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Immunology and Infection

In Vivo infección con Leishmania amazonensis para evaluar la virulencia del parásito en ratones

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

Aquí, presentamos un protocolo compilado para evaluar la infección cutánea de ratones con Leishmania amazonensis. Este es un método confiable para estudiar la virulencia del parásito, permitiendo una visión sistémica de la respuesta del huésped vertebrado a la infección.

Abstract

Leishmania spp. son parásitos protozoarios que causan leishmaniasas, enfermedades que presentan un amplio espectro de manifestaciones clínicas desde lesiones cutáneas hasta lesiones viscerales. Actualmente, se estima que 12 millones de personas están infectadas con Leishmania en todo el mundo y más de 1.000 millones de personas viven a riesgo de infección. La leishmania amazonensis es endémica en América Central y del Sur y generalmente conduce a la forma cutánea de la enfermedad, que se puede visualizar directamente en un modelo animal. Por lo tanto, las cepas de L. amazonensis son buenos modelos para estudios de leishmaniasis cutánea porque también se cultivan fácilmente in vitro. Los ratones C57BL/6 imitan la progresión de la enfermedad impulsada por L. amazonensisobservada en humanos y son considerados uno de los mejores modelos de cepas de ratones para la leishmaniasis cutánea. En el huésped vertebrado, estos parásitos habitan macrófagos a pesar de los mecanismos de defensa de estas células. Varios estudios utilizan ensayos de infección por macrófagos in vitro para evaluar la infectividad del parásito en diferentes condiciones. Sin embargo, el enfoque in vitro se limita a un sistema celular aislado que no tiene en cuenta la respuesta del organismo. Aquí, compilamos un método de infección murino in vivo que proporciona una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito. El protocolo detallado para la infección in vivo de ratones C57BL/6 con L. amazonensis comprende la diferenciación de parásitos en amastígolos infecciosos, la inoculación cutánea de la almohadilla de ratones, el desarrollo de lesiones y la determinación de la carga del parásito. Proponemos este método bien establecido como el método más adecuado para los estudios fisiológicos de las respuestas inmunitarias y metabólicas del huésped a la leishmaniasis cutánea.

Introduction

Las leishmaniases son enfermedades infecciosas parasitarias prevalentes en todo el mundo que representan importantes desafíos en los países en desarrollo y son reconocidas como una de las enfermedades tropicales desatendidas más importantes por la Organización Mundial de la Salud1,2. Las leishmaniasas se caracterizan por manifestaciones cutáneas, mucosas y/o viscerales. La leishmaniasis cutánea suele ser causada por L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica y L. aethiopica3. Esta forma de la enfermedad es a menudo la autorreparación en los seres humanos debido a la inducción de la respuesta inmune celular protectora. Sin embargo, la respuesta inmune celular puede fallar, y la enfermedad puede progresar a leishmaniasis cutánea diseminada4,5. No hay vacuna disponible debido a la diversidad entre las especies de Leishmania y a los antecedentes genéticos del huésped6,7. Las opciones de tratamiento también son limitadas, ya que la mayoría de los medicamentos disponibles actualmente son caros, tóxicos y/o pueden requerir tratamiento a largo plazo8,9. Además, ha habido informes de resistencia a los medicamentos contra los tratamientos disponibles10,11.

El agente causal de las leishmaniases es el parásito protozoario Leishmania. El parásito presenta dos formas morfológicas distintas en su ciclo de vida: los promastigotes, la forma flagelada que se encuentra en las moscas de arena; y amastigotes, la forma intracelular que se encuentra en las vacuolas parasitopóforas de los macrófagos huésped de mamíferos12,13. La capacidad de Amastigotes para invadir, sobrevivir y replicarse a pesar de los mecanismos de defensa de los macrófagos del huésped vertebrado están sujetos a muchos estudios14,15,16,17. En consecuencia, varios grupos de investigación han estado describiendo ensayos de infección por macrófagos in vitro para evaluar el impacto de factores ambientales específicos, así como genes parásitos y de acogida en la infectividad del parásito. Este ensayo presenta varias ventajas, como la capacidad de adaptar los estudios a un formato de alto rendimiento, un período de tiempo relativamente más corto para obtener resultados y un número reducido de animales de laboratorio sacrificados18. Sin embargo, los resultados de los ensayos in vitro son limitados porque no siempre replican los estudios in vivo14,19,20,21. Los ensayos in vivo proporcionan una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito, que no puede ser completamente imitada por ensayos in vitro. Por ejemplo, los estudios inmunológicos se pueden realizar a través de ensayos inmunohistoquímicos de secciones de tejido de la almohadilla de pie recogidas o incluso de ganglios linfáticos popliteales para el análisis de las células inmunitarias recuperadas22.

Los animales se utilizan a menudo como modelo para las enfermedades humanas en la investigación biológica y biomédica para comprender mejor los mecanismos fisiológicos subyacentes de las enfermedades23. En el caso de la leishmaniasis, la ruta, el sitio o la dosis de inoculación influyen en el resultado de la enfermedad24,25,26,27. Además, la susceptibilidad y resistencia a la infección en humanos y ratones están altamente reguladas por los antecedentes genéticos del huésped y parásito4,5,22,28,29,30,31. Los ratones BALB/c son altamente susceptibles a la infección cutánea de L. amazonensis, mostrando una rápida progresión de la enfermedad con la diseminación de los parásitos a los ganglios linfáticos, el bazo y el hígado32. Como la enfermedad puede progresar a metástasis cutáneas, la infección puede ser mortal. Por el contrario, los ratones C57BL/6 a menudo desarrollan lesiones crónicas con cargas persistentes de parásitos en los ensayos de infección de L. amazonensis 33. Por lo tanto, la infección por L. amazonensis con esta especie de ratón en particular se ha considerado un excelente modelo para estudiar formas crónicas de leishmaniasis cutánea en humanos, ya que imita mejor la progresión de la enfermedad que la infección de ratones BALB/c modelo5,34.

Por lo tanto, proponemos que la infección murine in vivo es un método útil para los estudios fisiológicos de virulencia de Leishmania aplicables a la enfermedad humana, permitiendo una visión sistémica de la interacción huésped-parásito. Revisitando los ensayos bien establecidos22, presentamos aquí un protocolo paso a paso compilado de la infección in vivo de ratones C57BL/6 con L. amazonensis que comprende la diferenciación del parásito en amastigotes axensicos, inoculación cutánea de la almohadilla de ratones, desarrollo de lesiones y determinación de la carga del parásito. Este protocolo se puede adaptar a otras cepas de ratones y especies de Leishmania que causan leishmaniasis cutáneas. En conclusión, el método presentado aquí es crucial para identificar nuevas dianas y vacunasanti-Leishmania, así como en estudios fisiológicos de las respuestas inmunitarias y metabólicas del huésped a la infección por Leishmania.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Biociencia de la Universidad de Sao Paulo (CEUA 342/2019), y se llevaron a cabo de conformidad con las recomendaciones y políticas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Estado de Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) y el gobierno brasileño (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Todos los pasos descritos en las secciones 1-5 deben llevarse a cabo asépticamente dentro de armarios de flujo laminar. El equipo de protección personal debe utilizarse mientras se manipulan parásitos vivos de Leishmania.

1. In Vitro Diferenciación de L. amazonensis Promastigotes en Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

NOTA: En este ensayo se utilizó el parásito L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La). Dependiendo del propósito del estudio, la forma del parásito infeccioso se puede obtener ya sea mediante la purificación de la forma metacíclica utilizando un gradiente de densidad, como se describió anteriormente14,o por diferenciación de promastigotes en axensic amastigotes, de acuerdo con el siguiente protocolo.

  1. Cultivar La promastigotes en un matraz de cultivo de 25 cm2 células que contenga 10 ml de medio para promastigotes (pro-medio) (pH a 7,0).
  2. Incubar a 25oC durante 3 días.
    NOTA: Utilizar cultivos de promastigote que fueron pasados in vitro menos de 10veces para evitar la pérdida de virulencia y cambios aneuploidede de parásitos39,40,41,42,43,44.
  3. Pipetear 5 ml de cultivo de promastigote de fase de crecimiento logarítmico en un nuevo matraz de 25 cm2.
  4. Añadir 5 ml de medio para axenic amastigotes (ama-medium) (pH a 5,2).
  5. Incubar a 34oC durante 3-4 días.
  6. Divida el cultivo diluyendo con ama-medio en una proporción de 1:3 en un nuevo matraz de 25 cm2.
  7. Incubar a 34oC durante 3-5 días.
    NOTA: Incubar los axencinos avales durante un máximo de 5 días, ya que representa el final de la maduración37.

2. C57BL/6 Infección de la almohadilla con L. amazonensis

NOTA: Las hembras de ratones C57BL/6 (6-8 semanas de edad) fueron obtenidos y mantenidos en el Centro Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Sao Paulo. Los animales recibieron comida y agua ad libitum.

  1. Contar el cultivo de axenéticos anunciantes transfiriendo una alícuota de la suspensión del parásito diluida en PBS a una cámara Neubauer (es decir, hemocitómetro). Contar los parásitos no flagelados, que representan formas de amastigotes.
    NOTA: Alternativamente, el azul Trypan (1:1) se puede utilizar para contar el número de acomodatos viables (es decir, aquellos que no están manchados con el azul de Trippan).
  2. Diluir los axenic amastigotes en PBS de acuerdo con la dosis de inóculo deseada y se recomienda el número de inóculos previstos (1 x 106 axenic amastigotes en 50 l de PBS se recomienda).
  3. Cargue una jeringa de tuberculina con una aguja de 27 G con la suspensión del parásito preparada.
  4. Anestetizar un ratón C57BL/6 usando 3-5% isoflurano, según lo recomendado por johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Evalúe la profundidad anestésica probando la respuesta del ratón a un pellizco del dedo del dedo del dedo del ratón.
  5. Inocular 50 l de la suspensión homogeneizada del parásito (1 x 106 amastigotes axenicos o la dosis de inóculo deseada) en el tejido subplantar de la almohadilla trasera izquierda, utilizando la jeringa de tuberculina previamente cargada (paso 2.3).

3. Desarrollo de lesiones en el padel de ratón

  1. Mida la progresión de la lesión una vez a la semana midiendo el grosor de las almohadillas izquierda (infectadas) y derechas (no infectadas) utilizando una pinza.
  2. Calcule semanalmente la diferencia de grosor entre las almohadillas traseras izquierda y derecha para evaluar la progresión de la lesión.
  3. Trazar las diferencias calculadas en el eje Y y el tiempo de infección en el eje X y calcular la significancia estadística.
    NOTA: De acuerdo con las recomendaciones de los Comités de Cuidado y Uso de Animales, los animales deben ser sacrificados antes de que la lesión infectada se ulcere, ya que las úlceras cutáneas pueden conducir a una infección secundaria. Como se muestra en la Figura Suplementaria 1, las lesiones tardan aproximadamente 10 semanas en presentar signos de ulceración con la dosis del parásito (106 axensic amastigotes) y la cepa huésped (C57BL/6) utilizada en este protocolo. Los ratones deben sacrificarse para la extracción de lesiones antes de que se observen los signos de ulceración.

4. Extracción de lesiones del reposapiés de ratones y dilución limitante del parásito

  1. Preparar una placa de 96 pocillos (parte inferior plana) para el ensayo de dilución limitante46,47 añadiendo 180 s de pro-medio a todos los pozos.
    NOTA: Utilice cuatro carriles de placas (la mitad de la placa) para cada animal, representando ensayos cuadrúpedos (es decir, animales 1 carriles A-D; animal 2 carriles E-H).
  2. Añadir 1 ml de pro-medio en un tubo molinillo de tejido de vidrio por lesión y pesar el tubo.
    NOTA: El tubo debe mantenerse estéril, así que utilice una tapa estéril y pese el tubo con la tapa cerrada, si pesa fuera del armario de flujo laminar.
  3. Sacrificar al animal en una cámara de CO2, siguiendo las recomendaciones de los Comités de Cuidado y Uso de Animales. Desinfectar el animal mediante la pulverización con 70% de etanol.
  4. Retusie el pie del animal en los talones para extraer la almohadilla infectada y rociar 70% etanol en la almohadilla para la desinfección. Asegurar la esterilización de tijeras y fórceps manteniéndolas empapadas en 70% de etanol.
  5. Coloque la almohadilla infectada en un plato estéril de Petri y diseccione con fórceps estériles y un bisturí para recoger todos los tejidos blandos. Descarta los huesos.
    NOTA: Se recomienda la uniformidad en el paso de disección para evitar la recuperación sesgada del tejido.
  6. Transfiera los tejidos recogidos al tubo molinillo de tejido de vidrio con pro-medio, luego pese el tubo de nuevo para determinar el peso de la lesión.
    NOTA: Evite colocar los fórceps y el bisturí directamente en el medio, ya que se pueden eliminar pequeños volúmenes, lo que resulta en un peso tisular subestimado. El peso de la lesión se calcula restando el peso del tubo que contiene pro-medio con el tejido recogido del peso del tubo que contiene sólo pro-medio.
  7. Homogeneizar el tejido 10veces utilizando la amoladora para una interrupción completa del tejido.
  8. Dejar sedimentar la mezcla durante 10 min, luego recoger 20 sl del sobrenadante.
  9. Cargue 20 l del sobrenadante en la1a columna del1er carril de la placa de 96 pozos preparada en el paso 4.1. Repita esto para que los siguientes tres carriles tengan cuadrúlicados para cada animal (es decir, para el animal 1 añadir 20 l a cada pocto y etiquetar A1, B1, C1 y D1).
  10. Homogeneizar cada pocal en la1a columna 10x utilizando una pipeta multicanal. A continuación, transfiera 20 l de las muestras diluidas de la1a columna a la2a columna.
    NOTA: Es importante homogeneizar cada pozo 10 veces de una columna a la siguiente.
  11. Repita el paso 4.10 a todas las columnasrestantes hasta la última columna (12th ) y deseche los 20 oL final de la muestra diluida.
    NOTA: Cambie las puntas después de cada dilución para evitar la contaminación cruzada.
  12. Sellar las placas con una película e incubar a 25oC durante 7 días en una cámara húmeda.

5. Determinación de la carga del parásito de la lesión

  1. Analizar las placas después de 7 días de incubación utilizando un microscopio invertido para determinar el último pozo que contiene parásitos para cada carril.
    NOTA: También es posible tener una indicación del crecimiento de los parásitos, o densidad celular, mediante el análisis visual de los cambios de color y la turbidez del medio.
  2. Calcule la carga de tejido del parásito para cada carril dividiendo el factor de dilución por peso de lesión.
    NOTA: En un carril específico, si los parásitos están presentes sólo en las columnas 1-5 (es decir, los pozos A1-A5 son positivos para el crecimiento del parásito), esto significa que la columna 5 contenía sólo 1 parásito, la columna 4 contenía 10 parásitos, y así sucesivamente, en múltiplos de diez. La columna 1 contendría 104 parásitos, que representa el número de parásitos en los 20 oL iniciales de sobrenadante (la muestra no diluida en el paso 4.7). Debido a que este 20 l se diluyó con 180 ol de pro-medio, el tubo inicial contenía 5 x 105 parásitos: (1 x 104) / (0,02 ml) a 5 x 105 parásitos/1 ml. A continuación, la carga del parásito en esa lesión se puede calcular dividiendo la concentración inicial del parásito por el peso de la lesión: (5 x 105) / peso de la lesión (ver paso 4.6).
  3. Trazar el promedio del resultado cuadrúpedo para cada animal con una escala Y de tronco.

6. Análisis estadístico

  1. Representar los datos como promedio - desviación estándar utilizando al menos cinco animales por grupo experimental como réplicas.
  2. Realice análisis estadísticos utilizando una prueba de dos colas no emparejada, considerando un valor p < 0.05 como significativo.

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Representative Results

Los parásitos protozoos de leishmania existen en dos formas de desarrollo durante su ciclo de vida en huéspedes de invertebrados y vertebrados: promastigotes, las formas proliferativas que se encuentran en el lumen de la mosca de la arena femenina; y amastigotes, las formas proliferativas que se encuentran en las vacuolas parasitopóforas de las células huésped de los mamíferos. Los promastigotes tienen un cuerpo alargado de aproximadamente 1,5 m de ancho y 20 m de largo, con un flagelo que normalmente emerge de la extremidad anterior. Los acomodatos tienen un cuerpo redondeado u ovoide que oscila entre 2-6 m de longitud y 1,5-3 m de ancho, y poseen un flagelo inaparente12,13 (Figura 1A). Durante la comida de sangre, el huésped invertebrado, un insecto hematófago de la familia Psychodidae, adquiere macrófagos infectados con leishmania amastigotes. Una vez que estas células alcanzan el tubo digestivo de la mosca de la arena, los amastigotes se liberan y diferencian a los promastigotes procyclic(Figura 1A). Estas formas no son infecciosas y se multiplican intensivamente por división binaria y colonizan el tubo digestivo del vector de insectos. Las formas procíclicas se diferencian entonces a formas metacíclicas, una forma infecciosa y de movimiento rápido, presentando un cuerpo más delgado y un flagelo alargado(Figura 1A). Las formas metacíclicas invaden las porciones anteriores del esófago y el provenrículo de la luciérnaga, de modo que durante su próxima comida de sangre, la regurgitación asegura la inoculación de estas formas infectantes en un nuevo huésped vertebrado. En el tegument del huésped vertebrado, los parásitos son fagocitos por los macrófagos y diferencian en acomodatos dentro de las vacuolas parasitopcóforas, donde los acomodatos se multiplican por división binaria y completan el ciclo de vida de Leishmania12,13.

Las condiciones axenéticas pueden simular diferentes entornos de acogida in vitro, manteniendo la morfología y viabilidad del parásito. Las condiciones axenicas para amastigotes fueron descritas previamente simulando el ambiente de vacuolo parasitóforo de un macrófago y desencadenando la diferenciación in vitro de promastigote en la forma de amastigote37. Estas condiciones imitan el ambiente ácido (pH a 5,5) y el aumento de la temperatura de los huéspedes vertebrados (34 oC). La Figura 1B ilustra los promastigotes diferenciados a acomodatos cambiando estas condiciones en el cultivo. La viabilidad de estos axensic amastigotes puede ser analizada por la tinción azul Trypan, un método basado en el principio de que las células vivas poseen membranas intactas que excluyen ciertos tintes, mientras que las células muertas no48. Alternativamente, analizamos la viabilidad de los axensicos amastigotes verificando su capacidad de transformarse de nuevo a promastigotes cuando se transfieren a pH neutro e incubados a 25 oC(Figura 1B).

Aquí proponemos un método de infección in vivo para evaluar la virulencia de diferentes cepas de Leishmania. La Figura 2A representa un ensayo de infección in vivo que muestra el desarrollo de lesiones cutáneas de almohadillas de ratones C57BL/6 que fueron infectadas con el tipo salvaje (La-WT) y Leishmania Iron Regulator 1 knockout (La-LIR1-/-) L. metacíclicos purificados de Amazonensis. LIR1 regula los niveles de hierro intracelular en Leishmania mediando la exportación de hierro y evitando su acumulación intracelular a niveles tóxicos14. Observando la progresión de las diferencias de espesor de las almohadillas infectadas frente a las no infectadas, pudimos demostrar que los ratones infectados La-LIR1-/- presentaron lesiones más pequeñas que los ratones infectados La-WT(Figura 2A). Esos hallazgos revelaron que LIR1 es esencial para L. amazonensis in vivo virulencia. Esto demuestra la importancia y eficacia de este método para evaluar las diferencias de las enfermedades cutáneas impulsadas por Leishmania. La Figura 2B ilustra las almohadillas no infectadas (derecha) e infectadas (izquierda) y el desarrollo de lesiones 73 días después de la infección, mostrando las diferencias en la progresión de la hinchazón y la lesión de los ratones infectados la la-WT y La-LIR1-/- .

La progresión de la infección por Leishmania consiste no sólo en el desarrollo de la lesión, que representa la respuesta inflamatoria, sino también la replicación intracelular del parásito. Para evaluar la replicación del parásito, la carga del parásito de las lesiones se determinó extrayendo la lesión infectada, seguida de un ensayo de dilución limitante en una placa de 96 pocillos(Figura 3A). La Figura 3B muestra el análisis de la carga del parásito de las lesiones de la almohadilla de pie de ratones infectados La-WT y La-LIR1-/- después de 73 días de infección. A partir del ensayo limitante de dilución, detectamos 106veces menos parásitos en la lesión de los ratones infectados La-LIR1-/- en comparación con La-WT, revelando que la ausencia de LIR1 impide la replicación intracelular de los amastigotes14.

Una de las ventajas de evaluar tanto el desarrollo de lesiones como la carga del parásito es detectar posibles diferencias de replicación intracelular del parásito y la respuesta inflamatoria del huésped. Observamos diferencias entre estos dos fenotipos utilizando el LIR1 de adición (La-LIR1AB), que es el La-LIR1-/- con el LIR1 ORF integrado de nuevo en el locus ribosomal14. Cuando se inyectó La-LIR1AB en la almohadilla de ratón, observamos lesiones de tamaño intermedio en comparación con las infecciones de La-LIR1-/- y La-WT, pero un notable rescate de carga de parásito completo del fenotipo La-WT (Figura Suplementaria 2). Estos resultados indican que los parásitos La-LIR1AB fueron capaces de replicarcomo parásitos La-WTen una infección in vivo a largo plazo. Sin embargo, la respuesta inflamatoria del ratón no fue tan exacerbada como las infecciones de La-WTporque las lesiones fueron significativamente más pequeñas.

De este caso, se demostró que el método descrito aquí era esencial para la identificación y caracterización de un factor de virulencia de L. amazonensis necesario para la replicación intracelular exitosa de amastigote y el desarrollo de lesiones cutáneas en los huéspedes de mamíferos.

Figure 1
Figura 1: Morfología de L. amazonensis promastigotes y amastigotes. (A) Ilustraciones de las diferentes formas morfológicas de Leishmania:promastigote procycíclico, promastigote metacíclico y amastigote. Barra de escala de 2 m. (B) Imágenes de cultivos in vitro de L. amazonensis. Diferenciación in vitro de promastigotes en axenic amastigotes, y de axenic amastigotes de nuevo a promastigotes cambiando las condiciones de pH y temperatura, como se describe en el protocolo paso a paso. Las fotos fueron tomadas con un microscopio invertido. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: LIR1 knockout reduce notablemente L. amazonensis in vivo desarrollo de lesiones. Los ratones C57BL/6 fueron inoculados en la almohadilla trasera izquierda con 106 metacíclicos purificados de tipo l. amazonensis wild (La-WT) y L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-). (A) Progresión de la lesión cutánea de La-WT y La-LIR1-/- ratones infectados analizados semanalmente. Los datos representan el promedio de SEM de la almohadilla de pie infectada restado por el espesor de la almohadilla no infectada de cinco ratones diferentes en cada grupo (adaptado de Laranjeira-Silva et al.14). (B) Imágenes de las almohadillas no infectadas e infectadas de La-WT y La-LIR1-/- ratones infectados que muestran las diferencias en la hinchazón 73 días después de la infección (adaptado de Laranjeira-Silva et al.14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: LIR1 knockout reduce notablemente L. amazonensis in vivo replicación intracelular. (A) Una ilustración de una placa de 96 pozos que representa las diluciones seriales 10x de los tejidos recuperados de la almohadilla de pie infectados con L. amazonensis tipo salvaje (La-WT) y LIR1 knockout (La-LIR1-/-). Las filas A-D representan el cuadruplicado de las diluciones en serie de la muestra de lesión de la almohadilla de pie La-WT. Las filas E-H representan el cuadruplicado de las diluciones en serie de la muestra de lesión La-LIR1-/--footpad. Los diferentes tonos de gris representan las densidades de celda observadas por pozo (es decir, el color más claro significa menos parásitos). Los pozos marcados en rojo representan los últimos pozos que contenían parásitos por réplica. (B) Carga de parásitos en tejidos recuperados de ratones C57BL/6 infectados con 106 metacíclicos purificados de tipo salvaje L. amazonensis (La-WT) y L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-) determinado 73 días después de la infección. Los datos representan el promedio de la carga del parásito por mg de tejido de cinco ratones diferentes en cada grupo (adaptado de Laranjeira-Silva et al.14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 1
Figura suplementaria 1: Úlcera cutánea como indicativa de una infección secundaria. Imágenes representativas de las almohadillas de ratones C57BL/6 infectadas con L. amazonensis tipo salvaje (La-WT) tomadas 80 días después de la infección. Las flechas rojas apuntan a signos de ulceración, lo que indica que el experimento debe terminarse. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 2
Figura suplementaria 2: El papel de LIR1 en el desarrollo de lesiones in vivo y la replicación intracelular de parásitos. Los ratones C57BL/6 fueron inoculados en la almohadilla trasera izquierda con 106 metacíclicos purificados de tipo l. amazonensis wild (La-WT), L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-), y L. amazonensis LIR1 add-back (La-LIR1AB). (A) Progresión de la lesión cutánea de la(WT), La-LIR1-/-y los ratones infectados con La-LIR1AB analizados semanalmente. Los datos representan el promedio de SEM de la almohadilla de pie infectada restado por el espesor de la almohadilla no infectada de cinco ratones diferentes en cada grupo (adaptado de Laranjeira-Silva et al.14). (B) La carga del parásito en los tejidos recuperados de la almohadilla de pie de la(WT), La-LIR1-/-o la-LIR1AB en ratones infectados de7 días después de la infección. Los datos representan el promedio de la carga del parásito por mg de tejido de cinco ratones diferentes en cada grupo (adaptado de Laranjeira-Silva et al.14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El ensayo de infección in vivo descrito en este protocolo permite a cualquier investigador evaluar la leishmaniasis cutánea in vivo teniendo en cuenta la interacción huésped-parásito en un escenario sistémico. Estos ensayos han sido utilizados por muchos grupos22,24,27,29,31,32,34,49 y aquí compilamos un protocolo paso a paso para estandarizar este método teniendo en cuenta las limitaciones de infraestructura que algunos grupos pueden tener. Este protocolo también se puede utilizar para evaluar la virulencia de los parásitos transgénicos de Leishmania mediante la bioimagen in vivo50,51,52. Como cualquier otro procedimiento experimental, este ensayo tiene limitaciones y pasos críticos para ejecutar, como requerir personal capacitado que se sienta cómodo trabajando con ratones y que tenga experiencia en la realización de inyecciones subplantares para evitar infecciones accidentales. La estandarización de protocolos es extremadamente importante para evitar resultados sesgados y para producir resultados comparables entre diferentes grupos de investigación.

La principal ventaja de utilizar L. amazonensis como modelo de leishmaniases cutáneas es porque la lesión de la almohadilla causada por esta especie se puede evaluar fácilmente en ratones. La hinchazón de la almohadilla de pie determinada por el método descrito aquí representa la suma de dos fenotipos de infección: respuesta inflamatoria del huésped y replicación del parásito. Ambos fenotipos se pueden evaluar por separado asociando el método de carga de tejido parásito que refleja la replicación intracelular del parásito con la determinación de la progresión del espesor de la lesión. Otra ventaja es que L. amazonensis' promastigotes se cultivan fácilmente in vitro. Teniendo en cuenta estos, cualquier grupo de investigación puede manipular esta especie de Leishmania de acuerdo a sus necesidades. Los hallazgos de los estudios de L. amazonensispueden compararse con otras especies de Leishmania para determinar si una vía específica se conserva evolutivamente o divergente21,53,54.

En el ciclo natural, la transmisión de Leishmania al huésped vertebrado ocurre por la picadura de una mosca de arena infectada durante la comida de sangre. La mosca de la arena generalmente inocula unos pocos cientos de formas metacíclicas de promastigote de Leishmania en la saliva del insecto. En infecciones experimentales in vivo, el sitio más frecuente de la inoculación es la plataforma22del animal. Inyección intradérmica en el oído o inyección intraperitoneal son sitios alternativos de inoculación dependiendo de la finalidad del estudio porque cada sitio presenta diferentes tipos de células fagocíticas24,56. Por lo tanto, algunos grupos de investigación utilizan moscas de arena infectadas por laboratorio para infectar la dermis del oído del animal para imitar la transmisión natural56,57,58,59. Sin embargo, este protocolo presenta algunas restricciones, como el mantenimiento de colonias de mosca de arena, que requiere instalaciones no disponibles para la mayoría de los grupos de investigación.

El trabajo original que describe in vivo C57BL/6 infección con La-LIR1-/- ha utilizado metacíclicos purificados formularios14. Sin embargo, la manipulación genética de Leishmania puede perjudicar la diferenciación de los promastigotes en amastígolos axenicos14 o en formas infecciosas metacíclicas20. Por lo tanto, dependiendo de la cepa de Leishmania, el investigador debe determinar el método más adecuado para obtener formas de parásitos infecciosos viables para su estudio. El protocolo de axensic amastigotes diferenciados de los cultivos de promastigote descritos aquí puede ser una alternativa más fácil, produciendo resultados comparables en muchos casos19,20,35,37,38,64. Este enfoque evita el uso de otros métodos que normalmente dan lugar a menores rendimientos de parásitos infecciosos, como la incubación de promastigotes con anticuerpos específicos pero no ampliamente disponibles65 para la purificación metacíclica promastigotes, o por gradiente de densidad dependiente de la expresión18,66de GLP de metacíclicos. La eficiencia del protocolo de diferenciación se puede evaluar determinando los niveles de expresión de los genes de la familia de la amastina64,67. Las mastinas son miembros de una familia de genes conservados que se modulan diferencialmente durante el ciclo de vida de Leishmania 68 y están asociados con la virulencia del parásito y la patogénesis67,69,70. Otros marcadores también se pueden utilizar para distinguir amastigote de las formas de promastigote. Por ejemplo, gp63 está regulado en amastigotes, porque su función es proteger a los promastigotes de las enzimas digestivas del insecto71.

La elección de la tensión del ratón es otro paso crítico a tener en cuenta al desarrollar un protocolo estandarizado de infección in vivo. La susceptibilidad y resistencia a la infección por Leishmania en ratones están reguladas principalmente por antecedentes genéticos29,30,55. En este protocolo, la cepa C57BL/6 fue elegida porque su respuesta inmune a L. amazonensis está estrechamente relacionada con la respuesta mixta Th1-Th2 en humanos72,73. Se ha descrito que las infecciones murinas experimentales con L. amazonensis causan lesiones moderadas en ratones C57BL/6 en comparación con otras cepas de ratones28,34,74. Sin embargo, dependiendo de la cepa del parásito, las diferencias en el tamaño de la lesión sólo son detectables en cepas de ratones susceptibles, como BALB/c36. El curso de tiempo de la infección también debe ser considerado y se correlaciona con la cepa de ratoneselegido29,26,60,61,62,63,75. Las almohadillas ulceradas siempre deben evitarse, ya que pueden representar infecciones secundarias y a menudo se observan en largos períodos de infección, especialmente en experimentos con cepas de ratones susceptibles. Designar la hora del día para iniciar la infección es otro paso a tener en cuenta. Como se demostró en estudios anteriores con L. amazonensis, la hora del día del parásito inóculo afecta el desarrollo de lesiones porque la interacción huésped-parásito se ve afectada de manera circadiana por la melatonina liberada en pineal durante la época oscura del día75.

La principal desventaja del método de infección in vivo es que el experimento requiere el uso de un número sustancial de animales de laboratorio y tarda más tiempo en obtener resultados finales en comparación con el método de infección in vitro18. Sin embargo, este último aspecto también puede considerarse como una ventaja ya que los resultados in vivo reflejan el curso de tiempo natural de la progresión de la enfermedad con mayor precisión que los resultados obtenidos de la infección in vitro. Más importante aún, los hallazgos de la infección de L. amazonensis in vivo no sólo pueden reflejar los cambios transitorios en la virulencia del parásito, sino que también reconoce el estado sistémico del anfitrión y todos sus jugadores. Por lo tanto, teniendo en cuenta los diversos factores mencionados anteriormente, el método descrito en este protocolo se puede adaptar para satisfacer necesidades experimentales específicas para la caracterización de otros objetivos y tratamientos relacionados con la virulencia permitiendo nuevos conocimientos para el control de la leishmaniasis cutánea.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a la Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Cámara del Centro Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Sao Paulo por el apoyo y a la Dra. Silvia Reni Uliana por proporcionar la trituradora de tejido de vidrio. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación Sao Paulo (FAPESP - Beca MFLS' 2017/23933-3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

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In Vivo infección con <em>Leishmania amazonensis</em> para evaluar la virulencia del parásito en ratones
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