Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ב Vivo זיהום עם לישמניה מלכותית כדי להעריך טפיל התקפה אלימה בעכברים

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הידור כדי להעריך את הזיהום עורית של עכברים עם לישמניה אמזונואנסיס. זוהי שיטה אמינה למחקר והתקפה של טפיל, המאפשרת מבט מערכתי של התגובה המארחת בעלי החוליות לזיהום.

Abstract

לישמניה spp. הם פרזיזומין טפילים שגורמות leishmaniases, מחלות הקיימות ספקטרום רחב של ביטויים קליניים מן עורית לנגעים בקרביים. כיום, 12,000,000 אנשים מוערכים להידבק לישמניה ברחבי העולם ומעל 1,000,000,000 אנשים חיים בסיכון של זיהום. לישמניה אמזונואנסיס היא אנדמיים במרכז ובדרום אמריקה ובדרך כלל מובילה לצורה העורית של המחלה, אשר ניתן לדמיין ישירות במודל של בעל חיים. לכן, הזנים L. אמזונואנסיס הם מודלים טובים עבור לימודי עור לישמניה משום שהם גם מעובדים בקלות בתוך מבחנה. C57BL/6 עכברים לחקות את ה- L. אמזונאנסיסמונחה התקדמות המחלה נצפתה בבני אדם נחשבים לאחד מדגם העכברים הטובים ביותר של זנים עבור לישמנית עורית. ב המארח בעלי החוליות, טפילים אלה לאכלס מקרופאגים למרות מנגנוני ההגנה של תאים אלה. מספר מחקרים להשתמש מקרופאג מחוץ לגופית הזיהום בחני להעריך את הטפיל הנגועים בתנאים שונים. עם זאת, הגישה החוץ-גופית מוגבלת למערכת תא מבודדת המתעלמת מתגובת האורגניזם. כאן, אנו לקמפל בשיטה זיהום vivo murine המספקת סקירה פיזיולוגית מערכתית של אינטראקציה מארח-טפיל. הפרוטוקול המפורט של זיהום vivo של C57BL/6 עכברים עם L. אמזונואנסיס כולל בידול טפיל לתוך amastigotes, עכברים הרגליים footpad, התפתחות נגעים, ונחישות עומס טפיל. אנו מציעים זו שיטה מבוססת היטב כשיטה הנאותה ביותר עבור מחקרים פיסיולוגיים של המערכת החיסונית מטבולית התגובות לישמניה עורית.

Introduction

Leishmaniases הם ברחבי העולם מחלות זיהומיות טפיליות המייצגים אתגרים חשובים במדינות מתפתחות מזוהים כאחד המחלות הטרופיות החשובים ביותר מוזנחים על ידי ארגון הבריאות העולמי1,2. הleishmaniases מאופיינים בביטויים של עורית, מיוקורסל ו/או הקרביים. לישמניאזיס העורית נגרמת בדרך כלל על ידי L. אמזונואנסיס, ל' מקסיאנה, ל. braziliensis, ל. גויאנאנסיס, ל' מייג, ל' טרופיקה ו -L. אתיופיקה3. צורה זו של המחלה היא לעתים קרובות ריפוי עצמי בבני אדם בשל אינדוקציה של תגובה חיסונית המגן הסלולר. עם זאת, התגובה החיסונית הסלולר עלול להיכשל, ואת המחלה יכולה להתקדם לתוך לישמניסטית עורית4,5. אין חיסון זמין בשל גיוון בין לישמניה מינים ורקעים גנטיים מארחים6,7. אפשרויות הטיפול מוגבלות גם כמו רוב התרופות הזמינות כיום הם יקרים, רעילים, ו/או עשוי לדרוש טיפול לטווח ארוך8,9. חוץ מזה, היו דיווחים על התנגדות לסמים. כנגד הטיפולים הזמינים10,11

הסוכן סיבתי של leishmaniases הוא פרוטוזומין טפיל לישמניה. הטפיל מציג שתי צורות מורפולוגיות ברורים במחזור החיים שלה: promastigotes, הטופס הדגל המצוי בזבובי חול; ואת amastigotes, הצורה התאיים נמצא בתוך החללים הפרזיטאטיים של מקרופאגים מארחים של היונקים12,13. היכולת של amastigotes לפלוש, לשרוד, ולשכפל למרות מנגנוני ההגנה של מקרופאגים של המארחים בעלי חוליות כפופים למחקרים רבים14,15,16,17. כתוצאה מכך, כמה קבוצות מחקר כבר לתאר בתחום מקרופאג מבחנה הזיהום בחני להעריך את ההשפעה של גורמים סביבתיים ספציפיים, כמו גם טפיל ומארח גנים על הנגועים טפיל. שיטת הפעולה מציגה מספר יתרונות, כגון היכולת להתאים את המחקרים לפורמט תפוקה גבוה, תקופה קצרה יחסית להשגת תוצאות, ומספר מופחת של בעלי חיים מעבדתיים הקריבו18. עם זאת, ממצאי מחוץ לעולם הספר מוגבלים כי הם לא תמיד לשכפל במחקרים vivo14,19,20,21. ב vivo בחני לספק סקירה פיסיולוגיים מערכתית של האינטראקציה המארחת-טפיל, אשר לא ניתן לחיקוי מלאה של מחוץ לבית הספר. למשל, מחקרים אימונולוגיים ניתן לבצע דרך אימונוהיסטוכימיה בחני מ אספו מקטעים רקמות footpad או אפילו מבלוטות הלימפה popliteal לניתוח של תאים חיסוניים התאושש22.

בעלי חיים משמשים לעתים קרובות כמודל למחלות אנושיות במחקר ביולוגי וביורפואי כדי להבין טוב יותר את המנגנונים הפיזיולוגיים הבסיסיים של מחלות23. במקרה של לישמניאזיס, המסלול, האתר, או המינון של החיסון התוצאה המחלה24,25,26,27. יתר על כן, הרגישות וההתנגדות לזיהום בבני אדם ועכברים מוסדרים מאוד על ידי הרקע הגנטי של הפונדקאי והטפיל4,5,22,28,29,30,31. עכברים BALB/c הם רגישים מאוד ל -L. אמזונאנסיס זיהום עורית, מראה התקדמות מחלה מהירה עם הפצת טפילים לבלוטות הלימפה, טחול, והכבד32. כאשר המחלה עשויה להתקדם גרורות עורית, הזיהום יכול להיות קטלני. לעומת זאת, C57BL/6 עכברים לעתים קרובות לפתח נגעים כרוניים עם המון טפיל מתמשך בשנת הזיהום L. אמזונואנסיס בחני אומר33. ובכך, L. אמזונואנסיס זיהום עם מינים אלה עכבר מסוים נחשב מודל מצוין ללמוד צורות כרוניות של לישמנית עורית בבני אדם, כי זה מחקה את התקדמות המחלה יותר טוב מאשר הזיהום balb/c הידבקות מודל5,34.

מכאן, אנו מציעים כי מורנין בזיהום vivo היא שיטה שימושית עבור לישמניה מחקרים פיסיולוגיים התקפה למחלות אנושיות, המאפשר תצוגה מערכתית של אינטראקציה מארח-טפיל. ביקור חוזר היטב מבוססת בחני22, אנו מציגים כאן פרוטוקול שלב אחר שלב הידור של vivo הזיהום של C57BL/6 עכברים עם L. אמזונואנסיס הכוללת את הבידול טפיל לתוך amaenic האמסטיטים, עכברים footpad הרגליים, התפתחות נגעים, ונחישות עומס הטפיל. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לזנים אחרים של עכברים ומינים לישמניה הגורמות leishmaniases עורית. לסיכום, השיטה המוצגת כאן היא חיונית בזיהוי מטרות תרופות אנטי-לישמניה חדשות וחיסונים, כמו גם במחקרים פיסיולוגיים של המערכת החיסונית מחשב מטבולית ואת התגובות לזיהום לישמניה .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש במכון הביומדע של אוניברסיטת סאו פאולו (CEUA 342/2019), ונערכו בהתאם להמלצות ולמדיניות הטיפול והשימוש בחיות מעבדה של סאו פאולו המדינה (ליי Est, 11.977, de 25/08/2005) ו הממשלה הברזילאית (ליי הפדרלי 11.794, de 08/10/2008) כל השלבים המתוארים בסעיפים 1-5 צריכים להתבצע בתוך ארונות זרימה למינארי. ציוד הגנה אישי צריך להיות מנוצל תוך התמודדות עם לישמניה לחיות טפילים.

1. בבידול חוץ גופית של L. אמזונואנסיס פרוסטיטיס לתוך האקסון15,20,35,36,37,38

הערה: L. אמזונואנסיס (MHOM/BR/1973/M2269) (La) טפיל שימש באותו שימוש. בהתאם למטרת המחקר, הטופס טפיל זיהומיות ניתן להשיג גם על ידי טיהור של טופס metacyclic באמצעות הדרגתי צפיפות, כפי שתוארה בעבר14, או על ידי הבידול של promastigotes לתוך האקסון axenic, על פי הפרוטוקול הבא.

  1. לגדול La promastigotes ב 25 ס מ2 תרבות התא בקבוקון המכיל 10 מ ל של בינונית עבור promastigotes (pro-medium) (pH = 7.0).
  2. מודטה ב -25 ° c במשך שלושה ימים.
    הערה: להשתמש בתרבויות promastigote שהיו בעבר מבחנה פחות מ 10x כדי למנוע אובדן של התקפה אלימה ושינויים אנאפלואידיה של טפילים39,40,41,42,43,44.
  3. פיפטה 5 מ ל של שלב הצמיחה לוגריתמי פרואסטיט התרבות לתוך חדש 25 ס מ בקבוקון2 .
  4. הוסף 5 מ ל של בינוני עבור האמסטיגוטים (ama-medium) (pH = 5.2).
  5. מודטה ב 34 ° c עבור 3-4 ימים.
  6. פיצול התרבות על ידי דילול עם אמה-בינוני ביחס של 1:3 לתוך חדש 25 ס מ בקבוקון2 .
  7. מודטה ב 34 ° c עבור 3-5 ימים.
    הערה: מודזת את האמסטיגוטים האקאסטוליטס עד 5 ימים, כפי שהוא מייצג את סוף ההבשלה37.

2. C57BL/6 זיהום Footpad עם L. אמזונואנסיס

הערה: נשים C57BL/6 עכברים (6-8 שבועות) הושגו והחזיקו במרכז בעלי החיים של המכון למדעי ביו של אוניברסיטת סאו פאולו. בעלי חיים קיבלו מזון ומים ליביום.

  1. לספור את התרבות של axenic amastigotes על ידי העברת סדרת מחלקים של ההשעיה הטפיל מדולל PBS לחדר של נויבאואר (כלומר, הומוציטוטר). , תספור את הטפילים הלא-מלאים. שמייצגים צורות של אמסטיגוטים
    הערה: לחילופין, כחול טרילון (1:1) יכול לשמש לספירת מספר האמסטיגוטים הקיימא (כלומר, אלה שאינם מוכתמים בכחול טריכאני).
  2. לדלל את האקסון האקאסטוליטים ב-PBS על פי המינון הרצוי מינון ומספר האיקולולים המיועדים (1 x 106 מדהים amaenic ב 50 μl של PBS מומלץ).
  3. לטעון מזרק טוברקולין עם מחט של 27 גרם עם ההשעיה הטפיל מוכן.
  4. לC57BL העכבר/6 באמצעות 3-5% isofלאנה, כפי שמומלץ על ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס בעלי חיים הוועדה שימוש45. להעריך את עומק ההרדמה על ידי בדיקת תגובת העכבר כדי צביטה בבוהן.
  5. איחסן 50 μL של הבולם הטפיל הומוגניים (1 x 106 מאמציה axenic או המינון הרצוי) ברקמת subplantar של השמאלית הימנית footpad, באמצעות המזרק הטעון בעבר מזרק (שלב 2.3).

3. עכבר הרגליים פיתוח הנגע

  1. למדוד את ההתקדמות של הנגע פעם בשבוע על ידי מדידת עובי של שמאל (נגוע) ואת הזכות (לא נגוע) אפם באמצעות caliper.
  2. לחשב את ההבדל בין העובי בין שמאל וימין הרגליים האחוריות שבועי להערכת התקדמות הנגע.
  3. התווה את ההבדלים המחושבים בציר Y ובזמן ההדבקה על ציר ה-X וחשב את המשמעות הסטטיסטית.
    הערה: בהתאם להמלצות הטיפול בבעלי חיים והשימוש בוועדות, יש להקריב בעלי חיים לפני שהנגעים הנגועים יהיו כחולים, כי כיבים בעור עלולים לגרום לזיהום משני. כפי שמוצג באיור המשלים 1, זה לוקח בערך 10 שבועות על נגעים להציג סימנים של כיבית עם המינון טפיל (106 מדהים axenic) ואת המתח המארח (C57BL/6) בשימוש בפרוטוקול זה. העכברים צריכים להיות מוקרבים לחילוץ הנגע לפני סימני כיבית הם נצפו.

4. עכברים מיצוי הנגע והטפיל הגבלת דילול

  1. להכין צלחת הטוב 96 (התחתון שטוח) עבור הגבלת הצורך דילול מגבלה46,47 על ידי הוספת 180 μl של פרו-בינונית לכל הבארות.
    הערה: השתמש בארבעה מסלולי לוח (מחצית הצלחת) עבור כל חיה, המייצג את הכריכה (כלומר, בעלי חיים 1 = נתיבים A-D; בעלי חיים 2 = נתיבים E-H).
  2. הוסיפו 1 מ ל של פרו-בינונית בצינור מטחנת זכוכית לנגע ושוקלים את השפופרת.
    הערה: הצינור חייב להישמר סטרילי, כך להשתמש במכסה סטרילי לשקול את הצינור עם המכסה הסגור, אם במשקל מחוץ לארון הזרם למינארי.
  3. הקריבו את החיה בחדר CO2 , בעקבות ההמלצות לטיפול בבעלי חיים והשימוש בוועדות. לחטא את החיה על ידי ריסוס עם 70% אתנול.
  4. בלו הרגל של החיה על זה עקבים כדי לחלץ את footpad נגוע ריסוס 70% אתנול על footpad לחיטוי. להבטיח עיקור של מספריים ומלקחיים על ידי שמירה עליהם ספוגים ב-70% אתנול.
  5. מניחים את footpad נגוע צלחת פטרי סטרילית ונתח באמצעות מלקחיים סטרילי אזמל לאסוף את כל הרקמות הרך. . להיפטר מהעצמות
    הערה: האחידות בשלב הניתוח מומלצת למניעת התאוששות מרקמות משוחדת.
  6. להעביר את הרקמות שנאספו לצינור מטחנת רקמה זכוכית עם פרו-בינונית, ואז לשקול את הצינור שוב כדי לקבוע את משקל הנגע.
    הערה: הימנע הצבת מלקחיים ואזמל ישירות לתוך המדיום, כמו כרכים קטנים ניתן להסיר, וכתוצאה מכך משקל הרקמה המעיט. משקל הנגע מחושב על ידי הפחתת משקל הצינור המכיל pro-medium עם רקמת שנאסף ממשקל של צינור המכיל רק פרו-בינונית.
  7. המגון הרקמה 10x באמצעות מטחנת עבור הפרעה רקמת מלאה.
  8. לאפשר את התערובת משקע עבור 10 דקות, ולאחר מכן לאסוף 20 μL של סופרנטנט.
  9. טען 20 μL של supernatantבעמודה 1 של הנתיב 1st של 96 צלחת באר מוכן בשלב 4.1. חזור על זה עבור שלושת הנתיבים הבאים כדי לקבל מרובע עבור כל חיה (כלומר, עבור בעלי חיים 1 להוסיף 20 μL לכל טוב תווית A1, B1, C1, ו D1).
  10. המגון לסדר כל טוב ב 1 בעמודההראשונה 10x באמצעות הצינורות רב-ערוצי. לאחר מכן, העבר 20 μL של דגימות מדוללמהעמודה 1 לעמודה 2 .
    הערה: חשוב להמגון כל 10x היטב מטור אחד למשנהו.
  11. חזור על שלב 4.10 לכל העמודות הנותרות עד לעמודה האחרונה (12) ולאחר מכן מחק את20 ה-μl האחרונים של דגימה מדוללת.
    הערה: שינוי העצות לאחר כל דילול כדי למנוע זיהום צולב.
  12. אטום את לוחיות הרישוי באמצעות סרט ומודב 25 ° c במשך 7 ימים בחדר לח.

5. החלטה מטען טפיל הנגעים

  1. לנתח את הצלחות לאחר 7 ימים של דגירה באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע את שימוש הטפיל האחרון המכיל היטב עבור כל נתיב.
    הערה: ניתן גם לציין את התפתחותם של טפילים, או צפיפות התא, על ידי ניתוח חזותי של שינויי צבע ועכירות של המדיום.
  2. לחשב את העומס רקמת הטפיל עבור כל נתיב על ידי חלוקת גורם הדילול לכל משקל נגע.
    הערה: בנתיב מסוים, אם הטפילים נמצאים רק בעמודות 1-5 (כלומר, בארות A1-A5 הן חיוביות לצמיחה טפיל), משמעות הדבר היא כי עמודה 5 הכיל רק 1 טפיל, טור 4 הכיל 10 טפילים, וכן הלאה, בכפולות של 10. טור 1 מכיל 104 טפילים, אשר מייצג את מספר טפילים ב 20 μl הראשונית של סופרנטנט (המדגם לא מדולל בשלב 4.7). בגלל זה 20 μL היה מדולל עם 180 μL של פרו-בינונית, הצינור הראשוני הכיל 5 x 105 טפילים: (1 x 104)/(0.02 mL) = 5 x 105 טפילים/1 ml. לאחר מכן, הטפיל טען בנגע זה יכול להיות מחושב על ידי חלוקת הריכוז הראשוני של הטפיל על ידי משקל הנגע: (5 x 105)/נגע משקל (ראה שלב 4.6).
  3. התווה את ממוצע התוצאה הquadruplicated עבור כל חיה בעלת קנה מידה Y של יומן רישום.

6. אנליזה סטטיסטית

  1. ייצוג הנתונים כסטיית תקן ממוצעת של ± standard באמצעות לפחות חמש בעלי חיים לכל קבוצה ניסיונית כשכפל.
  2. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות בדיקה דו-זנבית שאינה משויכת, בהתחשב בערך p < 0.05 כמשמעותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לישמניה פרוטוזומין טפילים קיימים בשתי צורות התפתחותיות במהלך מחזור החיים שלהם חסרי חוליות מארחים בעלי חוליות: promastigotes, צורות מתרבים למצוא לומן של זבוב הנקבה; והאמסטיגוטים, הצורות המתרבים שנמצאו בחללים הפרזיטאטיים של תאי המארחים היונקים. Promastigotes יש גוף מוארך של כ 1.5 יקרומטר רוחב ו 20 יקרומטר ארוך, עם שכאלילום המתעוררים בדרך כלל מן הגפיים הקדמי. Amastigotes יש גוף מעוגל או דמוי החל בגודל מ 2-6 יקרומטר אורך ו 1.5-3 יקרומטר ברוחב, ובעלי הדגל בלתי נראה12,13 (איור 1א). במהלך הארוחה בדם הפונדקאי החסרי חוליות, חרק המטפייתי של המשפחה הפסיכודיתיים, רוכש מקרופאגים נגועים לישמניה amastigotes. לאחר תאים אלה להגיע צינור העיכול החול, amastigotes משתחררים ולהבדיל כדי procyclic חזורי promgotes (איור 1א). צורות אלו אינן זיהומיות ומתרבים באופן אינטנסיבי על ידי חלוקה בינארית וליישב את צינור העיכול של וקטור החרק. הצורות הפרוציקליות מספרות לאחר מכן לטפסי מחלקה, טופס מהיר ונעים, המציג גוף דק יותר ומוארך במרצפות (איור 1א). טפסים מטאכללחץ לפלוש החלקים הקדמי של הוושט וקיבת הבלוטות של זבוב, כך שבמהלך ארוחה הדם הבאה שלה, אי-ספיקת מבטיח את החיסונים של צורות אלה מדביק לתוך מארח בעלי חוליות חדש. ב-tegument של מארח בעלי חוליות, טפילים הם phagocytosed על ידי מקרופאגים ולהבדיל לתוך amastigotes בתוך וואסטוליאוס פרזיטים, שם amastigotes הכפל על ידי חלוקה בינארית ולהשלים את מחזור החיים של לישמניה12,13.

תנאי axenic יכולים לדמות סביבות מארחים שונים בתוך מבחנה, שמירה על מורפולוגיה הטפיל הכדאיות. התנאים axenic עבור amastigotes תוארו בעבר הדמיית הסביבה הפרזיטתית של מקרופאג והוא מפעיל promastigote בידול לתוך מבחנה אל הטופס amastigotes37. תנאים אלה מחקים את הסביבה חומצי (pH = 5.5) ואת הטמפרטורה המוגבר של המארחים בעלי חוליות (34 ° c). איור 1ב ממחיש promastigotes הבדיל כדי amastigotes על ידי שינוי תנאים אלה בתרבות. הכדאיות של האקסטיגוטים האלה ניתן לנתח על ידי מכתים כחול טרילון, שיטה המבוססת על העיקרון כי תאים חיים בעלי קרומים שלמים שאינם מוציאים צבעים מסוימים, בעוד תאים מתים אינם48. לחילופין, ניתחנו את יכולת הכדאיות של האקאנמית amastigotes המאמת את יכולתם להפוך חזרה promastigotes כאשר הועברו ל-pH נייטרלי ו מוד, ב 25 ° צ' (איור 1B).

כאן אנו מציעים שיטת זיהום vivo כדי להעריך את התקפה אלימה של זנים לישמניה שונים. איור 2A מייצגת את הvivo הזיהום מראה את ההתפתחות הנגע עורית של C57BL/6 עכברים אפם כי היו נגועים בסוג פראי (la-WT) ו לישמניה ברזל הרגולטור 1 הנוקאאוט (לה-LIR1-/-) L. אמזונאנסיס מטוהר מטאקוליקס. LIR1 ויסות רמות ברזל תאיים ב לישמניה תיווך ברזל ייצוא ומניעת הצטברות תאיים שלה רמות רעילות14. התבוננות ההתקדמות של הבדלים עובי של הנגועים לעומת שאינם נגועים footpads, היינו מסוגלים להדגים כי La-LIR1-/- העכברים נגועים הציגו נגעים קטנים יותר מאשר העכברים נגועים la-WT (איור 2א). ממצאים אלה חשפו כי LIR1 חיוני ל -"אל-אמזונואנסיס " ב-vivo התקפה אלימה. זה מדגים את החשיבות ואת היעילות של שיטה זו בהערכת ההבדלים של מחלות עור לישמניהמונחה. איור 2B ממחיש את לא נגוע (מימין) ו נגוע (משמאל) אפם ופיתוח נגעים 73 ימים postinfection, מראה את ההבדלים נפיחות התקדמות הנגע של la-WT ו- la-LIR1-/. עכברים נגועים.

ההתקדמות של הזיהום לישמניה מורכב לא רק של התפתחות הנגע, אשר מייצג את התגובה דלקתית, אלא גם את השכפול תאיים של הטפיל. כדי להעריך שכפול טפיל, עומס הטפיל של נגעים נקבע על ידי חילוץ הנגע נגוע, ואחריו שיטת דילול מגביל ב 96 צלחת היטב (איור 3a). איור 3ב מראה את הניתוח הטפיל עומס של נגעים footpad מ La-WT ו- La-LIR1-/ העכברים נגועים לאחר 73 ימים של זיהום. מתוך שיטת הדילול המגביל, גילינו 10 מתקפלשישהפחות טפילים בנגע של העכברים la-LIR1-/- נגועים בהשוואה La-WT, חשיפת כי העדר LIR1 מונע שכפול תאיים של amastigotes14.

אחד היתרונות של הערכת הן התפתחות הנגע והטפיל עומס הוא לזהות הבדלים אפשריים של שכפול הטפיל תאיים ואת התגובה הדלקתית המארחת. הבחנו הבדלים בין שני פנוטיפים אלה באמצעות התוספת LIR1 (La-LIR1AB), שהוא La-LIR1-/- עם LIR1 orf משולב חזרה לתוך לוקוס ריבוזומלית14. כאשר La-LIR1AB הוזרק לתוך footpad של העכבר, הבחנו נגעים בגודל בינוני לעומת La-LIR1-/- ו- la-הדלקות האלה, אך הצלה מלאה טפיל מלא החילוץ של La-WT פניטיפ (איור משלים 2). תוצאות אלה מצביעות על כך la-LIR1AB טפילים הצליחו לשכפל כמו La-WT טפילים בזיהום לטווח ארוך בvivo. עם זאת, התגובה דלקתיות העכבר לא היה מחמיר כמו La-WT זיהומים כי הנגעים היו קטנים באופן משמעותי.

ובכך, השיטה המתוארת כאן היתה חיונית לזיהוי ואפיון של מקדם התקפה אלימה של L. אמזונואנסיס הדרושה לשכפול מוצלח של מאמציה התאיים ולפיתוח הנגעים העורית במחשבים המארחים היונקים.

Figure 1
איור 1: מורפולוגיה של ל. אמזונואנסיס פרונטוליטיטיס ואמסטיגוטיס. (א) איורים של צורות מורפולוגיות שונות של לישמניה: פרוציקליות פרומטוליטה, מטאכצילציט, ו amastigote. סרגל קנה מידה = 2 μm. (ב) תמונות של תרבויות מבחנה. בידול מחוץ לגופית של promastigotes לתוך האמסטיגוטיס axenic, ו של axenic amastigotes חזרה promastigotes על ידי שינוי תנאי pH ו טמפרטורה, כפי שמתואר בפרוטוקול צעד אחר צעד. התמונות צולמו בעזרת. מיקרוסקופ הפוך סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: LIR1 הנוקאאוט מפחית באופן מדהים את ל. אמזונואנסיס בהתפתחות vivo נגעים. C57BL/6 עכברים חוסנו בתוך הרגליים האחוריות השמאלית עם 106 metacyclics מטוהרים של l. אמזונואנסיס סוג פראי (לה-WT) ו -l. אמזונואנסיס LIR1 נוק (לה-LIR1-/-). (A) footpad התקדמות הנגע של La-WT ו- la-LIR1-/- עכברים נגועים ניתח שבועי. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SEM של כרית החולים נגוע מחוסר בעובי footpad שאינו נגוע מחמישה עכברים שונים בכל קבוצה (מותאם לlaranjeira-סילבה ואח '14). (ב) תמונות של רפידות הרגליים שאינם נגועים ונגועים של la-WT ו- la-LIR1-/- נגועים miceshowing ציג את ההבדלים נפיחות 73 ימים פוסט הדבקה (מותאם לlaranjeira-סילבה ואח '14). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: LIR1 הנוקאאוט מפחית במידה ניכרת L. אמזונואנסיס בשכפול vivo תאיים. (א) איור של 96 צלחת באר המייצג את הדילול הטורי 10x של רקמות footpad התאושש נגוע L. אמזונואנסיס סוג פראי (LA-WT) ו LIR1 הסתרה (la-LIR1-/-). שורות A-D מייצגות את המקלדת של הדילול הסידורי של דגימת הנגע La-WT-footpad. שורות E-H מייצגות את הקורופליקות של הדילול הסדרתי של ה- La-LIR1-/--דגם הנגע footpad. גוונים שונים של אפור מייצגים את צפיפות התא הנצפה לכל טוב (כלומר, צבע בהיר יותר פירושו פחות טפילים). הבארות המסומנות באדום מייצגות את הבארות האחרונות שהכילו טפילים לכל שכפול. (ב) הטפיל טען התאושש רקמות FOOTPAD של C57BL/6 עכברים נגועים 106 metacyclics מטוהרים של l. אמזונאנסיס סוג פראי (la-WT) ו -L. אמזונואנסיס LIR1 הסתרה (לה-LIR1-/-) נקבע 73 ימים לאחר ההדבקה. הנתונים מייצגים את הממוצע של עומס הטפיל לכל מ ג של רקמה מחמישה עכברים שונים בכל קבוצה (מותאם ללאנג'יירה-סילבה ואח '14). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 1
איור משלים 1: כיב העור כרמז על זיהום משני. תמונות מייצגות של C57BL/6 עכברים כפות הרגליים נגוע L. אמזונואנסיס סוג פראי (לה-WT) נלקח 80 ימים פוסט הדבקה. חיצים אדומים מצביעים על סימני כיבית, ומציינים כי יש לסיים את הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 2
איור משלים 2: תפקידה של LIR1 ב פיתוח נגעים vivo ושכפול הטפיל תאיים. C57BL/6 עכברים חוסנו בתוך הרגליים האחוריות השמאלית עם 106 metacyclics מטוהרים של l. אמזונואנסיס סוג פראי (לה-WT), L. אמזונואנסיס LIR1 הסתרה (לה-LIR1-/-), ו -l. אמזונואנסיס LIR1 הוספה בחזרה (לה-LIR1AB). (A) footpad התקדמות הנגע של la-WT, La-LIR1-/-, ו- la-LIR1AB עכברים נגועים ניתח שבועי. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SEM של כרית החולים נגוע מחוסר בעובי footpad שאינו נגוע מחמישה עכברים שונים בכל קבוצה (מותאם לlaranjeira-סילבה ואח '14). (ב) הטפיל טען ברקמות התאושש footpad מ- la-WT, La-LIR1-/-, או La-LIR1AB עכברים נגועים קבע 73 ימים postinfection. הנתונים מייצגים את הממוצע של עומס הטפיל לכל מ ג של רקמה מחמישה עכברים שונים בכל קבוצה (מותאם ללאנג'יירה-סילבה ואח '14). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הvivo הזיהום המתואר בפרוטוקול זה מאפשר לכל חוקר להעריך vivo עורית לישמניתבהתחשב האינטראקציה המארחת טפיל בתרחיש מערכתי. השיטות הללו שימשו על ידי קבוצות רבות22,24,27,29,31,32,34,49 וכאן הערכנו פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לתקנן שיטה זו תוך התחשבות במגבלות התשתית שיש לקבוצות מסוימות ייתכן. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להעריך התקפה אלימה של טפילים לישמניה הטרנסגניים על ידי vivo bioimaging50,51,52. כמו כל הליך ניסיוני אחר, שיטת זה יש מגבלות ושלבים קריטיים לביצוע, כגון דרישה לעובדים מיומנים כי הם נוחים לעבוד עם עכברים יש ניסיון בביצוע זריקות subplantar כדי למנוע זיהומים בשוגג. הפרוטוקולים של סטנדרטיזציה מאוד חשובים כדי להימנע מתוצאות משוחדת ולהפיק תוצאות דומות בין קבוצות מחקר שונות.

היתרון העיקרי של שימוש L. אמזונואנסיס כמודל עבור עורית leishmaniases היא בגלל הנגע footpad הנגרמת על ידי מין זה ניתן להעריך בקלות בעכברים. הנפיחות של footpad נקבע על ידי השיטה המתוארת כאן מייצגת את הסכום של שני פנוטיפים זיהום: תגובה דלקתית מארח שכפול טפיל. שני פנוטיפים יכולים להיות מוערכים בנפרד על ידי שיוך שיטת העומס של רקמת טפיל המשקף שכפול הטפיל תאיים עם הנחישות של התקדמות עובי הנגע. יתרון נוסף הוא שהפרוסטיטיס של ל. אמזונואנסיסמעובדים בקלות בתוך מבחנה. בהתחשב באלו, כל קבוצת מחקר יכולה להשפיע על המינים הלישמניה הללו בהתאם לצרכיהם. ממצאי מחקריו של L. אמזונואנסיסעשויים להיות מושווים עם מינים לישמניה אחרים כדי לקבוע אם מסלול מסוים שימור באופן אבולוצייתי או מפוצלים21,53,54.

במחזור הטבעי, לישמניה שידור למארח בעלי החוליות מתרחשת על ידי נשיכה של חול נגוע לעוף במהלך הארוחה בדם. זבוב החול מגיע בדרך כלל לכמה מאות לישמניה של צורות פרוסטיטציטים ברוק של החרק. בזיהומים vivo, האתר התכוף ביותר של החיסון הוא משטח החיות22. הזרקה תוך כדי הזרקה לאוזן או הזרקת הצפק הם אתרים חלופיים של חיסונים בהתאם למטרת המחקר, כי כל אתר מציג סוגי תאים שונים phagocytic24,56. לכן, כמה קבוצות מחקר להשתמש מעבדה נגועים חול זבובים להדביק את האוזן של החיה דרמיס לחקות את השידור הטבעי56,57,58,59. עם זאת, פרוטוקול זה מציג מספר הגבלות, כגון תחזוקת מושבות מזבוב החול, הדורשות מתקנים שאינם זמינים עבור רוב קבוצות המחקר.

העבודה המקורית המתארת ב vivo C57BL/6 הזיהום עם La-LIR1-/- השתמשה מטאכלילחץ מטאסימטטים מטוהרים טפסים14. עם זאת, מניפולציה גנטית לישמניה יכול לפגוע גם promastigotes ' הבידול לתוך האמסטיטים amastigotes14 או לתוך צורות infacyלמטה לטפסים20. מכאן, בהתאם למתח לישמניה , החוקר צריך לקבוע את השיטה הנאותה ביותר כדי לקבל טפסים טפיל בר קיימא עבור המחקר שלהם. הפרוטוקול של axenic amastigotes הבדיל מתרבויות promastigote שתוארו כאן יכול להיות חלופה קלה יותר, הפקת תוצאות דומות במקרים רבים19,20,35,37,38,64. גישה זו מונעת את השימוש בשיטות אחרות שגורמות בדרך כלל לתשואות נמוכות יותר של טפילים אנדוקרדיטיס זיהומית כגון הפרודיטים promastigotes עם נוגדנים מסוימים, אך לא זמין באופן נרחב65 עבור מטאכללחץ promאסטיטים לטיהור, או על ידי צפיפות מעבר הדרגתי של metacyclics "LPG ביטוי18,66. היעילות של הפרוטוקול בידול ניתן להעריך על ידי קביעת רמות הביטוי של משפחת אמסטין-הגנים64,67. Amastins הם חברים של משפחת גנים שנשמרים, כי הם באופן מאופנן במהלך מחזור החיים לישמניה 68 והם קשורים עם התקפה ואלימה של טפיל בפתוגנזה67,69,70. סמנים אחרים יכולים לשמש גם כדי להבחין amastigote מתוך הצורות promastigote. לדוגמה, gp63 מוסדרות ב-amastigotes, כי תפקידה הוא להגן על promastigotes מן אנזימי העיכול של החרק71.

הבחירה של זן העכבר הוא צעד קריטי אחר כדי להיחשב בעת פיתוח סטנדרטית בפרוטוקול זיהום vivo. הרגישות והעמידות לישמניה זיהום בעכברים מוסדרים בעיקר על ידי רקע גנטי29,30,55. בפרוטוקול זה, הנבג C57BL/6 נבחר משום שהתגובה החיסונית שלה ל -L. אמזונואנסיס קשורה היטב לתגובת Th1-Th2 המעורבת בבני אדם72,73. זיהומים murine ניסיוני עם L. אמזונואנסיס תוארו לגרום נגעים מתונים ב C57BL/6 עכברים בהשוואה זנים אחרים של עכברים28,34,74. עם זאת, בהתאם לזן טפיל, הבדלים בגודל הנגע רק לזיהוי זנים עכברים רגישים, כמו BALB/c36. מהלך הזמן של זיהום גם צריך להיחשב והתואם עם מאמץ עכברים נבחר29,26,60,61,62,63,75. רפידות כיבית צריך תמיד להימנע כפי שהוא עשוי לייצג זיהומים משניים ונצפה לעתים קרובות בתקופות ארוכות של זיהום, במיוחד בניסויים עם זנים עכברים רגישים. הגדרת זמן היום להתחלת הזיהום היא צעד נוסף להיחשב. כפי שמתואר במחקרים קודמים עם L. אמזונואנסיס, הזמן של יום של טפיל מושפע משפיע על התפתחות הנגע כי האינטראקציה המארחת הטפיל מושפעת באופן מעגלי על ידי האצטרובל-שוחרר מלטונין במהלך הזמן האפל של היום75.

החיסרון העיקרי של שיטת זיהום vivo היא כי הניסוי דורש שימוש של מספר משמעותי של בעלי חיים מעבדה ולוקח זמן רב יותר כדי לקבל את התוצאות הסופיות בהשוואה שיטה זיהום מחוץ גופית18. עם זאת, היבט זה האחרון יכול להיחשב גם כיתרון מאז vivo תוצאות משקפים את הזמן הטבעי של התקדמות המחלה באופן מדויק יותר מאשר התוצאות שהתקבלו מזיהום מחוץ לתחום. וחשוב מכך, הממצאים מ -L. אמזונואנסיס בזיהום vivo לא יכולים רק לשקף את השינויים הזמניים התקפה אלימה הטפיל, אלא גם מכיר את הסטטוס מערכתי של המארח ואת כל השחקנים שלה. לכן, בהתחשב בכמה גורמים שהוזכרו לעיל, השיטה המתוארת בפרוטוקול זה ניתן להתאים כדי לענות על הצרכים הניסיוניים הספציפיים לאפיון של יעדים אחרים וטיפולים הקשורים התקפה אלימה המאפשרת תובנות חדשות עבור שליטה לישמרת העורית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

היינו רוצים להודות לפרופ ' ד ר נילס אולסן סאראמנה קמפמארה ממרכז בעלי החיים של המכון למדעים ביו-רפואיים של אוניברסיטת סאו פאולו לתמיכה ופרופ ' ד ר סילביה רנן אטול לספק את מטחנת רקמת הזכוכית. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן סאו פאולו מחקר (FAPESP-MFLS ' גרנט 2017/23933-3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296 (2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13 (2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300 (2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594 (2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165 (2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140 (2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025 (2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22 (2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108 (2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486 (2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022 (2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238 (2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144 (2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80 (2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266 (2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340 (2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279 (2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764 (2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842 (2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980 (2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554 (2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026 (2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 156 C57BL/6 עכברים תגובה לדלקת טפיל עומס התפתחות נגעים זיהום עורית האמסטיגוטים
ב Vivo זיהום עם <em>לישמניה מלכותית</em> כדי להעריך טפיל התקפה אלימה בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R.… More

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter