdat de interactie tussen gastheer en parasiet op een circadiane manier wordt beïnvloed door de door pijnbomen vrijgegeven melatonine tijdens de donkere tijd van dag75.

Het grote nadeel van de in vivo infectiemethode is dat het experiment het gebruik van een aanzienlijk aantal proefdieren vereist en langer duurt om definitieve resultaten te verkrijgen in vergelijking met de in vitro infectiemethode18. Dit laatste aspect kan echter ook als een voordeel worden beschouwd, aangezien de in vivo resultaten het natuurlijke verloop van de progressie van de ziekte nauwkeuriger weergeven dan de resultaten die zijn verkregen uit in vitro-infectie. Wat nog belangrijker is, de bevindingen van L. amazonensis in vivo infectie kunnen niet alleen de voorbijgaande veranderingen in parasietvirulentie weerspiegelen, maar erkent ook de systemische status van de gastheer en al zijn spelers. Daarom kan, gezien de verschillende hierboven genoemde factoren, de in dit protocol beschreven methode worden aangepast om te voldoen aan specifieke experimentele behoeften voor karakterisering van andere doelen en behandelingen in verband met virulentie, waardoor nieuwe inzichten voor cutane leishmaniasiscontrole mogelijk zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

We willen prof. dr. Niels Olsen Saraiva Câmara van het Animal Center van het Biomedical Sciences Institute van de Universiteit van São Paulo bedanken voor de steun en prof. dr. Silvia Reni Uliana voor het leveren van de glasweefselmolen. Dit werk werd ondersteund door Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - MFLS' subsidie 2017/23933-3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296 (2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13 (2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300 (2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594 (2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165 (2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140 (2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025 (2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22 (2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108 (2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486 (2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022 (2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238 (2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144 (2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80 (2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266 (2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340 (2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279 (2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764 (2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842 (2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980 (2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554 (2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026 (2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Tags

Immunologie en infectie C57BL/6 muizen ontstekingsrespons parasietbelasting laesieontwikkeling cutane infectie axenic amastigotes
In Vivo Infectie met <em>Leishmania amazonensis</em> om parasiet virultie in muizen te evalueren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R.… More

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter