Summary
Ce protocole démontre l’enregistrement en temps réel des relations dose-réponse complètes pour l’activation du GPCR induite par agoniste à partir d’une seule couche cellulaire cultivée sur un seul microélectrode à l’aide de mesures d’impédance sans étiquette. Le nouveau schéma de dosage augmente considérablement le débit sans perte de résolution de temps.
Abstract
Les essais sans étiquette basés sur l’impédance sont de plus en plus utilisés pour étudier non invasivement l’activation du GPCR induite par ligand dans les expériences de culture cellulaire. L’approche fournit une surveillance cellulaire en temps réel avec une résolution de temps dépendante de l’appareil jusqu’à plusieurs dizaines de millisecondes et il est hautement automatisé. Toutefois, lorsque le nombre d’échantillons est élevé (p. ex., des études de dose-réponse pour divers ligands différents), le coût des tableaux d’électrodes jetables ainsi que la résolution de temps disponible pour les enregistrements séquentiels de puits par puits peuvent devenir limitatifs. Par conséquent, nous présentons ici un protocole d’addition agoniste en série qui a le potentiel d’augmenter considérablement la production d’essais GPCR sans étiquette. À l’aide du protocole d’addition d’agoniste en série, un agoniste du GPCR est ajouté de façon séquentielle en augmentant les concentrations à une seule couche cellulaire tout en surveillant continuellement l’impédance de l’échantillon (mode agoniste). Avec cette approche sérielle, il est maintenant possible d’établir une courbe dose-réponse complète pour un agoniste GPCR à partir d’une seule couche cellulaire. Le protocole d’addition agoniste en série s’applique à différents types de couplage GPCR, Gq Gi/0 ou Gs et il est compatible avec les niveaux d’expression recombinants et endogènes du récepteur à l’étude. Le blocage des récepteurs par les antagonistes du GPCR est également évaluable (mode antagoniste).
Introduction
Ce rapport présente une description détaillée d’un protocole d’addition en série développé pour la quantification de l’activation du récepteur couplé de protéine G induite par ligand (GPCR) dans les cellules cultivées adhérente par des mesures d’impédance sans étiquette. Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont impliqués dans une multitude de fonctions physiologiques et de maladies humaines1. Pour cette raison et leur bonne accessibilité à la surface des cellules, les GPCR sont l’une des cibles les plus importantes en matière de médicaments. Cette évaluation se reflète dans un nombre estimatif de 700 médicaments approuvés ciblant les GPCR, ce qui équivaut à une part de 35 % sur tous les médicaments commercialisés2.
Le développement de nouveaux médicaments comprend deux processus centraux : (i) l’identification et la caractérisation fonctionnelle des molécules cibles biologiques, et (ii) la découverte de nouvelles substances de plomb et leur développement dans les médicaments administrables. Dans les deux processus, des méthodes efficaces sont nécessaires pour évaluer quantitativement les interactions médicament-cible et la réponse biologique en aval subséquente. Différentes étapes du processus de développement préclinique de médicaments font usage de différentes méthodes d’analyse allant des études d’interaction biomoléculaire entre le médicament et la cible, sur les études fonctionnelles sur les cellules en culture, aux expériences sur le matériel d’organe excisé ou des animaux entiers. Les deux, la signification physiologique et la complexité biologique augmentent de la première à la seconde3. Bien que l’objectif global soit de minimiser les expériences sur les animaux, les études pharmacologiques utilisant des organes isolés d’animaux de laboratoire ou même d’animaux entiers sont considérées comme inévitables pour caractériser de façon exhaustive les nouveaux médicaments candidats. En termes de lecture analytique, les études pharmacologiques d’organe fournissent une réponse fonctionnelle « holistique » distale et intégrative de la plus haute pertinence physiologique. Un inconvénient de ces expériences est qu’elles ne sont pas compatibles avec le dépistage à haut débit pour des raisons techniques et éthiques et ont été largement remplacées par des études basées sur la culture cellulaire in vitro4.
Les méthodes pour quantifier l’activation du GPCR dans les cultures cellulaires comprennent différentes analyses chimiques à base d’étiquettes, qui détectent spécifiquement les deuxièmes messagers, l’état de phosphorylation des protéines de signalisation en aval, l’activation transcriptionnelle par l’intermédiaire de certains facteurs de transcription ou le trafic de récepteurs intracellulaires induits par ligand4,5. Un inconvénient de ces essais basés sur l’étiquette est la nécessité d’étiqueter les cellules avec des colorants potentiellement nocifs ou des marqueurs radioactifs. Cela nécessite souvent l’exécution de l’évaluation comme un point de terminaison-détermination pour un temps d’exposition qui doit être spécifié a priori. L’utilisation d’analyses de points de terminaison basées sur l’étiquette souffre de ce moment très limité et biaisé de l’expérience et du risque que les étiquettes chimiques et les sondes interfèrent avec la physiologie cellulaire régulière, potentiellement inaperçue par l’expérimentateur.
Ces dernières années, des essais sans étiquette pour la surveillance de l’activation du GPCR ont vu le jour, comme des techniques basées sur l’impédance ou des méthodes optiques appliquant des grilles de guides d’ondes résonnantes5,6. L’étiquetage des cellules n’est pas expérimentalement requis avec ces approches. Comme ces réadmissions physiques fonctionnent sur des signaux de faible amplitude, ces méthodes sont considérées comme non invasives, elles permettent une surveillance cellulaire continue potentiellement en temps réel et le temps d’observation n’est limité que par la culture cellulaire et non par la lecture. Semblable aux écoutes d’organes entiers, les approches sans étiquette font généralement état des réponses cellulaires holistiques, loin en aval de l’activation des récepteurs lorsque l’intégration sur l’ensemble du réseau de signalisation entraîne des changements dépendants du temps, mais plutôt non spécifiques dans la morphologie cellulaire ou la redistribution de masse. Considérant que les essais basés sur l’impédance mesurent la signature diélectrique des changements dans la forme des cellules7,8, les mesures utilisant des grilles de guide d’onde résonnantes sont sensibles aux changements de l’indice de réfraction à l’interface cellule-substrat résultant de la redistribution dynamique de masse (DMR)9. Le caractère intégrateur rend les méthodes sans étiquette extrêmement sensibles aux événements médiés par les récepteurs, quel que soit le type de protéine G (Gq, Gi/0, Gs, G12/13) ou l’arrêt de la signalisation6 et bien adapté aux niveaux d’expression endogènes du récepteur.
Dans un jeu d’exemple standard sans étiquette, les cellules sont cultivées de façon adhérente dans des plaques multi-puits avec des électrodes de film d’or coplanaires déposées au fond de chaque puits10. Ces réseaux d’électrodes sont reliés à un analyseur d’impédance et les réponses cellulaires à un stimulus expérimental sont enregistrées à partir de puits individuels par des lectures d’impédance résolues dans le temps. Dans un exemple typique de GPCR, un ligand est ajouté en concentrations différentes individuellement à chaque puits individuel. Les changements induits par ligand dans le cours de temps d’impédance sont ensuite analysés en ce qui concerne les caractéristiques de la courbe telles que le changement de signal maximal, la zone sous la courbe, le changement de signal dans un intervalle de temps donné ou la pente de la courbe à un point de temps spécifié, afin de quantifier la puissance et l’efficacité du ligand11.
Le coût des réseaux d’électrodes peut limiter l’application de cette technique dans les campagnes de dépistage à haut débit (HTS). En outre, avec un nombre croissant d’échantillons à suivre en parallèle, le nombre de mesures individuelles augmente et réduit ainsi la résolution de temps disponible pour chaque puits progressivement - même pour l’état de l’art des enregistrements multicanaux. Dans de telles conditions, des réponses cellulaires rapides et transitoires peuvent échapper à la mesure. De plus, l’approche conventionnelle , une approche de concentration, impose un facteur de temps et de coût important aux développements perfusés d’organes sur puce ou de corps sur puce en ce qui concerne leur pertinence dans l’analyse de l’interaction ligand-GPCR.
Pour cette raison, nous avons développé un protocole de dosage progressive qui permet l’enregistrement des courbes pleine dose-réponse de l’activation du GPCR induite par ligand dans les monocouches de cellules cultivées en surveillant continuellement l’impédance d’un seul puits tandis que la concentration agoniste est augmentée pas à pas. Le protocole d’addition agoniste en série augmente de manière significative le débit par puits d’une concentration à 10 ou plus, comme indiqué sur l’exemple actuel des cellules humaines U-373 MG, qui expriment endogènement le récepteur de l’histamine 1 (H1R). Ainsi, la méthode a le potentiel d’améliorer considérablement le débit dans les études de dose-réponse sans étiquette, tandis que la résolution de temps est conservée au maximum instrumental.
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Protocol
1. Ensemencement cellulaire sur des réseaux d’électrodes
REMARQUE : La sélection de la disposition des électrodes est un compromis entre la sensibilité et le nombre de cellules à l’étude. Plus l’électrode est petite, plus la mesure est sensible, mais plus le nombre de cellules à l’étude est faible. Pour les cellules présentant de fortes fluctuations d’impédance au fil du temps dans des conditions de référence, des électrodes plus grosses ou internumérisées sont préférables.
- Préchauffez toutes les solutions nécessaires pour la passage et l’ensemencement cellulaires standard dans un bain d’eau de 37 oC. Pour les essais avec des cellules humaines U-373 MG, il faut: phosphate tamponné saline (PBS) sans calcium et magnésium, 0,05% (w/ v) trypsine, milieu de culture cellulaire (Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) complété par 5% (v/v) sérum fœtal du veau (FCS), 2 mM L-glutamine et 100 'g/mLici penllin/strepmytocin).
- Rincer la couche cellulaire de la culture des stocks cultivée sur le fond des flacons conventionnels de culture cellulaire ou des plats avec PBS deux fois.
- Retirez le PBS, ajoutez la solution de trypsine (1 ml pour 25 cm2) et laissez les cellules incuber à 37 oC pendant 5 min (s’applique aux cellules U-373 MG).
- Contrôle du détachement complet des cellules du fond du substrat de croissance par microscopie.
- Arrêter la réaction de trypsine dès que les cellules sont complètement détachées en ajoutant 9 ml de milieu de culture cellulaire par 1 ml de trypsine à la suspension cellulaire. Rincer soigneusement les cellules restantes du fond du substrat de culture cellulaire en canalisant la suspension sur le substrat.
- Ramassez la suspension cellulaire à l’eau avec une pipette et transférez-la dans un tube de centrifugation (15 ml ou tube de 50 ml).
- Faire tourner les cellules par centrifugation à 110 x g pendant 10 min à température ambiante.
- Retirez soigneusement le supernatant et rsuspendez complètement la pastille cellulaire dans le milieu de culture avant de compter les cellules (p. ex. en utilisant un hémacytomètre pour les microscopes à contraste de phase et le comptage manuel).
- Ajustez la suspension cellulaire à la densité cellulaire désirée. Pour les expériences avec les cellules U-373 MG, utilisez 100 000 cellules/cm2 pour faire pousser une couche cellulaire confluente dans un rayon de 48 h. Cela se traduit par une densité cellulaire de 200 000 cellules/mL pour des réseaux d’électrodes de 8 puits avec une zone de croissance de 0,8 cm2 et un volume de puits de 400 l.
REMARQUE : Pour les expériences d’activation reproductibles du GPCR, les cellules doivent être cultivées pour confluent les monocouches sur les réseaux d’électrodes. Pour assurer une bonne expression des récepteurs à la surface de la cellule, les cellules doivent être ensemencées au moins 36 h avant d’effectuer l’expérience. L’essai de différentes densités cellulaires pour l’ensemencement cellulaire est souvent significatif pour identifier les meilleures conditions expérimentales. - Ajouter la suspension cellulaire aux puits du réseau d’électrodes et laisser les vends s’installer à température ambiante pendant 10 à 15 min afin d’assurer une distribution homogène des cellules au fond des puits.
- Cultivez des cellules pendant au moins 36 h dans un incubateur standard de culture cellulaire avec 5 % de CO2 (dépendant de type moyen) à 37 oC et atmosphère humidifiée. Changer la culture cellulaire moyenne 24 h avant l’expérience.
- Le jour de l’expérience, inspectez les couches cellulaires des réseaux d’électrodes par microscopie (contraste de phase) afin d’assurer une couverture complète des électrodes avec des cellules.
2. Équilibre des cellules dans le milieu sans sérum
- Médium pré-chaud sans sérum, dans cette étude : le milieu L15 de Leibovitz.
- Retirez le milieu de culture cellulaire des cellules cultivées sur des réseaux d’électrodes et remplacez-les par un milieu sans sérum préréchauffé. Utilisez 200 l pour les tableaux d’électrodes au format 8 puits, et 150 l pour les réseaux d’électrodes de 96 puits.
- Laisser les cellules équilibrer dans un milieu sans sérum à 37 oC pendant au moins 2 h. Le temps d’équilibre dépend fortement du type de cellule. Par exemple, les cellules U-373 MG ont besoin de 2 h, les cellules CHO ont besoin de 4 h, baeC peut nécessiter un équilibre de nuit dans le milieu L-15.
REMARQUE : Le milieu L-15 est indépendant du CO2 et nécessite une atmosphère sans CO2. Pour l’équilibre en L-15 a mis l’incubateur à 0 % CO2. L’équilibre peut être surveillé par des lectures d’impédance, ce que nous recommandons de faire pour les premières expériences.
3. Suivi de l’équilibre cellulaire avec des lectures d’impédance
- Placez le tableau d’électrode dans le porte-réseau de connexion de l’analyseur d’impédance.
- Assurer un contact d’entrave faible approprié entre les électrodes et l’analyseur d’impédance. Ce contrôle est individuellement différent pour différents instruments.
REMARQUE : Si l’instrument ne parvient pas à faire la connexion aux électrodes, ouvrez à nouveau la pince de contact, réajustez le tableau d’électrode pour un positionnement approprié à l’intérieur du support et réessayez. - Sélectionnez le type d’électrode et/ou le format multi-puits à partir de l’interface utilisateur du logiciel.
- Configurez les paramètres de mesure. Différentes options sont disponibles.
REMARQUE : Pour sélectionner la fréquence aC la plus sensible, nous nous référons à la littérature et aux manuels d’instruments car cela dépend de la disposition des électrodes et du type de cellule à l’étude. Typiquement, la fréquence de détection est de l’ordre de 4 kHz - 50 kHz. Ici, les cellules U-373 MG ont été cultivées sur des électrodes de travail circulaires de 250 m de diamètre et elles ont été surveillées à une fréquence AC de 12 kHz.- Si des modes d’acquisition de données à fréquence unique et multiple sont disponibles, sélectionnez le mode de fréquence unique pour assurer une résolution maximale du temps. La mesure sera effectuée à cette fréquence unique. Pour les instruments les plus largement répandus, il existe un certain nombre de fréquences pré-fixées le long de la fenêtre de fréquence disponible.
- Si le nombre de puits à l’étude est faible ou si la résolution temporelle n’est pas critique, sélectionnez plutôt des enregistrements à fréquences multiples. Des lectures d’impédance à un nombre spécifié de fréquences seront enregistrées pour chaque puits pour une analyse approfondie ultérieure.
REMARQUE : La résolution temporelle diminue avec l’augmentation du nombre de fréquences enregistrées par puits et l’augmentation du nombre de puits. Les options pour la sélection des modes d’acquisition de fréquences et de données varient selon le type d’instrument et la version.
- Démarrer l’acquisition de données de cours de temps.
- Suivez l’impédance de couche cellulaire (au moins 2 h) jusqu’à ce que l’impédance se soit stabilisée. En attendant, préparez les solutions agonistes.
- Lorsque les couches cellulaires ont atteint un niveau d’impédance stable, soit (i) procéder à l’ajout d’agoniste sain en série dans la même expérience ou (ii) mettre fin à l’acquisition de données et commencer un nouveau jeu de données pour la surveillance de l’activation des récepteurs induits par agoniste.
4. Préparation de solutions agonistes pour des expériences en mode agoniste
- Calculez la concentration des solutions agonistes au besoin pour chaque étape du dosage en série selon l’équation (1). n varie de 1 au nombre total d’ajouts en série i. x dénote la concentration et le volume dans le puits à l’étape n. y dénote la concentration et le volume de la "solution-à-être-ajouté" dans l’étape n.
REMARQUE : Considérez le nombre de répliques et calculez le volume total de « solution-à-être-ajouté » pour chaque étape de concentration. Les résultats d’un calcul typique sont donnés dans les tableaux 1-4. Il faut une idée générale de la plage de concentration agoniste pour être étudiée comme la gamme définit les concentrations et le nombre de portions à administrer lors de l’ajout en série. En utilisant le protocole d’addition agoniste en série, la concentration agoniste est augmentée dans le sens des étapes. Par conséquent, la quantité d’agoniste déjà dans le puits lorsque la prochaine dose est ajoutée doit être prise en compte. When the number of agonist molecules already present in the well is nx = cx ∙Vx (with the current concentration cx and volume Vx) and the number of molecules in the well after the next addition is nx+y, the number of molecules to be added ny is determined by the concentration cy and volume Vy of the solution to be applied to the well (ny = cy ∙ Vy). Après l’ajout d’une partie de l’agoniste, la nouvelle quantité de molécules agonistes dans le puits est: cx 'y 'Vx 'y 'cx 'V x ' c y ' Vx ' cy ' Vy. Ce calcul s’applique à chaque étape ultérieure. En raison de l’interdépendance de la concentration agoniste dans le puits et de la quantité d’agoniste dans les portions à ajouter à chaque étape, il est important de définir les concentrations finales après chaque étape à l’avance.
Mode 1: Le volume dans le puits augmentera à chaque étape à mesure que le liquide est continuellement ajouté.
En utilisant ce mode et un format de 8 puits, utilisez Vx1 200 'L et Vy1 .... Vyi '30 'L.
Mode 2: Le volume dans le puits est constant car le volume ajouté à chaque étape est supprimé juste avant l’ajout suivant.
En utilisant ce mode et un format de 96 puits, utilisez Vx1 150 l et Vy1 .... Vyi 75 'L.
- Imprimez la feuille de données avec le volume total par concentration et des instructions détaillées pour le tuyauterie.
- Préparer toutes les solutions dans le montant requis. Faites toutes les solutions agonistes dans le même milieu sans sérum que celui utilisé pour l’équilibre des cellules.
CAUTION : Le dihydrochlorure d’histamine est considéré comme dangereux par la norme de communication de danger 2012 d’OSHA (29 CFR 1910.1200). L’histamine provoque une irritation de la peau, une irritation oculaire grave, peut causer une réaction cutanée allergique, une allergie, des symptômes d’asthme ou des difficultés respiratoires si elle est inhalée et peut causer une irritation respiratoire. Veuillez consulter la fiche de données sur la sécurité.
REMARQUE : Rendre les solutions agonistes aussi fraîches que possible. La stabilité des agonistes dans la solution peut varier considérablement. Stockez les solutions à 4 oC ou moins jusqu’à ce qu’elles soient utilisées dans l’expérience. Pour certaines molécules, des additifs stabilisateurs supplémentaires, comme le BSA lors de l’utilisation de molécules à base de peptides ou de lipides, peuvent être considérés comme empêchant l’adsorption aux parois des puits et des tubes. - Si vous effectuez l’expérience en format 96 puits, transférez des solutions à une plaque conventionnelle de 96 puits (pas d’électrodes) et utilisez une canalisation de 8 (ou 12)) pour un transfert rapide de liquide vers le réseau d’électrodes.
5. Préparation de solutions agonistes pour l’expérimentation en mode antagoniste
REMARQUE : Préparer la solution antagoniste avec la concentration à appliquer partout. Le volume et la concentration de la solution antagoniste dépendent du mode d’addition agoniste (1 ou 2). Exemples d’expériences en format 8 puits ou 96 puits en mode 2 : (A) format 8 puits (Vx1 à 200 l, VAntagoniste 200 l); (B) format 96 puits (Vx1 à 150 l, VAntagoniste 75 euros).
- Calculez la concentration de chaque solution agoniste nécessaire pour chaque étape du dosage en série tel que décrit à l’étape 4.1.
- Faire toutes les solutions agonistes dans le même milieu sans sérum comme utilisé pour l’équilibre des cellules et ajouter l’antagoniste à la même concentration finale que prévu pour les puits respectifs dans l’expérience.
REMARQUE: Dans ce cas, la solution de stock d’histamine (10 mM) est préparée en milieu L-15. Lorsque les agonistes sont dissous dans d’autres solvants (p. ex., le sulfoxid de diméthyle (DMSO), l’éthanol) un contrôle des solvants devrait être inclus pour tenir compte de la charge croissante de solvants à chaque étape de l’ajout.
6. Exécution du protocole d’addition en série en mode agoniste
- Démarrer l’acquisition de données décrite dans les étapes 3.1 à 3.5.
- Préchauffez les solutions agonistes avant de les utiliser en les plaçant dans l’incubateur environ 10 à 15 minutes avant l’ajout.
REMARQUE : Lorsque vous utilisez des substances thermo-labiles, les solutions ne doivent pas être maintenues à 37 oC trop longtemps. Si le préchauffage de 10 à 15 minutes est considéré comme essentiel, apportez des solutions à 37 oC peu de temps avant d’être ajoutés dans un bain d’eau. - Exécuter le dosage en série agoniste dépendant du mode d’addition sélectionné. Suivant le mode 1, le volume total dans le puits augmente avec chaque ajout de la dose suivante. En mode 2, le même volume qui est ajouté à chaque étape est également supprimé à nouveau juste avant d’ajouter la dose plus élevée suivante.
REMARQUE : Le temps nécessaire pour l’équilibre de la couche cellulaire entre deux doses agonistes ultérieures dépend du temps de réponse des cellules. Une première expérience en mode parallèle (un puits et une concentration) révèle (i) les temps de réponse cellulaire pour différentes concentrations agonistes et (ii) le paramètre de courbe le plus sensible (p. ex., maximum d’impédance, impédance après temps x).
A: Format Mode 1 / 8-bien
- Ajouter 30 L de la première solution avec la plus faible concentration d’agoniste aux cellules qui ont été réquilibées dans 200 l de milieu sans sérum.
- Laissez les cellules réagir et équilibrer pour la période prédéfinie (p. ex., 15 min).
- Ajouter 30 L de la deuxième solution avec la concentration suivante plus élevée.
- Répétez les étapes 6.3.1-6.3.3 avec la troisième, quatrième, et ainsi de suite, solution agoniste.
REMARQUE : Travailler avec 10 étapes de concentration se traduira par un volume total de 500 L à la fin de l’expérience, ce qui est juste en dessous du volume maximal applicable de ces puits de 550 l.
B: Mode 2 / 96-bien format
REMARQUE : Pause d’acquisition de données pendant chaque étape de manipulation liquide (ajout/retrait) via le logiciel de l’instrument d’impédance lors de l’exécution d’expériences en format 96 puits. La manipulation liquide plus élaborée peut interférer avec l’acquisition de données. Utilisez une pipette multicanal.
- Saisie de données en pause.
- Ajouter 75 L de la première solution avec la plus faible concentration d’agoniste aux cellules qui ont été réquilibées dans 150 'L de milieu sans sérum.
- Reprendre l’acquisition de données.
- Laissez les cellules réagir et équilibrer pour la période prédéfinie (p. ex., 15 min).
- Environ 1 à 2 minutes avant la fin du temps d’équilibre régulier, faites une pause dans la mesure et retirez 75 L de chaque puits.
REMARQUE : Le moment où la solution doit être enlevée dépend du nombre de puits surveillés en parallèle et de la vitesse de tuyauterie. Le temps nécessaire à la suppression des solutions ne doit pas dépasser le délai entre les étapes suivantes. - Ajouter 75 L de la deuxième solution avec la concentration suivante plus élevée et reprendre la mesure.
- Répétez les étapes 6.3.8-6.3.10 avec la troisième, quatrième, et ainsi de suite, solution agoniste.
7. Exécution du protocole d’addition en série en mode antagoniste
- Démarrez la mesure décrite dans les étapes 3.1 à 3.5.
- Pendant l’équilibre des couches cellulaires, préparer la solution antagoniste (p. ex., 200 l de 1,5 M d’hydrochlorure de diphenhydramine dans le milieu L15).
CAUTION : L’hydrochlorure de diphenhydramine a des effets aigus potentiels sur la santé. Il est nocif s’il est avalé ou inhalé, peut causer une irritation des yeux et de la peau. Il peut causer une irritation des voies respiratoires et digestives. Veuillez consulter la fiche de données sur la sécurité. - Préchauffez les solutions antagonistes et agonistes en les plaçant dans l’incubateur environ 10 à 15 minutes avant d’ajouter aux cultures cellulaires (cf. 6.2). Si des puits sans antagonistes sont également inclus dans l’essai, aussi un milieu sans sérum pré-chaud.
- Ajouter la solution antagoniste aux puits désignés. Laissez les cellules équilibrer avec antagoniste pendant 15 à 20 min. Si des puits sans antagonistes sont inclus, ajoutez le même volume de milieu sans sérum à ces puits.
- Selon l’ajout antagoniste dans le mode 2, supprimer la solution des puits
(A) format 8 puits (200 l)
(B) format 96 puits (75 l) - Exécuter la séquence d’addition agoniste telle que décrite à l’étape 6.3.
8. Exportation et analyse de données
- Les données d’exportation à l’aide du logiciel de l’instrument d’impédance afin de convertir toutes les données enregistrées de propriétaires en formats de données communs (p. ex., csv). Cette étape permet la réorganisation et la présentation des données avec d’autres progiciels.
- Chargez les données formatées csv sur un logiciel d’analyse de données scientifiques.
- Normaliser les valeurs d’impédance en soustrayant l’impédance du dernier point de données avant le premier ajout de solution agoniste et en définissant l’heure d’ajout à t '0. Tracer le cours du temps de l’impédance normalisée.
- Tracez les cours de temps individuels et identifiez les maxima dans l’impédance après chaque étape d’addition. Composez une feuille de données avec ces valeurs.
- Tracer les valeurs de changements d’impédance maximum (ou minimum, le cas échéant) en fonction de la concentration agoniste. Cela peut être fait pour les puits individuels ou pour les moyennes (moyenne et DD).
- Utiliser une routine d’ajustement de données pour déterminer les concentrations effectives à demi-maximales (EC50) et la réponse maximale (EMax) en utilisant le modèle logistique à quatre paramètres (équation 2) :
REMARQUE: c indique la concentration agoniste, A1 est le minimum et A2 est l’asymptote maximum de la courbe de dose-réponse sigmoïdale (A2 - EMax). EC50 est la concentration au point d’inflexion de la courbe, et n correspond à la pente de la colline.
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Representative Results
Un schéma typique pour la préparation des différentes solutions agonistes est montré pour une expérience utilisant des réseaux d’électrodes à 8 puits avec l’histamine comme agoniste dans les tableaux 1-4. Le tableau 1 et le tableau 2 présentent des volumes et des concentrations pour une expérience utilisant le mode d’ajout 1 (cf., figure 1), tandis que les volumes et les concentrations des points 3 et 4 présentent des volumes et des concentrations pour une expérience suivant le mode d’ajout 2 (cf., figure 1). Les données ont été calculées à l’aide de l’équation (1).
Une expérience représentative est présentée à la figure 2 pour les couches de confluents de cellules U-373 MG, qui expriment endogènement le récepteur de l’histamine 1, cultivé sur un réseau d’électrodes de 8 puits avec une électrode de travail de 250 m de diamètre utilisant l’histamine comme agoniste. La mesure a été effectuée à une fréquence unique de 12 kHz. L’addition de la série de concentration agoniste a été effectuée suivant le mode 1. Dans l’expérience sélectionnée, 10 solutions avec augmentation de la concentration d’histamine (préparées selon l’étape 4) ont été ajoutées séquentiellement toutes les 15 min (figure 2A). Le schéma de dosage en série a été appliqué à sept des huit puits. Dans un milieu bien agoniste-libre (L-15) a été ajouté séquentiellement comme un contrôle négatif dans neuf des dix étapes. Le dernier ajout à ce contrôle était une solution d’histamine fournissant une concentration finale de 100 'M histamine dans le puits. Les données ont été tracées avec un logiciel d’analyse de données et sont présentées sous forme de changement d’impédance. Z 12 kHz / k ' le long de l’expérience, avec le changement d’impédance et le point de temps de la première addition étant réglé à zéro. Le temps d’équilibre initial dans le tampon expérimental de 2 h n’est pas indiqué dans cette parcelle. Les points de temps de l’addition agoniste sont indiqués par des flèches.
Le changement d’impédance par rapport à la ligne de base après chaque étape de concentration a été extrait des courbes à l’aide d’un curseur de données. À des étapes sans maximum clair, le dernier point de données avant l’ajout suivant a été utilisé pour l’analyse. Changements d’impédance Z 12 kHz ont été tracés en fonction de la concentration d’histamine (cx-y) (Figure 2B, symboles). La fonction de transfert d’un modèle logistique à quatre paramètres (cf. étape 8.6) a été installée sur les points de données expérimentaux de sept puits(figure 2B, lignes). Les résultats de l’ajustement sont indiqués dans le tableau 5. La figure 2C et la figure 2D montrent le résultat de la moyenne des données de la figure 2A et de la figure 2B, présentant la moyenne et le DD pour sept puits. Les données moyennes sur le cours de temps sont résumées à la figure 2C, tandis que la courbe dose-réponse moyenne est fournie à la figure 2D.
Dans les relations dose-réponse, comme le montre la figure 2B,D, la procédure d’ajustement a été appliquée à l’ensemble de la plage de concentration en retour EC50 -(0,86 - 0,13) M. La réponse d’impédance augmente monotonalement avec la concentration croissante d’histamine excepté les deux dernières étapes de concentration (30 M, 100 m concentration finale). Cette réponse s’explique vraisemblablement par la dérégulation du récepteur de l’histamine, la désensibilisation ou la surstimulation des cellules (voir discussion). Pour tenir compte de cet effet, la plage de données pour l’analyse a été réduite, comme le montre une seule expérience de dosage en série(figure 3; bien 1) sélectionnée à partir des données présentées à la figure 2. En outre, la fixation de l’asymptote inférieur (A1) à zéro pendant l’optimisation au moins carré en supposant qu’aucun changement d’impédance en réponse à l’histamine de 0 M est bien justifié. L’application de cette optimisation de ces trois paramètres fournit un EC50 de (0,75 à 0,12) M (cf., Figure 3B). Les valeurs EC50 se sont avérées insensibles à l’un ou l’autre des modes d’analyse des données et n’étaient pas significativement différentes.
Les résultats typiques d’une expérience de 96 puits sont résumés à la figure 4. Les cellules De mg d’U-373 ont été cultivées sur des réseaux d’électrodes de 96 puits comme décrit ci-dessus. 32 puits ont été inclus dans la mesure. 8 puits ont servi de contrôles sans agonisme, exposés au milieu seulement. 24 puits ont été soumis à une série d’augmentation des concentrations d’histamine calculées et préparées pour le mode d’addition 2. Le cours temporel du changement d’impédance est indiqué pour les 32 puits individuels de la figure 4A. L’une des courbes (surlignée en rouge) montre un parcours temporel inhabituel et a été exclue de toute analyse. Par conséquent, les données de 23 puits ont été moyennes et tracées au fur et à mesure du changement d’impédance moyen (moyen et DD) à la figure 4B. Chaque courbe individuelle a été analysée comme décrit ci-dessus pour la relation dose-réponse. Les points de données ont été moyens et tracés en fonction de la concentration finale d’histamine (figure 4C). Les données dose-réponse ont été analysées au moyen du modèle logistique de quatre paramètres, qui a rapporté une valeur moyenne de50 EC de (1,0 à 0,3 M).
Un résultat typique pour le protocole d’addition agoniste en série en mode antagoniste est affiché dans la figure 5. Ici, un puits a été prétraité avec 0,75 M de diphenhydramine antagoniste des récepteurs de l’histamine (courbe rouge) 20 min avant l’ajout de la première histamine (Figure 5A). Le contrôle a reçu le milieu antagoniste-libre (courbe bleue). L’antagoniste a été ajouté suivant le mode 2, ce qui signifie que 200 l de la dernière 400 L ont été supprimés avant la série agoniste a été appliquée. L’agoniste (histamine) a été ajouté après le mode de dosage en série 1 comme décrit dans les exemples ci-dessus. Il est important pour les expériences en mode antagoniste que la concentration antagoniste soit maintenue constante pendant tout le temps de l’expérience. En conséquence, toutes les solutions agonistes ajoutées au puits doivent également contenir la concentration antagoniste prédéfinie (dans ce cas, 0,75 M), tandis que le contrôle reste exempt d’antagonistes. Un effet antagoniste devient évident par une augmentation « retardée » de l’impédance dans le schéma de dosage en série correspondant à des concentrations agonistes plus élevées nécessaires pour induire une réponse cellulaire. Dans la relation dose-réponse, l’effet de l’antagoniste est exprimé comme un déplacement vers la droite des courbes, ce qui correspond à une augmentation de eC50, à condition que l’antagoniste soit un ligand concurrentiel par rapport à l’agoniste (figure 5B). L’EC50 a été déterminé à (0,92 à 0,05) M en l’absence de l’antagoniste et (14,7 à 0,6) M en sa présence.
Figure 1 : Modes d’addition agonistes en série. (A) Schéma illustrant les calculs de concentration. En ajoutant la solution agoniste de la concentration cy et du volume Vy à un puits avec le volume Vx et la concentration agoniste cx, le volume augmente à Vxy et la concentration augmente à cxy. (B) Deux modes différents pour l’addition agoniste série. Mode 1 : Le volume total du puits Vx’y augmente à chaque ajout. Mode 2 : Le volume ajouté à chaque étape de concentration est à nouveau supprimé avant l’ajout de la dose suivante, ce qui maintient le volume total dans le puits constant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Résultats d’une expérience typique en format 8 puits. (A) Changement de temps d’impédance à 12 kHz pour les couches de cellules U-373 MG confluentes cultivées sur des électrodes de travail circulaires de 250 m de diamètre. Dans sept des huit puits, l’addition sérielle d’histamine a été appliquée. Un puits (courbe grise) a été chargé de façon séquentielle avec un tampon sans histamine à chaque étape (mode 1), à l’exception de la dernière étape où 100 m d’histamine ont été ajoutés comme un contrôle positif. (B) Relations dose-réponse générées à partir du changement maximal d’impédance par rapport à la ligne de base pour sept puits individuels après chaque étape de concentration. (C) Cours de temps moyen du changement d’impédance (moyen et SD) généré à partir de sept puits individuels comme indiqué dans (A). (D) Relations dose-réponse moyennes générées à partir d’ensembles de données individuels comme indiqué dans (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Adaptation des modes d’analyse des données. (A) Changement de temps typique d’impédance à 12 kHz pour une seule couche cellulaire U-373 MG confluente cultivée sur des électrodes de travail circulaires de 250 m de diamètre. (B) Relation dose-réponse expérimentale (symboles remplis) générée à partir du changement maximal d’impédance par rapport à la ligne de base après chaque augmentation de concentration. Soit l’ensemble complet de données a été soumis à la procédure d’ajustement (courbe noire et grise) ou le dernier point de données - indiquant l’entrée en fonction de la désensibilisation des récepteurs et/ou de l’internalisation - a été omis de l’analyse quantitative (courbe rouge et magenta). Les quatre paramètres ont été ajustés pendant l’optimisation du moins carré (courbe noire et rouge) ou le paramètre A1, représentant l’asymptote inférieur, a été réglé et fixé à zéro (courbe grise et magenta). Les valeurs EC50 n’étaient pas significativement différentes pour les deux modes d’analyse de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Expérience typique en format 96 puits. (A) Cours temporel du changement d’impédance mesuré à 12 kHz pour les couches cellulaires U-373 MG confluentes cultivées sur un réseau d’électrodes de 96 puits. Les données sont affichées pour 32 puits. 24 puits ont été soumis à une série de concentrations croissantes d’histamine ajoutées avec un temps d’équilibre de 15 min entre chaque étape. La courbe mise en évidence en rouge a été exclue de la moyenne. Huit puits (contrôle) ont été traités avec un milieu sans histamine à chaque moment d’addition. (B) Cours de temps de changement d’impédance moyenne pour 23 puits individuels en réponse à l’ajout en série d’histamine et huit puits de contrôle comme indiqué dans (A). (C) Relation dose-réponse moyenne générée à partir du changement maximal d’impédance par rapport à la ligne de base après chaque augmentation de concentration (moyenne et DD). Les données ont été équipées d’une fonction logistique à quatre paramètres. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Expérience typique en mode antagoniste. (A) Changement temporel d’impédance à 12 kHz pour les couches de cellules U-373 MG confluentes cultivées sur des électrodes de travail circulaires de 250 m de diamètre après l’ajout de concentrations croissantes d’histamine avec ou sans présence de diphenhydramine antagoniste des récepteurs de l’histamine. La diphenhydramine (0,75 M) ou milieu sans antagonistes (L15) a été ajoutée 20 min avant le début du dosage en série agoniste. (B) Les relations dose-réponse générées à partir du changement maximal d’impédance par rapport à la ligne de base après chaque augmentation de concentration des données indiquées dans (A). La présence de 0,75 M Diphenhydramine a augmenté l’EC50 de 0,92 à 0,05 m à 14,7 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Solution # | cx-y (M) | cx (M) | Vx (L) | Vxy (L) | Vy (L) | cy (M) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tableau 1 : Schéma de calcul de la concentration pour les expériences utilisant des réseaux d’électrodes à 8 puits suivant le mode d’ajout 1.
| Solution # | cy (M) | Vy (L) | faire à partir de | c (M) | facteur de dilution | faire v total (l) | l’utilisation (l) | ajouter V (l) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM Stock | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tableau 2 : Schéma de tuyauterie pour les expériences utilisant des réseaux d’électrodes à 8 puits suivant le mode d’ajout 1.
| Solution # | cx-y (M) | cx (M) | Vx (L) | Vxy (L) | Vy (L) | cy (M) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tableau 3 : Schéma de calcul de la concentration pour les expériences utilisant des réseaux d’électrodes à 8 puits suivant le mode d’ajout 2.
| Solution # | cy (M) | Vy (L) | faire à partir de | c (M) | facteur de dilution | faire v total (l) | l’utilisation (l) | ajouter V (l) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 M Stock | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tableau 4 : Schéma de tuyauterie pour les expériences utilisant des réseaux d’électrodes à 8 puits suivant le mode d’ajout 2.
| Bien | EC50 | Emax (A2) | A1 Annonces | ¡n |
| (M) | (k) | () | ||
| 1 | 0,9 à 0,1 | en 1680 et 70 | De 150 à 80 | 1,9 à 0,5 |
| 2 | 0,7 à 0,2 | en 1770 et 90 | 200 à 140 euros | 1,3 à 0,4 |
| 3 | 0,6 à 0,2 | 1700 à 100 | De 60 à 250 | 1,1 à 0,5 |
| 4 | 0,6 à 0,2 | 2000 à 100 | 140 à 180 | 1,3 à 0,4 |
| 5 | 0,9 à 0,1 | en 1810 et 60 | De 160 à 80 | De 1,4 à 0,3 |
| 6 | 0,8 à 0,1 | en 1950 et 70 | De 200 à 110 | De 1,3 à 0,3 |
| 7 | 0,6 à 0,3 | 1700 à 200 | 260 à 250 | 1,6 à 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 à 0,2 | en 1900 et 100 | De 100 à 100 | 1,1 à 0,2 |
Tableau 5 : Résultats obtenus à partir de quatre ajustements logistiques de paramètres appliqués aux données typiques dose-réponse. Les données dose-réponse utilisées pour l’analyse sont présentées à la figure 2. La gamme de concentration complète a été appliquée à l’analyse des puits individuels de un à sept(figure 2B) et aux données moyennes obtenues des puits de un à sept(figure 2D). Aucun des paramètres de la fonction logistique n’a été fixé pendant l’optimisation au moins carré. Les résultats d’ajustement ont été arrondis à la décennie de l’erreur, sauf si la valeur était inférieure à l’erreur.
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour les mesures d’impédance sans étiquette pour déterminer la relation dose-réponse de l’activation du GPCR induite par agoniste en l’absence ou la présence d’antagonistes spécifiques pour le même récepteur. La preuve de concept de cette méthode a été présentée dans une publication récente12. À notre connaissance, il s’agit de la première étude décrivant l’établissement d’une courbe dose-réponse complète de l’activation du GPCR à médiation agoniste à l’aide d’une seule couche cellulaire in vitro. L’approche exige inévitablement l’utilisation d’approches de surveillance cellulaire sans étiquette et ne s’appliquera pas aux essais de fin.
Le protocole a été démontré sur l’exemple des cellules de MG d’U-373, qui expriment endogènement le récepteur humain d’histamine 1 (hHR1) qui est stimulé avec une série des concentrations croissantes de son histamine agoniste endogène tandis que l’impédance des cellules est continuellement enregistrée. Pour démontrer l’applicabilité du protocole aux études antagonistes, les expériences ont été répétées en présence d’une concentration constante de diphenhydramine, un antagoniste concurrentiel au hH1R. Des enregistrements d’impédance ont également été utilisés avec succès pour étudier d’autres agonistes H1R (p. ex., UR-KUM53011, dosage individuel et stepwise) et antagonistes (p. ex. Mepyramine)12 en plus des exemples présentés ici. En outre, le protocole a été appliqué à d’autres lignées cellulaires et récepteurs ainsi, par exemple CHO-D2R exprimant le récepteur de la dopamine D2 (D2R) ou BAEC exprimant le récepteuradrénergique2 -adrénergique(2AR)12 indiquant qu’il présente un schéma général pour la génération très efficace de données dose-réponse. Alors que les cellules U373-MG et BAEC expriment les récepteurs respectifs H1R et2AR à des niveaux endogènes, le CHO-D2R est un exemple pour un modèle cellulaire recombinant. Pris ensemble, le protocole de série s’applique en général aux types de cellules avec l’expression endogène ou ectopique de GPCR, aux GPCR avec différents types d’accouplement Gq (par exemple, H1R), Gs (p. ex.,2AR), Gi (p. ex., D2R) ainsi que différents types de ligands (agoniste/antagoniste). Dans tous les types de cellules/récepteurs mentionnés ci-dessus, l’impédance augmente avec la concentration agoniste croissante. Cependant, certaines cellules répondent à l’activation du GPCR par une diminution de l’impédance. Nous avons testé le protocole pour un tel cas (HaCaT/histamine) et avons également constaté une diminution progressive dépendante de la concentration, soutenant la notion d’une approche généralement applicable qui est également compatible avec les changements inverses d’impédance. Il a été proposé que le cours de temps détaillé des données d’impédance indique le type de couplage g-protéine d’un récepteur donné. Même si le concept est attrayant, le pool de nos données ne prend pas en charge une règle généralement applicable qui corrèle le profil de temps d’impédance à l’accouplement g-protéine d’un GPCRdonné 6.
Le protocole d’ajout en série est adaptable à différents types de mises en page d’électrodes et de formats multi-puits. Il s’applique aux systèmes de perfusion sur puce, ce qui constitue un avantage important par rapport à de nombreuses approches basées sur les étiquettes qui nécessitent souvent une couche cellulaire pour tester une concentration. Par conséquent, le schéma de dosage en série peut ouvrir la voie à des études de dose-réponse dans des modèles biologiques plus complexes comme l’organe sur une puce ou même l’homme sur une puce. Les mesures d’impédance détectent une réponse intégrée et distale des cellules à l’activation de récepteur qui induit finalement des changements de morphologie de cellules. Cette lecture plutôt générale et non spécifique mais aussi impartiale est la base de sa large applicabilité qui ne se limite pas aux RGPC, mais qui pourrait aussi fonctionner pour d’autres classes de récepteurs de surface cellulaire, de récepteurs cytoplasmiques ou même de protéines intracellulaires comme cibles.
Il est essentiel que le protocole d’addition agoniste progressive fonctionne avec des couches cellulaires confluentes sur les électrodes, car les cultures clairsemées interfèrent avec la sensibilité, la reproductibilité et l’interprétation des données. Une condition préalable supplémentaire pour la surveillance réussie de l’activation de récepteur même dans les monocouches de cellules de confluent est un changement de forme de cellules le long de la cascade de transduction de signal. Si les cellules à l’étude ne modifient pas leur morphologie tout au long de l’expérience, les réadmissions basées sur l’impédance sont aveugles et ne feront pas état d’un changement dans l’activité des récepteurs. Pour bien mettre en page le protocole d’addition en série, le pré-test initial en mode conventionnel d’un bien-une concentration est recommandé pour déterminer la plage de concentration de l’agoniste grossièrement et l’intervalle de temps entre les ajouts agonistes suivants. Les intervalles de temps entre les doses séquentielles de l’agoniste doivent être adaptés de telle sorte que le système adopte un nouvel équilibre avant la prochaine dose plus élevée est ajoutée. En conséquence, la méthode peut être moins utile pour les récepteurs qui déclenchent une réponse très rapide et seulement transitoire des cellules ou une réponse très lente qui peut prendre des heures à compléter. Cette dernière situation augmenterait le temps total de l’expérience et appellerait des protocoles d’addition parallèles pour couper court sur le temps de laboratoire. Dans les exemples présentés ci-dessus, le temps d’exécution total de l’expérience était de 2,5 à 3,5 h, selon le nombre de concentrations (8 ou 10) et une pré-incubation potentielle avec antagoniste. La même expérience en mode d’addition agoniste parallèle classique ne prendrait que 1 h pour le même modèle de récepteur cellulaire, mais avec un débit beaucoup plus faible. Un avantage évident de l’approche sérielle est que le nombre de concentrations qui doivent être testées pour une relation dose-réponse complète n’est pas limité par le nombre de puits disponibles. Si des concentrations d’agonistes plus élevées sont nécessaires, l’expérience est facilement étendue et complétée sans aucun travail supplémentaire de culture cellulaire. L’addition agoniste elle-même devrait être effectuée soigneusement, car certaines cellules sont sensibles au stress de cisaillement et répondent avec des changements considérables d’impédance simplement en raison de la stimulation mécanique imposée par la manipulation liquide. Les cellules pourraient même se détacher de l’électrode. Ce problème n’est cependant pas unique à la surveillance cellulaire basée sur l’impédance, mais s’applique à d’autres techniques ainsi. Pour les cellules sensibles, le mode d’addition 1 est recommandé en raison de la réduction de la charge mécanique sur les cellules. Cependant, ce mode fonctionne avec des volumes liquides plus faibles pendant l’addition qui augmente le risque de mélange incomplet puisque l’agitation intensive n’est pas recommandée pour éviter les réponses cellulaires non spécifiques.
Le mode d’addition 1 va de pair avec une augmentation progressive du volume total dans le puits tandis que le mode 2 maintient le volume total constant puisque des quantités égales de solution sont supprimées de façon séquentielle. Ce ne sont là que les deux stratégies extrêmes qui pourraient être adaptées à des types de cellules spéciales, à des formats multi-puits ou à des mises en page d’électrodes de quelque manière que ce soit. Dans le cas du modèle U373-MG/H1R, de légères différences dans les valeurs EC50 et EMax ont été observées pour le mode d’addition en série par rapport au mode d’addition parallèle classique (série, N 30: EC50: (0,8 à 0,3) M, EMax: (1,9 à 0,2) k'; parallèle, N 15: EC50: (0,5 à 0,2) M, EMax: (1,3 à 0,3) k', tandis que les autres modèles cellulaires/récepteurs n’ont montré aucune différence. Les changements dans les valeurs EC50 et EMax pourraient provenir de la désensibilisation des récepteurs qui est plus susceptible de se produire lorsque les récepteurs sont exposés à l’agoniste pendant de plus longues périodes. L’influence de la désensibilisation dépendra fortement du récepteur et du ligand à l’étude. Il reste à élucider si une analyse détaillée de l’addition agoniste sérielle et parallèle peut fournir un nouveau moyen d’étudier la désensibilisation des récepteurs.
Nous vous recommandons d’effectuer une expérience de contrôle avec l’ajout d’agoniste en mode parallèle conventionnel afin de tester les changements potentiels dans les courbes dose-réponse. D’autres contrôles devraient inclure un échantillon traité uniquement avec moyen/solvant à des doses appropriées pour démêler les effets dus à la charge de solvant ou au stress mécanique lors de l’ajout moyen. Cela devient particulièrement important si la solution de stock du ligand est préparée dans d’autres solvants que le moyen (p. ex. DMSO, éthanol). Lors de l’étude de l’effet de différents ligands un agoniste standard doit être inclus comme référence.
Les directions futures devraient impliquer des unités automatiques de manipulation liquide, ce qui pourrait permettre un dosage ou une titration entièrement automatisé. L’application du mode d’addition en série dans les systèmes de perfusion offre un grand potentiel pour les approches de la puce et de l’organe sur puce, ainsi que pour les expériences effectuées sous le stress du cisaillement liquide.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Barbara Goricnick et Nadja Hinterreiter pour leur aide dans la culture cellulaire et la préparation de solutions expérimentales. Les auteurs remercient le soutien financier du Research Training Group 1910 «Medicinal chemistry of selective GPCR ligands» financé par la Fondation allemande de recherche (DFG) sous le numéro de subvention 222125149. JAS est particulièrement reconnaissant pour une bourse accordée par le Programme bavarois pour l’égalité des sexes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
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