Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

लेबल-फ्री बाधा-आधारित जीपीसीआर अखस में वृद्धि थ्रूपुट के लिए स्टेपवाइज डोजिंग प्रोटोकॉल

Published: February 21, 2020 doi: 10.3791/60686
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1,4
1Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, 2Institute of Pharmacy, University of Regensburg, 3Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, 4Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

Summary

यह प्रोटोकॉल लेबल-मुक्त बाधा मापन का उपयोग करके एक माइक्रोइलेक्ट्रोड पर उगाई जाने वाली एक कोशिका परत से एगोनिस्ट-प्रेरित जीपीसीआर सक्रियण के लिए पूर्ण खुराक-प्रतिक्रिया संबंधों की वास्तविक समय रिकॉर्डिंग को दर्शाता है। नई खुराक योजना काफी समय संकल्प में नुकसान के बिना थ्रूपुट बढ़ जाती है ।

Abstract

लेबल-मुक्त बाधा आधारित परखों का उपयोग सेल संस्कृति प्रयोगों में लिगांड-प्रेरित जीपीसीआर सक्रियण का गैर-आक्रामक अध्ययन करने के लिए किया जाता है। दृष्टिकोण एक डिवाइस पर निर्भर समय संकल्प के साथ वास्तविक समय सेल निगरानी प्रदान करता है मिलीसेकंड के कई दसियों के लिए नीचे और यह अत्यधिक स्वचालित है । हालांकि, जब नमूना संख्या उच्च हो (जैसे, विभिन्न विभिन्न लिगांड के लिए खुराक-प्रतिक्रिया अध्ययन), डिस्पोजेबल इलेक्ट्रोड सरणी के लिए लागत के साथ-साथ अनुक्रमिक अच्छी तरह से अच्छी तरह से रिकॉर्डिंग के लिए उपलब्ध समय संकल्प सीमित हो सकता है। इसलिए, हम यहां एक धारावाहिक एगोनिस्ट अतिरिक्त प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें लेबल-फ्री जीपीसीआर परखके उत्पादन में काफी वृद्धि करने की क्षमता है। धारावाहिक एगोनिस्ट अतिरिक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक जीपीसीआर एगोनिस्ट को नमूने की बाधा (एगोनिस्ट मोड) की लगातार निगरानी करते हुए एक कोशिका परत में सांद्रता बढ़ाने में क्रमिक रूप से जोड़ा जाता है। इस सीरियल अप्रोच के साथ अब सिर्फ एक ही सेल लेयर से जीपीसीआर एगोनिस्ट के लिए फुल डोज-रिस्पांस कर्व स्थापित करना संभव है । धारावाहिक एगोनिस्ट इसके अलावा प्रोटोकॉल विभिन्न जीपीसीआर युग्मन प्रकारों, जीक्यू जीआई/0 या जीएस पर लागू होता है और यह अध्ययन के तहत रिसेप्टर के पुनः संयोजन और अंतःप्रयोज्य अभिव्यक्ति स्तरों के साथ संगत है। जीपीसीआर विरोधी द्वारा रिसेप्टर अवरुद्ध करना मूल्यांकन योग्य है (विरोधी मोड)।

Introduction

यह रिपोर्ट लेबल-फ्री बाधा मापन द्वारा अनुयायी विकसित कोशिकाओं में लिगांड-प्रेरित जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) सक्रियण के परिमाणीकरण के लिए विकसित एक धारावाहिक अतिरिक्त प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रस्तुत करती है । जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) शारीरिक कार्यों और मानव रोगों की एक भीड़ में शामिल हैं1। इस वजह से और सेल की सतह पर उनकी अच्छी पहुंच, GPCRs सबसे महत्वपूर्ण दवा लक्ष्यों में से एक हैं । यह आकलन जीपीसीआरएस को लक्षित करने वाली ~ 700 अनुमोदित दवाओं की अनुमानित संख्या में परिलक्षित होता है, जो सभी विपणनवालीदवाओं 2 पर ~ 35% हिस्सेदारी के बराबर है।

नई दवाओं के विकास में दो केंद्रीय प्रक्रियाएं शामिल हैं: (i) जैविक लक्ष्य अणुओं की पहचान और कार्यात्मक लक्षण वर्णन, और (ii) नए लीड पदार्थों की खोज और प्रशासनीय दवाओं में उनके विकास। दोनों प्रक्रियाओं में, दवा-लक्ष्य बातचीत और बाद में जैविक डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रिया का मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए कुशल तरीकों की आवश्यकता होती है। पूर्व नैदानिक दवा विकास प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में दवा और लक्ष्य के बीच जैव आणविक बातचीत अध्ययन से लेकर, संस्कृति में कोशिकाओं पर कार्यात्मक अध्ययन पर, उत्पादित अंग सामग्री या पूरे जानवरों पर प्रयोगों के लिए विश्लेषण के विभिन्न तरीकों का उपयोग करते हैं। दोनों, शारीरिक महत्व और जैविक जटिलता पूर्व से बाद3तक बढ़ जाती है । हालांकि यह पशु प्रयोगों को कम करने के लिए समग्र लक्ष्य है, प्रयोगशाला जानवरों या यहां तक कि पूरे जानवरों से अलग अंगों का उपयोग कर औषधीय अध्ययन व्यापक रूप से नई दवा उंमीदवारों की विशेषता अपरिहार्य माना जाता है । विश्लेषणात्मक readout के संदर्भ में, अंग फार्माकोलॉजी अध्ययन उच्चतम शारीरिक प्रासंगिकता की एक जिला, एकीकृत "समग्र" कार्यात्मक प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं। इस तरह के प्रयोगों की एक खामी यह है कि वे तकनीकी और नैतिक कारणों के लिए उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के अनुकूल नहीं हैं और इन विट्रो सेल संस्कृति4के आधार पर अध्ययनों द्वारा काफी हद तक प्रतिस्थापित किए गए हैं ।

सेल संस्कृतियों में जीपीसीआर सक्रियण की मात्रा निर्धारित करने के तरीकों में विभिन्न लेबल-आधारित रासायनिक परख शामिल हैं, जो विशेष रूप से दूसरे दूतों का पता लगाते हैं, डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग प्रोटीन की फॉस्फोरिलेशन स्थिति, कुछ ट्रांसक्रिप्शन कारकों या लिगांड-प्रेरित इंट्रासेलर रिसेप्टर तस्करी4,5के माध्यम से ट्रांसक्रिप्शन सक्रियण। इस तरह के लेबल आधारित परखों की एक खामी संभावित हानिकारक रंगों या रेडियोधर्मी मार्कर के साथ कोशिकाओं लेबल करने की आवश्यकता है । यह अक्सर एक जोखिम समय है कि एक प्राथमिकताओंनिर्दिष्ट किया जाना है के लिए एक अंत बिंदु निर्धारण के रूप में परख चलाने की आवश्यकता है । लेबल-आधारित एंडपॉइंट परखों का उपयोग प्रयोग के इस बहुत ही सीमित और पक्षपातपूर्ण समय से ग्रस्त है और यह जोखिम कि रासायनिक लेबल और जांच नियमित सेल फिजियोलॉजी में हस्तक्षेप कर सकते हैं - संभावित रूप से प्रयोगकर्ता द्वारा किसी का ध्यान नहीं गया।

हाल के वर्षों में, जीपीसीआर सक्रियण की निगरानी के लिए लेबल-मुक्त परख उभरा है, जैसे बाधा आधारित तकनीकया ऑप्टिकल तरीके गूंजते तरंग मार्गदर्शक झंझरी5,6लागू करते हैं । इन दृष्टिकोणों के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग की प्रायोगिक रूप से आवश्यकता नहीं है। चूंकि ये भौतिक रीडआउट कम आयाम संकेतों पर काम करते हैं, इस तरह के तरीकों को गैर-आक्रामक माना जाता है, वे वास्तविक समय में संभावित रूप से निरंतर सेल निगरानी के लिए अनुमति देते हैं और अवलोकन समय केवल कोशिका संस्कृति द्वारा सीमित नहीं है। पूरे अंगों से readouts के समान, लेबल मुक्त दृष्टिकोण आमतौर पर समग्र सेल प्रतिक्रियाओं पर रिपोर्ट, रिसेप्टर सक्रियण के अभी तक डाउनस्ट्रीम जब पूरे सिग्नलिंग नेटवर्क के साथ एकीकरण समय पर निर्भर है, लेकिन सेल आकृति विज्ञान या बड़े पैमाने पर पुनर्वितरण में अविशिष्ट परिवर्तन की ओर जाता है । जबकि बाधा आधारित परख सेल आकार7,8में परिवर्तन के डाइइलेक्ट्रिक हस्ताक्षर को मापते हैं, अनुनाद तरंग मार्गदर्शक झंझरी का उपयोग करमाप गतिशील जन पुनर्वितरण (डीएमआर)9से उत्पन्न सेल-सब्सट्रेट इंटरफेस पर अपवर्तक सूचकांक में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील होते हैं। एकीकृत चरित्र लेबल-मुक्त तरीकों को जी प्रोटीन (जीक्यू,जीआई/0,जीएस,जी12/13)के प्रकार (एस) की परवाह किए बिना रिसेप्टर-मध्यस्थता की घटनाओं के प्रति अत्यंत संवेदनशील बनाता है या रिसेप्टर के एंडोजेनस अभिव्यक्ति स्तरों के लिए सिग्नलिंग झरना6 और अच्छी तरह से अनुकूल में शामिल है।

एक मानक लेबल-मुक्त बाधा आधारित परख में कोशिकाओं को प्रत्येक अच्छी तरह से10के तल पर जमा coplanar सोने फिल्म इलेक्ट्रोड के साथ बहु अच्छी तरह से प्लेटों में उगाया जाता है । ये इलेक्ट्रोड सरणी एक बाधा विश्लेषक से जुड़े होते हैं और एक प्रयोगात्मक उत्तेजना के लिए सेल प्रतिक्रियाएं समय-हल बाधा रीडिंग द्वारा व्यक्तिगत कुओं से दर्ज की जाती हैं। एक ठेठ GPCR परख में एक ligand प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से अलग सांद्रता में जोड़ा जाता है । बाधा समय पाठ्यक्रम में लिगांड-प्रेरित परिवर्तनों का विश्लेषण विशिष्ट वक्र सुविधाओं जैसे अधिकतम सिग्नल परिवर्तन, वक्र के तहत क्षेत्र, एक निश्चित समय अंतराल या एक निर्दिष्ट समय बिंदु पर वक्र की ढलान के भीतर संकेत परिवर्तन के संबंध में किया जाता है, ताकि लिगांड की शक्ति और प्रभावकारिता11की मात्रा निर्धारित की जा सके।

इलेक्ट्रोड सरणी की लागत उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) अभियानों में इस तकनीक के आवेदन को सीमित कर सकती है। इसके अलावा, नमूनों की बढ़ती संख्या के साथ समानांतर रूप से पालन किया जाएगा, व्यक्तिगत माप की संख्या बढ़ जाती है और इस तरह प्रत्येक अच्छी तरह से धीरे-धीरे के लिए उपलब्ध समय संकल्प को कम कर देता है - यहां तक कि कला मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग के राज्य के लिए। ऐसी स्थितियों के तहत तेजी से और क्षणिक सेल प्रतिक्रियाएं माप से बच सकती हैं। इसके अलावा, पारंपरिक एक अच्छी तरह से - एक एकाग्रता दृष्टिकोण लिगांड-जीपीसीआर इंटरैक्शन विश्लेषण में उनकी उपयुक्तता के संबंध में छिद्रित अंग-ऑन-चिप या शरीर-ऑन-चिप विकास पर एक महत्वपूर्ण समय और लागत कारक लगाता है।

इस कारण से, हमने एक स्टेपवाइज खुराक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो सुसंस्कृत सेल मोनोलेयर में लिगांड-प्रेरित जीपीसीआर सक्रियण की पूर्ण खुराक-प्रतिक्रिया घटता की रिकॉर्डिंग को लगातार एक अच्छी तरह से की बाधा की निगरानी करके सक्षम बनाता है जबकि पीड़ावादी एकाग्रता में कदम से वृद्धि होती है। धारावाहिक एगोनिस्ट इसके अलावा प्रोटोकॉल काफी अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 10 या अधिक सांद्रता के लिए बढ़ जाती है, के रूप में मानव U-373 MG कोशिकाओं के वर्तमान उदाहरण पर दिखाया गया है, जो ईर्ष्या से हिस्टामाइन 1 रिसेप्टर (H1R) व्यक्त करते हैं । इस प्रकार, विधि में लेबल-मुक्त खुराक-प्रतिक्रिया अध्ययनों में थ्रूपुट में काफी सुधार करने की क्षमता है, जबकि समय संकल्प को महत्वपूर्ण अधिकतम पर बनाए रखा जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. इलेक्ट्रोड सरणी पर सेल सीडिंग

नोट: इलेक्ट्रोड लेआउट का चयन अध्ययन के तहत संवेदनशीलता और कोशिकाओं की संख्या के बीच एक व्यापार बंद है। इलेक्ट्रोड जितना छोटा होगा, माप उतना ही संवेदनशील होता है लेकिन छोटे अध्ययन के तहत कोशिकाओं की संख्या होती है। आधारभूत स्थितियों के तहत समय के साथ मजबूत बाधा उतार-चढ़ाव दिखाने वाली कोशिकाओं के लिए, बड़े या इंटरडिजिट इलेक्ट्रोड बेहतर हैं।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मानक सेल पासिंग और सीडिंग के लिए आवश्यक सभी समाधानपूर्व गर्म करें। मानव U-373 MG कोशिकाओं के साथ परख के लिए यह लेता है: कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना फॉस्फेट बफर खारा (PBS), 0.05% (w/v) ट्रिप्सिन, सेल कल्चर मीडियम (ईगल का मिनिमम मेग्निटिव मीडियम (ईएमईएम) 5% (v/v) भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 100 μg/mL पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक है।
  2. शेयर संस्कृति के सेल परत कुल्ला पारंपरिक सेल संस्कृति के तल पर उगाया दो बार PBS के साथ flasks या व्यंजन ।
  3. पीबीएस निकालें, ट्राइप्सिन समाधान (25 सेमी2के लिए 1 mL) जोड़ें और कोशिकाओं को 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (यू-373 एमजी कोशिकाओं पर लागू होता है)।
  4. माइक्रोस्कोपी द्वारा सस्ट्रेट विकास के नीचे से कोशिकाओं की पूरी टुकड़ी के लिए नियंत्रण।
  5. जैसे ही कोशिकाओं को सेल निलंबन के लिए ट्रिप्सिन के 1 मिलीग्राम प्रति सेल संस्कृति माध्यम के 9 मिलीग्राम जोड़कर पूरी तरह से अलग कर रहे हैं, ट्राइप्सिन प्रतिक्रिया बंद करो। सब्सट्रेट पर निलंबन को पाइप करके सेल संस्कृति सब्सट्रेट के नीचे से शेष कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक कुल्ला करें।
  6. एक पिपेट के साथ सेल निलंबन को इकट्ठा करें और इसे एक सेंट्रलिफायरेशन ट्यूब (15 एमएल या 50 एमएल ट्यूब) में स्थानांतरित करें।
  7. कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए 110 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें।
  8. कोशिकाओं की गिनती करने से पहले सुपरनेटेंट को सावधानी से हटा दें और सेल पेल को संस्कृति माध्यम में फिर से निलंबित करें (उदाहरण के लिए चरण विपरीत माइक्रोस्कोप और मैनुअल गिनती के लिए हेमाकिटोमीटर का उपयोग करके)।
  9. सेल निलंबन को वांछित सेल घनत्व में समायोजित करें। U-३७३ एमजी कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के लिए, ४८ घंटे के भीतर एक शंकुप्रवाह सेल परत विकसित करने के लिए १०० ००० कोशिकाओं/सेमी2 का उपयोग करें । यह ~ 0.8 सेमी2 के विकास क्षेत्र और 400 माइक्रोन की अच्छी मात्रा के साथ 8-अच्छी तरह इलेक्ट्रोड सरणी के लिए 200 000 कोशिकाओं/mL के सेल घनत्व का अनुवाद करता है।
    नोट: प्रजनन योग्य जीपीसीआर सक्रियण प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं को इलेक्ट्रोड सरणी पर मोनोलेयर को संधारामेंित करने के लिए उगाया जाना चाहिए। कोशिका की सतह पर उचित रिसेप्टर अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, प्रयोग करने से पहले कोशिकाओं को कम से कम 36 घंटे वरीयता दी जानी चाहिए। सेल सीडिंग के लिए विभिन्न सेल घनत्व का परीक्षण अक्सर सर्वोत्तम प्रयोगात्मक स्थितियों की पहचान करने के लिए सार्थक होता है।
  10. इलेक्ट्रोड सरणी के कुओं में सेल निलंबन जोड़ें और कुओं के तल पर कोशिकाओं के समरूप वितरण को सुनिश्चित करने के लिए 10 - 15 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर बसने बेचता है।
  11. 37 डिग्री सेल्सियस और आर्द्र वातावरण में 5% सीओ2 (मध्यम प्रकार पर निर्भर) के साथ एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कम से कम 36 एच के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं। प्रयोग से पहले सेल कल्चर मीडियम 24 एच बदलें।
  12. प्रयोग के दिन, कोशिकाओं के साथ इलेक्ट्रोड का पूरा कवरेज सुनिश्चित करने के लिए (चरण विपरीत) माइक्रोस्कोपी द्वारा इलेक्ट्रोड सरणी पर सेल परतों का निरीक्षण करें।

2. सीरम मुक्त माध्यम में कोशिकाओं की तुल्यता

  1. इस अध्ययन में पूर्व-गर्म सीरम-मुक्त माध्यम: लीबोविट्ज का L15 माध्यम।
  2. इलेक्ट्रोड सरणी पर उगाई जाने वाली कोशिकाओं से सेल कल्चर मीडियम निकालें और पूर्व-गरम सीरम-मुक्त माध्यम द्वारा प्रतिस्थापित करें। 8-अच्छी तरह से प्रारूप इलेक्ट्रोड सरणी के लिए 200 माइक्रोन का उपयोग करें, और 96-अच्छी तरह से इलेक्ट्रोड सरणी के लिए 150 माइक्रोन।
  3. कोशिकाओं को सीरम-मुक्त माध्यम में कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समतुल्य होने दें। समतुल्यता का समय दृढ़ता से कोशिका प्रकार पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, U-373 MG कोशिकाओं को 2 घंटे की आवश्यकता होती है, चो कोशिकाओं को 4 घंटे की आवश्यकता होती है, BAEC को एल-15 माध्यम में रातोंरात संतुलन की आवश्यकता हो सकती है।
    नोट: एल-15 माध्यम सीओ2 स्वतंत्र है और एक सीओ2मुक्त वातावरण की आवश्यकता है। एल-15 में संतुलन के लिए इनक्यूबेटर को 0% सीओ2में सेट किया गया । संतुलन बाधा रीडिंग, जो हम पहले प्रयोगों के लिए करने की सलाह द्वारा निगरानी की जा सकती है ।

3. बाधा रीडिंग के साथ निगरानी सेल संतुलन

  1. इलेक्ट्रोड सरणी को बाधा एनालाइजर के कनेक्टिंग व्यूह धारक में रखें।
  2. इलेक्ट्रोड और बाधा विश्लेषक के बीच उचित कम बाधा संपर्क सुनिश्चित करें। यह जांच विभिन्न उपकरणों के लिए व्यक्तिगत रूप से अलग है।
    नोट: यदि उपकरण इलेक्ट्रोड से कनेक्शन करने में विफल रहता है, तो संपर्क क्लैंप को फिर से खोलें, धारक के अंदर उचित स्थिति के लिए इलेक्ट्रोड सरणी को पुनः समायोजित करें और पुनः प्रयास करें।
  3. सॉफ्टवेयर के यूजर इंटरफेस से इलेक्ट्रोड टाइप और/या मल्टी-वेल फॉर्मेट का चयन करें ।
  4. माप मापदंडों की स्थापना करें। विभिन्न विकल्प उपलब्ध हैं।
    नोट: सबसे संवेदनशील एसी आवृत्ति का चयन करने के लिए, हम साहित्य और साधन मैनुअल का उल्लेख करते हैं क्योंकि यह अध्ययन के तहत इलेक्ट्रोड लेआउट और सेल प्रकार पर निर्भर करता है। आमतौर पर, संवेदन आवृत्ति 4 kHz - 50 kHz की सीमा में है। यहां, यू-३७३ एमजी कोशिकाओं को २५० माइक्रोन व्यास के परिपत्र काम इलेक्ट्रोड पर उगाया गया था और वे 12 kHz की एक एसी आवृत्ति पर निगरानी की गई ।
    1. यदि एकल और एकाधिक आवृत्ति डेटा अधिग्रहण मोड उपलब्ध हैं, तो अधिकतम समय संकल्प सुनिश्चित करने के लिए एकल आवृत्ति मोड का चयन करें। माप इस एकल आवृत्ति पर किया जाएगा। सबसे व्यापक रूप से प्रसारित उपकरणों के लिए, उपलब्ध आवृत्ति खिड़की के साथ कई पूर्व-सेट आवृत्तियां हैं।
    2. यदि अध्ययन के तहत कुओं की संख्या कम है या समय संकल्प महत्वपूर्ण नहीं है, तो इसके बजाय कई आवृत्ति रिकॉर्डिंग का चयन करें। आवृत्तियों की एक निर्दिष्ट संख्या में बाधा रीडिंग बाद में गहराई से विश्लेषण के लिए हर अच्छी तरह से दर्ज की जाएगी ।
      नोट: समय संकल्प प्रति अच्छी तरह से दर्ज आवृत्तियों की बढ़ती संख्या और कुओं की बढ़ती संख्या के साथ कम हो जाती है । आवृत्ति और डेटा अधिग्रहण मोड चयन के विकल्प साधन प्रकार और संस्करण के साथ भिन्न होते हैं।
  5. टाइम कोर्स डेटा का अधिग्रहण शुरू करें।
  6. कोशिका परत बाधा (कम से कम 2 घंटे) का पालन करें जब तक बाधा स्थिर हो गई है। इस दौरान एगोनिस्ट सॉल्यूशंस तैयार करें।
  7. जब सेल परतें एक स्थिर बाधा स्तर पर पहुंच जाती हैं, तो या तो (i) एक ही प्रयोग के भीतर धारावाहिक एगोनिस्ट अतिरिक्त पर आगे बढ़ें या (ii) डेटा अधिग्रहण को समाप्त करें और एगोनिस्ट-प्रेरित रिसेप्टर सक्रियण की निगरानी के लिए एक नया डेटासेट शुरू करें।

4. एगोनिस्ट मोड में प्रयोगों के लिए पीड़ावादी समाधान तैयार करना

  1. समीकरण (1) के अनुसार धारावाहिक खुराक के प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक एगोनिस्ट समाधानों की एकाग्रता की गणना करें। n 1 से लेकर धारावाहिक परिवर्धन की कुल संख्या तक है। एक्स चरण एन वाई पर अच्छी तरह से एकाग्रता और मात्रा को दर्शाता है, जो चरण एन में "समाधान-टू-जोड़ा" की एकाग्रता और मात्रा को दर्शाता है।

Equation 1

नोट: प्रतिकृति की संख्या पर विचार करें और प्रत्येक एकाग्रता चरण के लिए "समाधान-से-जोड़ा" की कुल मात्रा की गणना करें। टेबल 1-4में एक विशिष्ट गणना के परिणाम दिए जाते हैं। यह पीड़ावादी एकाग्रता सीमा के बारे में एक सामान्य विचार लेता है क्योंकि इस का अध्ययन किया जाना चाहिए क्योंकि श्रेणी सीरियल अतिरिक्त के दौरान प्रशासित किए जाने वाले भागों की सांद्रता और संख्या को परिभाषित करती है। धारावाहिक एगोनिस्ट इसके अलावा प्रोटोकॉल का उपयोग करके पीड़ावादी एकाग्रता में कदम की वृद्धि हुई है। इसलिए, अगली खुराक जोड़े जाने पर पहले से ही एगोनिस्ट की मात्रा को ध्यान में रखना होगा। जब पहले से ही कुएं में मौजूद एगोनिस्ट अणुओं की संख्या एनएक्स = सीएक्स एक्स एक्स 'वीएक्स) और अगले अतिरिक्त के बाद कुएं में अणुओं की संख्या एन एक्स +वाईहै, तो अणुओं की संख्या एनवाई को जोड़ने के लिए अच्छी तरह से लागू होने वाले समाधान की एकाग्रता सीवाई और वॉल्यूम वीवाई द्वारा निर्धारित की जातीहै। एगोनिस्ट के एक हिस्से को जोड़ने के बाद, कुएं में एगोनिस्ट अणुओं की नई मात्रा है: सीएक्स + वाई * वी एक्स +वाई = सीएक्स +सी वाई * वीवाई। यह गणना प्रत्येक बाद के चरण के लिए लागू होती है। अच्छी तरह से पीड़ावादी एकाग्रता की परस्पर निर्भरता और प्रत्येक चरण के साथ जोड़े जाने वाले भागों में एगोनिस्ट की मात्रा के कारण, प्रत्येक चरण के बाद अंतिम सांद्रता को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है।

मोड 1: तरल लगातार जोड़ा जाता है के रूप में प्रत्येक कदम के साथ अच्छी तरह से मात्रा में वृद्धि होगी।
इस मोड और 8-वेल फॉर्मेट का उपयोग करके, वीx1 = 200 माइक्रोन और वीy1 .... Vyi = 30 μL का उपयोग करें।

मोड 2: कुएं में मात्रा स्थिर है क्योंकि प्रत्येक चरण के साथ जोड़ी गई मात्रा को बाद के अतिरिक्त से ठीक पहले हटा दिया जाता है।
इस मोड और 96-वेल प्रारूप का उपयोग करके, वीx1 = 150 माइक्रोन और वीy1 .... Vyi = 75 μL का उपयोग करें।

  1. प्रति एकाग्रता और पाइपिंग के लिए विस्तृत निर्देशों के अनुसार कुल मात्रा के साथ डेटा शीट प्रिंट करें।
  2. आवश्यक राशि में सभी समाधान तैयार करें। कोशिकाओं के संतुलन के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही सीरम-मुक्त माध्यम में सभी पीड़ावादी समाधान बनाएं।
    सावधानी: हिस्टामाइन डाइहाइड्रोक्लोराइड को 2012 ओशा हैज़र्ड कम्युनिकेशन स्टैंडर्ड (29 सीएफआर 1910.1200) द्वारा खतरनाक माना जाता है। हिस्टामाइन के कारण त्वचा में जलन, आंखों में गंभीर जलन, एलर्जी त्वचा की प्रतिक्रिया, एलर्जी, अस्थमा के लक्षण या सांस लेने में दिक्कतें हो सकती हैं यदि सांस ली जाती है और सांस में जलन हो सकती है। सेफ्टी डाटा शीट पर विचार करें।
    नोट: पीड़ावादी समाधान यथासंभव ताजा करें। समाधान में पीड़ावादियों की स्थिरता काफी भिन्न हो सकती है। प्रयोग में उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे समाधान स्टोर करें। कुछ अणुओं के लिए अतिरिक्त स्थिर योजक, बीएसए की तरह जब पेप्टाइड आधारित या लिपिड आधारित अणुओं का उपयोग कर, कुओं और ट्यूबों की दीवारों के लिए अवशोषण को रोकने के लिए विचार किया जा सकता है ।
  3. यदि 96-अच्छी तरह से प्रारूप में प्रयोग कर रहे हैं, तो एक पारंपरिक 96-अच्छी प्लेट (कोई इलेक्ट्रोड) के समाधान स्थानांतरित करें और इलेक्ट्रोड सरणी में त्वरित तरल हस्तांतरण के लिए 8-(या 12-) चैनल पाइप का उपयोग करें।

5. विरोधी मोड में प्रयोग के लिए एगोनिस्ट समाधान की तैयारी

नोट: पूरे लागू होने वाली एकाग्रता के साथ विरोधी समाधान (एस) तैयार करें। विरोधी समाधान की मात्रा और एकाग्रता एगोनिस्ट अतिरिक्त (1 या 2) के मोड पर निर्भर करती है। इसके अलावा मोड 2 में 8-वेल या 96-वेल प्रारूप में प्रयोगों के लिए उदाहरण: (ए) 8-अच्छी तरह से प्रारूप (Vx1 = 200 μL, Vविरोधी = 200 μL); (ख) 96-अच्छी तरह से प्रारूप (Vx1 = 150 μL, वीविरोधी = 75 μL)।

  1. चरण 4.1 में वर्णित धारावाहिक खुराक के प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक प्रत्येक एगोनिस्ट समाधान की एकाग्रता की गणना करें।
  2. कोशिकाओं के संतुलन के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही सीरम-मुक्त माध्यम में सभी एगोनिस्ट समाधान बनाएं और प्रयोग में संबंधित कुओं के लिए योजना बद्ध के रूप में उसी अंतिम एकाग्रता पर विरोधी जोड़ें।
    नोट: इस मामले में हिस्टामाइन स्टॉक सॉल्यूशन (10 एमएम) एल-15 मीडियम में तैयार किया जाता है। जब एगोनिस्ट अन्य सॉल्वैंट्स (उदाहरण के लिए, डाइमेथिल सल्फ़ोफ़िड (डीएसओ), इथेनॉल) में भंग हो जाते हैं, तो इसके प्रत्येक चरण के साथ बढ़ते सॉल्वेंट लोड के लिए एक सॉल्वेंट नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए।

6. एगोनिस्ट मोड में सीरियल इसके अलावा प्रोटोकॉल का प्रदर्शन

  1. 3.1 - 3.5 चरणों में वर्णित डेटा अधिग्रहण शुरू करें।
  2. इसके अलावा 10 - 15 मिन के बारे में इनक्यूबेटर में रखकर उपयोग करने से पहले एगोनिस्ट समाधान पूर्व गर्म करें।
    नोट: थर्मो-लेबिल पदार्थों का उपयोग करते समय, समाधान बहुत लंबे समय तक 37 डिग्री सेल्सियस पर नहीं रखना चाहिए। यदि 10 - 15 मिन के लिए पूर्व वार्मिंग महत्वपूर्ण माना जाता है, तो पानी के स्नान में इसके अलावा शीघ्र ही 37 डिग्री सेल्सियस तक समाधान लाएं।
  3. चयनित इसके अलावा मोड पर निर्भर एगोनिस्ट धारावाहिक खुराक चलाएं। निम्नलिखित मोड 1 अगली खुराक के प्रत्येक अतिरिक्त के साथ अच्छी तरह से बढ़ जाती है। मोड 2 में एक ही वॉल्यूम जो प्रत्येक चरण के साथ जोड़ा जाता है, अगले उच्च खुराक को जोड़ने से ठीक पहले फिर से हटा दिया जाता है।
    नोट: दो बाद के एगोनिस्ट खुराक के बीच में सेल परत के संतुलन के लिए आवश्यक समय कोशिकाओं की प्रतिक्रिया समय पर निर्भर करता है । समानांतर मोड में एक प्रारंभिक प्रयोग (एक अच्छी तरह से - एक एकाग्रता) विभिन्न पीड़ावादी सांद्रता के लिए (i) सेल प्रतिक्रिया समय का पता चलता है और (ii) सबसे संवेदनशील वक्र पैरामीटर (जैसे, अधिकतम बाधा, समय एक्स के बाद बाधा)।

एक: मोड 1 / 8-अच्छी तरह से प्रारूप

  1. सीरम-मुक्त माध्यम के 200 μL में समतुल्य कोशिकाओं के लिए एगोनिस्ट की सबसे कम एकाग्रता के साथ पहले समाधान के 30 μL जोड़ें।
  2. कोशिकाओं को पूर्व-परिभाषित अवधि (जैसे, 15 min) के लिए प्रतिक्रिया और समान होने दें।
  3. अगले उच्च एकाग्रता के साथ दूसरे समाधान के 30 μL जोड़ें।
  4. तीसरे, चौथे, और इतने पर, पीड़ावादी समाधान के साथ चरण 6.3.1-6.3.3 दोहराएं।
    नोट: 10 एकाग्रता चरणों के साथ काम करने से प्रयोग के अंत में कुल मात्रा 500 माइक्रोन होगी, जो ~ 550 माइक्रोन के इन कुओं की अधिकतम लागू मात्रा से ठीक नीचे है।

बी: मोड 2 / 96-अच्छी तरह से प्रारूप

नोट: प्रत्येक तरल हैंडलिंग चरण (इसके अलावा/हटाने) के दौरान डेटा अधिग्रहण को बाधा उपकरण के सॉफ्टवेयर के माध्यम से रोकें जब 96-अच्छी तरह से प्रारूप में प्रयोग चला रहे हैं। अधिक विस्तृत तरल हैंडलिंग डेटा अधिग्रहण में हस्तक्षेप कर सकती है। मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें।

  1. डेटा अधिग्रहण को रोकें।
  2. सीरम-मुक्त माध्यम के 150 माइक्रोन में समतुल्य कोशिकाओं के लिए एगोनिस्ट की सबसे कम एकाग्रता के साथ पहले समाधान के 75 μL जोड़ें।
  3. डेटा अधिग्रहण फिर से शुरू करें।
  4. कोशिकाओं को पूर्व-परिभाषित अवधि (जैसे, 15 min) के लिए प्रतिक्रिया और समान होने दें।
  5. नियमित संतुलन समय समाप्त होने से पहले लगभग 1 - 2 मिन, माप को रोकें और प्रत्येक कुएं से 75 माइक्रोन हटा दें।
    नोट: जिस समय बिंदु पर समाधान हटाया जाना चाहिए वह समानांतर और पाइपिंग गति में निगरानी किए गए कुओं की संख्या पर निर्भर करता है। समाधान ों को हटाने के लिए आवश्यक समय बाद के चरणों के बीच समय से अधिक नहीं होना चाहिए।
  6. अगले उच्च एकाग्रता के साथ दूसरे समाधान के 75 μL जोड़ें और माप फिर से शुरू करें।
  7. तीसरे, चौथे, और इतने पर, पीड़ावादी समाधान के साथ चरण 6.3.8-6.3.10 दोहराएं।

7. विरोधी मोड में धारावाहिक इसके अलावा प्रोटोकॉल प्रदर्शन

  1. 3.1 - 3.5 चरणों में वर्णित माप शुरू करें।
  2. कोशिका परतों के समतुल्यता के दौरान, विरोधी समाधान तैयार करें (उदाहरण के लिए, L15 मध्यम में 1.5 माइक्रोएम डिफेनहाइड्रियाइन हाइड्रोक्लोराइड का 200 माइक्रोन)।
    सावधानी: डिफेनहाइड्राइन हाइड्रोक्लोराइड में संभावित तीव्र स्वास्थ्य प्रभाव होते हैं। यदि निगल या साँस लिया जाता है तो यह हानिकारक है, आंखऔर त्वचा में जलन हो सकती है। इससे सांस और पाचन तंत्र में जलन हो सकती है। सेफ्टी डाटा शीट पर विचार करें।
  3. सेल संस्कृतियों (cf. 6.2) के अलावा लगभग 10 - 15 मिन में रखकर विरोधी और एगोनिस्ट समाधानों को पूर्व-गर्म करें। यदि विरोधी मुक्त कुओं को परख में भी शामिल किया जाता है, तो पूर्व-गर्म सीरम मुक्त माध्यम भी।
  4. नामित कुओं में विरोधी समाधान जोड़ें। कोशिकाओं को 15 - 20 मिन के लिए विरोधी के साथ समतुल्य करते हैं। यदि विरोधी मुक्त कुओं को शामिल किया जाता है, तो इन कुओं में सीरम-मुक्त माध्यम की एक ही मात्रा जोड़ें।
  5. मोड 2में विरोधी इसके अलावा के अनुसार, कुओं से समाधान निकालें
    (क) 8-अच्छी तरह से प्रारूप (200 μL)
    (ख) 96-वेल प्रारूप (75 माइक्रोन)
  6. 6.3 चरण में वर्णित एगोनिस्ट इसके अलावा अनुक्रम चलाएं।

8. डेटा निर्यात और विश्लेषण

  1. मालिकाना से सभी रिकॉर्ड किए गए डेटा को सामान्य डेटा प्रारूपों (जैसे, सीएसवी) में परिवर्तित करने के लिए बाधा उपकरण के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा का निर्यात करें। यह कदम अन्य सॉफ्टवेयर पैकेजों के साथ डेटा री-ऑर्गनाइजेशन और प्रस्तुति के लिए अनुमति देता है।
  2. सीएसवी-स्वरूपित डेटा को वैज्ञानिक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लोड करें।
  3. एगोनिस्ट समाधान के पहले अतिरिक्त से पहले अंतिम डेटा बिंदु की बाधा को घटाकर और टी = 0 के अतिरिक्त समय निर्धारित करके बाधा मूल्यों को सामान्य करें। सामान्यीकृत बाधा के समय पाठ्यक्रम की साजिश करें।
  4. व्यक्तिगत समय पाठ्यक्रमों की साजिश और प्रत्येक अतिरिक्त चरण के बाद बाधा में अधिकतमा की पहचान । इन मूल्यों के साथ एक डेटा शीट की रचना करें।
  5. अधिकतम (या न्यूनतम, यदि लागू हो) बाधा के मूल्यों को एगोनिस्ट एकाग्रता के कार्य के रूप में बदलता है। यह व्यक्तिगत कुओं के लिए या औसत के लिए किया जा सकता है (मतलब ± एसडी)।
  6. चार पैरामीटर लॉजिस्टिक मॉडल (समीकरण 2) का उपयोग करके आधा अधिकतम प्रभावी सांद्रता (ईसी50)और अधिकतम प्रतिक्रिया (ईमैक्स)निर्धारित करने के लिए डेटा फिटिंग दिनचर्या का उपयोग करें:

Equation 2

नोट: सी एगोनिस्ट एकाग्रता इंगित करता है, एक1 न्यूनतम है और 2 सिग्मोइडल खुराक-प्रतिक्रिया वक्र(ए2 = ईमैक्स)का अधिकतम असिक है। चुनाव आयोग50 वक्र के मोड़ बिंदु पर एकाग्रता है, और एन पहाड़ी ढलान से मेल खाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विभिन्न एगोनिस्ट समाधान तैयार करने के लिए एक विशिष्ट योजना को टेबल 1-4में एगोनिस्ट के रूप में हिस्टामाइन के साथ 8-अच्छी तरह से इलेक्ट्रोड सरणी का उपयोग करके प्रयोग के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा मोड 1 (cf., Figure 1)का उपयोग करके एक प्रयोग के लिए तालिका 1 और तालिका 2 वर्तमान संस्करण और सांद्रता, जबकि तालिका 3 और तालिका 4 वर्तमान संस्करणों और इसके अलावा मोड 2 (cf., चित्रा 1)के बाद एक प्रयोग के लिए सांद्रता । डेटा की गणना समीकरण (1) का उपयोग करके की गई है।

यू-373 एमजी कोशिकाओं की समप्रवाह परतों के लिए चित्रा 2 में एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है, जो अंतर्जात रूप से हिस्टामाइन 1 रिसेप्टर को व्यक्त करता है, जो एगोनिस्ट के रूप में हिस्टामाइन का उपयोग करके हिस्टामाइन व्यास के कामकाजी इलेक्ट्रोड के साथ 8-अच्छी तरह से इलेक्ट्रोड सरणी पर उगाया जाता है। माप 12 kHz की एक आवृत्ति पर किया गया था। एगोनिस्ट एकाग्रता श्रृंखला के अलावा मोड 1के बाद किया गया था । चयनित प्रयोग में हिस्टामाइन एकाग्रता बढ़ाने के साथ 10 समाधान (चरण 4 के अनुसार तैयार) क्रमिक रूप से हर 15 मिन(चित्रा 2ए)जोड़े गए थे। सीरियल डोजिंग योजना के तहत आठ में से सात कुओं में आवेदन किया गया था। एक अच्छी तरह से एगोनिस्ट-मुक्त माध्यम (एल-15) में क्रमिक रूप से दस चरणों में से नौ में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जोड़ा गया था। इस नियंत्रण के लिए अंतिम इसके अलावा एक हिस्टामाइन समाधान था जो कुएं में 100 माइक्रोन हिस्टामाइन की अंतिम एकाग्रता प्रदान करता था। डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ की साजिश रची गई है और बाधा परिवर्तन के रूप में दिखाया गया है । जेड. 12 kHz/kΩ प्रयोग के साथ, बाधा परिवर्तन और पहले इसके अलावा के समय बिंदु के साथ शूंय करने के लिए सेट किया जा रहा है । 2 घंटे के प्रायोगिक बफर में प्रारंभिक समतुल्यता समय इस भूखंड में नहीं दिखाया गया है। एगोनिस्ट जोड़ के समय बिंदु तीर से इंगित किए जाते हैं।

डेटा कर्सर का उपयोग करके घटता से प्रत्येक एकाग्रता चरण निकाले जाने के बाद बेसलाइन के सापेक्ष बाधा में परिवर्तन। कोई स्पष्ट अधिकतम के साथ कदम पर, अगले इसके अलावा से पहले पिछले डेटा बिंदु विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था । बाधा परिवर्तन । जेड. 12 kHz हिस्टामाइन एकाग्रता (सीx+ y)(चित्रा 2बी,प्रतीकों) के एक समारोह के रूप में साजिश रची गई थी । चार पैरामीटर लॉजिस्टिक मॉडल (सीएफ स्टेप 8.6) के ट्रांसफर फंक्शन को सात कुओं(चित्रा 2बी,लाइनों) से प्रायोगिक डेटा बिंदुओं पर फिट किया गया था। फिट परिणाम तालिका 5में दिखाए जाते हैं । चित्रा 2सी और चित्रा 2डी सात कुओं के लिए मतलब ± एसडी पेश करने के लिए चित्रा 2ए और फिगर 2बीमें डेटा औसत का परिणाम दिखाते हैं। औसत समय पाठ्यक्रम डेटा चित्रा 2सीमें संक्षेप में है, जबकि औसत खुराक प्रतिक्रिया वक्र चित्रा 2डीमें प्रदान की जाती है ।

खुराक प्रतिक्रिया संबंधों में जैसा कि चित्रा 2बी, डीमें दिखाया गया है, फिटिंग प्रक्रिया पूरी एकाग्रता सीमा पर लागू की गई थी जो ईसी50 = (0.86 ± 0.13) माइक्रोन लौटा रही थी। बाधा प्रतिक्रिया पिछले दो एकाग्रता चरणों (30 μM, 100 μM अंतिम एकाग्रता) को छोड़कर हिस्टामाइन एकाग्रता बढ़ाने के साथ नीरस रूप से बढ़ जाती है। इस प्रतिक्रिया को संभवतः हिस्टामाइन रिसेप्टर, असंवेदीकरण या कोशिकाओं की अधिक उत्तेजना (चर्चा देखें) के डाउनरेगुलेशन द्वारा समझाया गया है। इस प्रभाव के लिए, विश्लेषण के लिए डेटा रेंज को कम कर दिया गया है, जैसा कि चित्र 2में दिखाए गए डेटा से चुने गए एक धारावाहिक खुराक प्रयोग(चित्रा 3;अच्छी तरह से 1) के लिए दिखाया गया है । इसके अलावा, 0 μM हिस्टामाइन के जवाब में कोई बाधा परिवर्तन नहीं मानते हुए कम से कम वर्ग अनुकूलन के दौरान कम asymptote(ए1)को शून्य करने के लिए स्थापित करना अच्छी तरह से उचित है। इस तीन पैरामीटर अनुकूलन लागू करने से ईसी50 (0.75 ± 0.12) माइक्रोन (सीएफ, चित्रा 3बी)प्रदान करता है। चुनाव आयोग५० मूल्यों को डेटा विश्लेषण मोड में से किसी के लिए असंवेदनशील पाया गया और काफी अलग नहीं थे ।

96-अच्छी प्लेट प्रयोग के लिए विशिष्ट परिणाम चित्र 4में संक्षेप में दिए गए हैं। यू-373 एमजी कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से इलेक्ट्रोड सरणी पर उगाया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है। माप में 32 कुएं शामिल थे। 8 कुओं पीड़ावादी मुक्त नियंत्रण के रूप में सेवा की, केवल माध्यम के संपर्क में । 24 कुओं की गणना की और इसके अलावा मोड 2 के लिए तैयार बढ़ती हिस्टामाइन सांद्रता की एक श्रृंखला के अधीन थे । आंकड़ा 4एमें सभी 32 व्यक्तिगत कुओं के लिए बाधा परिवर्तन का समय दिखाया गया है । घटता में से एक (लाल रंग में प्रकाश डाला) एक असामान्य समय पाठ्यक्रम से पता चलता है और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा गया था। तदनुसार, 23 कुओं से डेटा औसत और चित्रा 4बीमें औसत बाधा परिवर्तन (मतलब ± एसडी) के समय पाठ्यक्रम के रूप में साजिश रची गई । प्रत्येक व्यक्तिवक्र खुराक प्रतिक्रिया संबंध के लिए ऊपर वर्णित के रूप में विश्लेषण किया गया था । डेटा अंक औसत और अंतिम हिस्टामाइन एकाग्रता(चित्र4सी)के कार्य के रूप में साजिश रची गई । खुराक-प्रतिक्रिया डेटा चार पैरामीटर लॉजिस्टिक मॉडल के माध्यम से विश्लेषण किया गया था, जिसने (1.0 ± 0.3) माइक्रोन का औसत ईसी50 मूल्य लौटाया।

विरोधी मोड में धारावाहिक एगोनिस्ट इसके अलावा प्रोटोकॉल के लिए एक विशिष्ट परिणाम चित्रा 5में दिखाया गया है । यहां, एक अच्छी तरह से पहले हिस्टामाइन रिसेप्टर विरोधी diphenhydramine (लाल वक्र) 20 मिन के ०.७५ μM के साथ पूर्व इलाज किया गया था पहले हिस्टामाइन जोड़ा गया था(चित्रा 5ए)। नियंत्रण विरोधी मुक्त माध्यम (नीला वक्र) प्राप्त किया । विरोधी मोड 2के बाद जोड़ा गया था, जिसका अर्थ है कि अंत में 400 μL के 200 μL एगोनिस्ट श्रृंखला लागू होने से पहले हटा दिया गया था। ऊपर दिए गए उदाहरणों में वर्णित धारावाहिक खुराक मोड 1 के बाद एगोनिस्ट (हिस्टामाइन) जोड़ा गया था। विरोधी मोड में प्रयोगों के लिए यह महत्वपूर्ण है कि प्रयोग के पूरे समय के दौरान विरोधी एकाग्रता को स्थिर रखा जाता है। तदनुसार, कुएं में जोड़े गए सभी एगोनिस्ट समाधानों में पूर्व-परिभाषित विरोधी एकाग्रता (इस मामले में, 0.75 माइक्रोन) भी शामिल होनी चाहिए, जबकि नियंत्रण विरोधी-मुक्त रहता है। एक विरोधी प्रभाव एक सेल प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए आवश्यक उच्च पीड़ावादी सांद्रता के अनुरूप धारावाहिक खुराक योजना के भीतर बाधा की "विलंबित" वृद्धि से स्पष्ट हो जाता है। खुराक-प्रतिक्रिया संबंध में विरोधी का प्रभाव घटता है, जो चुनाव आयोग५०में वृद्धि से मेल खाती है की एक दक्षिणपंथी बदलाव के रूप में व्यक्त की है, बशर्ते विरोधी एक प्रतिस्पर्धी लिगामेंट एगोनिस्ट(चित्रा 5बी)के सापेक्ष है । चुनाव आयोग50 विरोधी और (14.7 ± 0.6) माइक्रोन की उपस्थिति में (0.92 ± 0.05) माइक्रोन के लिए निर्धारित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: धारावाहिक पीड़ावादी इसके अलावा मोड। (A)एकाग्रता गणना को दर्शाती योजनाबद्ध। मात्रा वीएक्स और एगोनिस्ट एकाग्रता सीएक्सके साथ एक अच्छी तरह से एकाग्रता सीवाई और वॉल्यूम वीवाई के पीड़ावादी समाधान को जोड़कर, मात्रा वी एक्स+ वाई तक बढ़ जाती है और सी एक्स+ वाईतक एकाग्रता बढ़ जाती है। (ख)धारावाहिक पीड़ावादी इसके अलावा के लिए दो अलग मोड । मोड 1: अच्छी तरह से वीx+ y में कुल मात्रा प्रत्येक अतिरिक्त के साथ बढ़ जाती है। मोड 2: अगली खुराक जोड़ने से पहले प्रत्येक एकाग्रता चरण पर जोड़े गए वॉल्यूम को फिर से हटा दिया जाता है, जो कुल मात्रा को अच्छी तरह से स्थिर रखता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 8-अच्छी तरह से प्रारूप में एक विशिष्ट प्रयोग के परिणाम। (A)250 माइक्रोन व्यास के परिपत्र कार्य इलेक्ट्रोड पर उगाई जाने वाली कन्फ्लोरेंट यू-373 एमजी सेल परतों के लिए 12 किलोवाट में बाधा परिवर्तन का समय पाठ्यक्रम। आठ कुओं में से सात में हिस्टामाइन के सीरियल जोड़ के लिए आवेदन किया गया था । एक अच्छी तरह से (ग्रे वक्र) क्रमिक रूप से प्रत्येक चरण (मोड 1) पर हिस्टामाइन-मुक्त बफर के साथ भरी हुई थी, अंतिम चरण को छोड़कर जब 100 माइक्रोन हिस्टामाइन को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में जोड़ा गया था। (ख)प्रत्येक एकाग्रता चरण के बाद सात व्यक्तिगत कुओं के लिए आधार रेखा के सापेक्ष अधिकतम बाधा परिवर्तन से उत्पन्न खुराक-प्रतिक्रिया संबंध। (ग)बाधा परिवर्तन का औसत समय पाठ्यक्रम (मतलब ± एसडी) सात व्यक्तिगत कुओं से उत्पन्न के रूप में(ए)में दिखाया गया है । (D)व्यक्तिगत डेटा सेट ों से उत्पन्न औसत खुराक-प्रतिक्रिया संबंधोंमें दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: डेटा विश्लेषण मोड का अनुकूलन। (क)250 माइक्रोन व्यास के परिपत्र कार्य इलेक्ट्रोड पर उगाई जाने वाली एकल संधाराप्रवाह यू-373 एमजी सेल परत के लिए 12 किलोवाट में बाधा परिवर्तन का विशिष्ट समय पाठ्यक्रम। (ख)प्रत्येक एकाग्रता वृद्धि के बाद आधाररेखा के सापेक्ष अधिकतम बाधा परिवर्तन से उत्पन्न प्रायोगिक खुराक-प्रतिक्रिया संबंध (भरे हुए प्रतीक) । या तो पूर्ण डेटा सेट फिटिंग प्रक्रिया (काले और ग्रे वक्र) या अंतिम डेटा बिंदु के अधीन था-रिसेप्टर desensitization और/या आंतरिककरण की शुरुआत का संकेत-मात्रात्मक विश्लेषण (लाल और मजेंटा वक्र) से छोड़ दिया गया था । कम से कम वर्ग अनुकूलन (काले और लाल वक्र) या पैरामीटर A1 के दौरान सभी चार मापदंडों को समायोजित किया गया था, जो कम असिक्टोट का प्रतिनिधित्व करता है, को शून्य (ग्रे और मजेंटा वक्र) के लिए सेट और तय किया गया था। चुनाव आयोग५० मूल्यों को दो डेटा विश्लेषण मोड के लिए काफी अलग नहीं थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: 96-अच्छी तरह से प्रारूप में विशिष्ट प्रयोग। (A)96-वेल इलेक्ट्रोड सरणी पर उगाई जाने वाली कन्फ्लोरेंट यू-373 एमजी सेल परतों के लिए 12 किलोवाट में मापा गया बाधा परिवर्तन का समय पाठ्यक्रम। 32 कुओं के लिए डेटा दिखाया गया है। 24 कुओं को प्रत्येक चरण के बीच 15 मिन के एक समतुल्य समय के साथ जोड़ा हिस्टामाइन सांद्रता बढ़ाने की एक श्रृंखला के अधीन थे । लाल रंग में प्रकाश डाला वक्र औसत से बाहर रखा गया था । आठ कुओं (नियंत्रण) को इसके प्रत्येक समय में हिस्टामाइन-मुक्त माध्यम से इलाज किया गया था। (ख)हिस्टामाइन सीरियल अलावा और आठ नियंत्रण कुओं के जवाब में 23 व्यक्तिगत कुओं के लिए औसत बाधा परिवर्तन का समय पाठ्यक्रम(ए)में दिखाया गया है । (C)प्रत्येक एकाग्रता वृद्धि (मतलब ± एसडी) के बाद बेसलाइन के सापेक्ष अधिकतम बाधा परिवर्तन से उत्पन्न औसत खुराक-प्रतिक्रिया संबंध। डाटा में चार पैरामीटर लॉजिस्टिक फंक्शन लगे थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: विरोधी मोड में विशिष्ट प्रयोग। (A)250 माइक्रोन व्यास के परिपत्र कार्य इलेक्ट्रोड पर उगाई जाने वाली 12 किलोवाट में बाधा परिवर्तन का समय पाठ्यक्रम हिस्टामाइन रिसेप्टर विरोधी डिफेनहाइहाइड्ड्रियाइन की उपस्थिति के साथ या बिना हिस्टामाइन की सांद्रता बढ़ाने पर 250 माइक्रोन व्यास के परिपत्र कार्य पर उगाया गया। एगोनिस्ट सीरियल डोजिंग शुरू होने से पहले डिफेनहाइड्राइन (0.75 माइक्रोन) या विरोधी मुक्त माध्यम (L15) को 20 मिन जोड़ा गया था। (ख)में दिखाए गए डेटा (ए) से प्रत्येक एकाग्रता वृद्धि के बाद बेसलाइन के सापेक्ष अधिकतम बाधा परिवर्तन से उत्पन्न खुराक-प्रतिक्रिया संबंध। 0.75 माइक्रोएम डिफेनहाइड्रियाइन की उपस्थिति ने ईसी50 को (0.92 ± 0.05) माइक्रोएम से (14.7 ± 0.6) माइक्रोन तक बढ़ा दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समाधान # सीएक्स+ वाई (μM) सीएक्स (μM) वीएक्स (μL) वीx+y (μL) Vy (μL) cy (μM)
1 0.01 0 200 230 30 0.08
2 0.1 0.01 230 260 30 0.79
3 0.3 0.1 260 290 30 2.03
4 1 0.3 290 320 30 7.77
5 3 1 320 350 30 24.33
6 10 3 350 380 30 91.67
7 30 10 380 410 30 283.33
8 100 30 410 440 30 1056.67

तालिका 1: अतिरिक्त मोड 1 के बाद 8-अच्छी इलेक्ट्रोड सरणी का उपयोग करप्रयोगों के लिए एकाग्रता गणना योजना।

समाधान # cy (μM) Vy (μL) से बनाओ ग (μM) कमजोर पड़ने का कारक कुल वी (μl) बनाओ उपयोग (μl) जोड़ें वी (μl)
1 0.08 30 3 2.03 26.52 600 22.6 577.4
2 0.79 30 4 7.77 9.83 600 61 539
3 2.03 30 5 24.33 11.97 600 50.1 549.9
4 7.77 30 6 91.67 11.8 600 50.8 549.2
5 24.33 30 7 283.33 11.64 600 51.5 548.5
6 91.67 30 8 1056.67 11.53 600 52.1 547.9
7 283.33 30 8 1056.67 3.73 600 160.9 439.1
8 1056.67 30 10 एमएम स्टॉक 10000 9.46 800 84.5 715.5

तालिका 2: अतिरिक्त मोड 1 के बाद 8-अच्छी इलेक्ट्रोड सरणी का उपयोग करके प्रयोगों के लिए पाइपटिंग योजना।

समाधान # सीएक्स+ वाई (μM) सीएक्स (μM) वीएक्स (μL) वीx+y (μL) Vy (μL) cy (μM)
1 0.01 0 200 400 200 0.02
2 0.1 0.01 200 400 200 0.19
3 0.3 0.1 200 400 200 0.5
4 1 0.3 200 400 200 1.7
5 3 1 200 400 200 5
6 10 3 200 400 200 17
7 30 10 200 400 200 50
8 100 30 200 400 200 170

तालिका 3: अतिरिक्त मोड 2 के बाद 8-अच्छी इलेक्ट्रोड सरणी का उपयोग करप्रयोगों के लिए एकाग्रता गणना योजना।

समाधान # cy (μM) Vy (μL) से बनाओ ग (μM) कमजोर पड़ने का कारक कुल वी (μl) बनाओ उपयोग (μl) जोड़ें वी (μl)
1 0.02 200 3 0.5 25 1000 40 960
2 0.19 200 4 1.7 8.95 1000 111.8 888.2
3 0.5 200 5 5 10 1000 100 900
4 1.7 200 6 17 10 1000 100 900
5 5 200 7 50 10 1000 100 900
6 17 200 8 170 10 1000 100 900
7 50 200 8 170 3.4 1000 294.1 705.9
8 170 200 200 माइक्रोएम स्टॉक 200 1.18 1300 1105 195

तालिका 4: अतिरिक्त मोड 2 के बाद 8-अच्छी इलेक्ट्रोड सरणी का उपयोग करके प्रयोगों के लिए पाइपिंग योजना।

अच्छा ईसी50 ईअधिकतम (= एक2) ए1 एन
(μM) (kω) (ω)
1 0.9 ± 0.1 1680 ± 70 150 ± 80 1.9 ± 0.5
2 0.7 ± 0.2 1770 ± 90 200 ± 140 1.3 ± 0.4
3 0.6 ± 0.2 1700 ± 100 60 ± 250 1.1 ± 0.5
4 0.6 ± 0.2 2000 ± 100 140 ± 180 1.3 ± 0.4
5 0.9 ± 0.1 1810 ± 60 160 ± 80 1.4 ± 0.3
6 0.8 ± 0.1 1950 ± 70 200 ± 110 1.3 ± 0.3
7 0.6 ± 0.3 1700 ± 200 260 ± 250 1.6 ± 1.0
1 – 7 0.7 ± 0.2 1900 ± 100 100 ± 100 1.1 ± 0.2

तालिका 5: चार पैरामीटर लॉजिस्टिक से प्राप्त परिणाम विशिष्ट खुराक-प्रतिक्रिया डेटा पर लागू होते हैं। विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले खुराक-प्रतिक्रिया डेटा को चित्रा 2में प्रस्तुत किया गया है। पूर्ण एकाग्रता सीमा सात के माध्यम से एक व्यक्तिगत कुओं के लिए विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया था(चित्रा 2बी)और औसत कुओं से प्राप्त डेटा के लिए एक से सात(चित्रा 2डी)। कम से कम वर्ग अनुकूलन के दौरान लॉजिस्टिक फ़ंक्शन का कोई भी पैरामीटर तय नहीं किया गया था। फिट परिणाम त्रुटि के दशक के लिए गोल थे, सिवाय अगर मूल्य त्रुटि से छोटा था ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह प्रोटोकॉल लेबल-मुक्त बाधा मापन के लिए एक विधि का वर्णन करता है ताकि एक ही रिसेप्टर के लिए विशिष्ट विरोधी की अनुपस्थिति या उपस्थिति में एगोनिस्ट-प्रेरित जीपीसीआर सक्रियण की खुराक-प्रतिक्रिया संबंध निर्धारित की जा सके। इस विधि की अवधारणा का प्रमाण हाल ही में एक प्रकाशन12में प्रस्तुत किया गया था । हमारी जानकारी के लिए यह पहला अध्ययन है जो विट्रो में एक सेल लेयर का उपयोग करके एगोनिस्ट-मध्यस्थता जीपीसीआर सक्रियण की पूर्ण खुराक-प्रतिक्रिया वक्र की स्थापना का वर्णन करता है। दृष्टिकोण अनिवार्य रूप से लेबल मुक्त सेल निगरानी दृष्टिकोण के उपयोग की आवश्यकता है और अंत बिंदु परखों के लिए लागू नहीं होगा ।

प्रोटोकॉल यू-373 एमजी कोशिकाओं के उदाहरण पर प्रदर्शित किया गया है, जो अंतःजात रूप से मानव हिस्टामाइन 1 रिसेप्टर (एचएचआर1) को व्यक्त करता है जो इसके एंडोजेनस एगोनिस्ट हिस्टामाइन की बढ़ती सांद्रता की एक श्रृंखला के साथ उत्तेजित होता है जबकि कोशिकाओं की बाधा लगातार दर्ज की जाती है। विरोधी अध्ययनों के लिए प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता प्रदर्शित करने के लिए, प्रयोगों को एचएच1आर के प्रतिस्पर्धी विरोधी डिफेनहाइड्रियाइन की एक निरंतर एकाग्रता की उपस्थिति में दोहराया गया था। बाधा रिकॉर्डिंग का उपयोग अन्य एच1आर एगोनिस्ट (जैसे, यूआर-कुम53011,व्यक्तिगत और स्टेपवाइज खुराक) और विरोधी (जैसे, मेपायरामीन)12 का अध्ययन करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल अन्य सेल लाइनों और रिसेप्टर्स के लिए भी लागू किया गया है, जैसे चो-D2R डोपामाइन डी 2 रिसेप्टर (D2R) या BAECकोव्यक्त करने के लिए 2-एड्रेनेर्गिक रिसेप्टर (ß2एआर)12यह दर्शाता है कि यह खुराक-प्रतिक्रिया डेटा की बहुत कुशल पीढ़ी के लिए एक सामान्य योजना प्रस्तुत करता है। जबकि U373-MG और BAEC कोशिकाओं संबंधित रिसेप्टर्स H1R औरएंडोजनस्तर पर 2 एआर व्यक्त करते हैं, चो-D2R एक पुनः संयोजन सेल मॉडल के लिए एक उदाहरण है । एक साथ लिया गया, सीरियल प्रोटोकॉल सामान्य रूप से एंडोजेनस या एक्टोपिक जीपीसीआर अभिव्यक्ति के साथ सेल प्रकारों पर लागू होता है, विभिन्न युग्मन प्रकारों के साथ जीपीसीआरएस जीक्यू (जैसे, एच1आर), जीएस (जैसे,2एआर), जीआई आई (जैसे, D2R) के साथ-साथ विभिन्न लिगांड प्रकार (एगोनिस्ट/एंटैगोनिस्ट)। ऊपर उल्लिखित उन सभी कोशिका/रिसेप्टर प्रकारों में, पीड़ावादी एकाग्रता बढ़ाने के साथ बाधा बढ़ जाती है । हालांकि, कुछ कोशिकाएं जीपीसीआर सक्रियण का जवाब बाधा कम करके करती हैं। हमने ऐसे ही एक मामले (HaCaT/histamine) के लिए प्रोटोकॉल का परीक्षण किया और एक एकाग्रता पर निर्भर स्टेपवाइज कमी भी पाई, जो आम तौर पर लागू दृष्टिकोण की धारणा का समर्थन करता है जो उलटा बाधा परिवर्तनों के साथ भी संगत है । यह प्रस्ताव किया गया है कि बाधा डेटा का विस्तृत समय पाठ्यक्रम किसी दिए गए रिसेप्टर के जी-प्रोटीन युग्मन के प्रकार को इंगित करता है । हालांकि अवधारणा आकर्षक है, हमारे डेटा का पूल आम तौर पर लागू नियम का समर्थन नहीं करता है जो दिए गए जीपीसीआर6के जी-प्रोटीन युग्मन के लिए बाधा समय प्रोफ़ाइल से संबंधित है।

सीरियल इसके अलावा प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार के इलेक्ट्रोड लेआउट और बहु-अच्छी प्रारूपों के लिए अनुकूलनीय है। यह ऑन-चिप परफ्यूजन सिस्टम पर लागू होता है, जो कई लेबल-आधारित दृष्टिकोणों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है जिसका परीक्षण करने के लिए अक्सर एक एकाग्रता के लिए एक सेल परत की आवश्यकता होती है। तदनुसार, धारावाहिक खुराक योजना अंग पर एक चिप या यहां तक कि मानव पर एक चिप दृष्टिकोण की तरह अधिक जटिल जैविक मॉडल में खुराक प्रतिक्रिया अध्ययन करने के लिए मार्ग प्रशस्त कर सकते हैं । बाधा मापन रिसेप्टर सक्रियण के लिए कोशिकाओं की एक एकीकृत, डिस्टल प्रतिक्रिया का पता लगाते हैं जो अंततः सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन को प्रेरित करता है। यह बल्कि सामान्य और अविशिष्ट लेकिन निष्पक्ष readout इसकी व्यापक प्रयोज्यता का आधार है जो जीपीसीएर्स तक सीमित नहीं है, लेकिन लक्ष्य के रूप में सेल सतह रिसेप्टर्स, साइटोप्लाज्मिक रिसेप्टर्स या यहां तक कि इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के अन्य वर्गों के लिए भी काम कर सकता है।

इलेक्ट्रोड पर कन्फ्लोरेंट सेल परतों के साथ काम करने के लिए स्टेपवाइज एगोनिस्ट अतिरिक्त प्रोटोकॉल के लिए यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि विरल संस्कृतियां संवेदनशीलता, प्रजनन क्षमता और डेटा व्याख्या में हस्तक्षेप करेंगी। समप्रवाह सेल मोनोलेयर में भी रिसेप्टर सक्रियण की सफल निगरानी के लिए एक अतिरिक्त शर्त संकेत ट्रांसड्यूक्शन झरना के साथ सेल आकार में परिवर्तन है। यदि अध्ययन के तहत कोशिकाएं प्रयोग के साथ अपनी आकृति विज्ञान को नहीं बदलती हैं, तो बाधा आधारित readouts अंधे हैं और रिसेप्टर गतिविधि में किसी भी परिवर्तन पर रिपोर्ट नहीं करेंगे। सीरियल इसके अलावा प्रोटोकॉल को ठीक से लेआउट करने के लिए, पारंपरिक एक-अच्छी तरह से एक-एकाग्रता मोड में प्रारंभिक पूर्व-परीक्षण की सिफारिश की जाती है ताकि एगोनिस्ट की एकाग्रता सीमा को मोटे तौर पर निर्धारित किया जा सके और बाद में एगोनिस्ट परिवर्धन के बीच समय अंतराल हो। एगोनिस्ट की अनुक्रमिक खुराक के बीच समय अंतराल को इस तरह से सिलवाया जाना चाहिए कि प्रणाली अगले से पहले एक नया संतुलन अपनाती है, उच्च खुराक जोड़ी जाती है। तदनुसार, विधि रिसेप्टर्स के लिए कम उपयोगी हो सकती है जो कोशिकाओं की बहुत जल्दी और केवल क्षणिक प्रतिक्रिया को ट्रिगर करती है या एक बहुत धीमी प्रतिक्रिया जिसे पूरा करने में घंटों लग सकते हैं। बाद की स्थिति प्रयोग के कुल समय में वृद्धि होगी और समानांतर इसके अलावा प्रोटोकॉल के लिए कॉल करने के लिए प्रयोगशाला समय पर कम कटौती । ऊपर प्रस्तुत उदाहरणों में, प्रयोग का कुल रनटाइम 2.5 - 3.5 घंटे था, जो सांद्रता (8 या 10) की संख्या और विरोधी के साथ संभावित पूर्व-ऊष्मायन के आधार पर था। पारंपरिक समानांतर एगोनिस्ट इसके अलावा मोड में एक ही प्रयोग केवल एक ही सेल रिसेप्टर मॉडल के लिए ~ 1 घंटे ले जाएगा, लेकिन बहुत छोटे थ्रूपुट के साथ । धारावाहिक दृष्टिकोण का एक स्पष्ट लाभ यह है कि सांद्रता की संख्या है कि एक पूर्ण खुराक प्रतिक्रिया संबंध के लिए परीक्षण की जरूरत है उपलब्ध कुओं की संख्या से सीमित नहीं है । यदि उच्च पीड़ावादी सांद्रता की आवश्यकता है, तो प्रयोग आसानी से बढ़ाया जाता है और बिना किसी अतिरिक्त सेल संस्कृति कार्य के पूरा हो जाता है। एगोनिस्ट इसके अलावा ही ध्यान से किया जाना चाहिए, क्योंकि कुछ कोशिकाएं तनाव को कतरनी के प्रति संवेदनशील हैं और तरल हैंडलिंग द्वारा लगाए गए यांत्रिक उत्तेजना के कारण काफी बाधा परिवर्तनों के साथ प्रतिक्रिया करती हैं। कोशिकाओं को भी बंद इलेक्ट्रोड आ सकता है । हालांकि, यह समस्या बाधा आधारित सेल निगरानी के लिए अद्वितीय नहीं है, लेकिन अन्य तकनीकों पर भी लागू होती है। संवेदनशील कोशिकाओं के लिए इसके अलावा मोड 1 कोशिकाओं पर कम यांत्रिक लोड के कारण अनुशंसित है। हालांकि, यह मोड इसके दौरान कम तरल मात्रा के साथ संचालित होता है जो अविशिष्ट सेल प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए गहन आंदोलन की सिफारिश नहीं की जाती है, इसलिए अधूरे मिश्रण का जोखिम उठाता है।

इसके अलावा मोड 1 कुएं में कुल मात्रा की एक चरणवार वृद्धि के साथ चला जाता है जबकि मोड 2 कुल मात्रा को स्थिर रखता है क्योंकि समान मात्रा में समाधान क्रमिक रूप से हटा दिया जाता है। ये सिर्फ दो चरम रणनीतियां हैं और किसी भी मध्यवर्ती तरीके से विशेष सेल प्रकार, बहु-अच्छी तरह से प्रारूपों या इलेक्ट्रोड लेआउट के लिए अनुकूलित की जा सकती हैं। U373-MG/H1R मॉडल के मामले में ईसी५० और ईमैक्स मूल्यों में मामूली अंतर पारंपरिक समानांतर इसके अलावा मोड की तुलना में धारावाहिक इसके अलावा मोड के लिए मनाया गया है (धारावाहिक, एन = 30: ईसी50:(0.8 ± 0.3) माइक्रोन, ईमैक्स:(1.9 ± 0.2) kΩ; समानांतर, एन = 15: ईसी50:(0.5 ± 0.2) माइक्रोन, ईमैक्स:(1.3 ± 0.3) kΩ), जबकि अन्य सेल/रिसेप्टर मॉडल में कोई अंतर नहीं दिखा। ईसी50 और ईमैक्स मूल्यों में बदलाव रिसेप्टर डिसिस्टेंसेशन से उत्पन्न हो सकता है जो रिसेप्टर्स के लंबे समय तक एगोनिस्ट के संपर्क में आने की संभावना अधिक होती है। असंवेदीकरण प्रभाव दृढ़ता से रिसेप्टर और अध्ययन के तहत लिगामेंट पर निर्भर करेगा। यह स्पष्ट होना बाकी है कि क्या धारावाहिक और समानांतर एगोनिस्ट अतिरिक्त का विस्तृत विश्लेषण रिसेप्टर डिसिसेन्सिटाइजेशन का अध्ययन करने के लिए एक नया साधन प्रदान कर सकता है ।

हम खुराक-प्रतिक्रिया घटता में संभावित बदलावों के लिए परीक्षण करने के लिए पारंपरिक समानांतर मोड एगोनिस्ट अतिरिक्त के साथ नियंत्रण प्रयोग करने की सलाह देते हैं। इसके अलावा नियंत्रण में मध्यम अतिरिक्त पर सॉल्वेंट लोड या यांत्रिक तनाव के कारण किसी भी प्रभाव को जानने के लिए उचित खुराक में केवल मध्यम/विलायक के साथ इलाज किया गया नमूना शामिल होना चाहिए । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है यदि लिगाड का स्टॉक समाधान मध्यम (जैसे, डीएमएसओ, इथेनॉल) की तुलना में अन्य सॉल्वैंट्स में तैयार किया जाता है। विभिन्न लिगांडके प्रभाव की जांच करते समय एक मानक एगोनिस्ट को संदर्भ के रूप में शामिल किया जाना चाहिए।

भविष्य के निर्देशों में स्वचालित तरल हैंडलिंग इकाइयां शामिल होनी चाहिए, जो पूरी तरह से स्वचालित खुराक या टिट्रेशन के लिए अनुमति दे सकती हैं। परफ्यूजन सिस्टम में धारावाहिक इसके अलावा मोड लागू करने के लिए प्रयोगशाला पर एक चिप और अंग पर एक चिप दृष्टिकोण के लिए महान क्षमता रखती है, साथ ही साथ तरल कतरनी तनाव के तहत प्रदर्शन प्रयोगों के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सेल पुलिया और प्रयोगात्मक समाधान तैयार करने के साथ उनकी मदद के लिए बारबरा Goricnick और Nadja Hinterreiter शुक्रिया अदा करते हैं । लेखक कृतज्ञता से अनुसंधान प्रशिक्षण समूह 1910 द्वारा वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं "चयनात्मक GPCR ligands के औषधीय रसायन" अनुदान संख्या 222125149 के तहत जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (DFG) द्वारा वित्त पोषित। JAS बवेरियन लैंगिक समानता कार्यक्रम द्वारा दी गई छात्रवृत्ति के लिए विशेष रूप से आभारी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bürker counting chamber Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) 640210
cell culture flasks 25 cm2 Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) 690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) \
Centrifuge (Heraeus 1S-R) Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) \
Diphenhydramine hydrochloride Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) D3630
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) D5671
Impedance Instrument (ECIS Zθ) Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) \
8-well electrode Arrays (8W1E PET) Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) \ PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)
96-well electrode arrays (96W1E+ PET) Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) \ PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area
Fetal calf serum (FCS) Biochrom (Berlin, Germany) S0615
Histamine dihydrochloride Carl Roth (Karlsruhe, Germany) 4017.1
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) 51022515 class II safety cabinet
Leibovitz' L-15 medium Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) 21083-027
L-glutamine Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) G7513
Micropipette large (100 - 1000 µL) Brandt (Wertheim, Germany) 704780
Micropipette large (20 - 200 µL) Brandt (Wertheim, Germany) 704778
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) Nikon (Düsseldorf, Germany)
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) P0781
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) D8537
Pipette, serological Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) 607 180
Pipettor (accu-jet pro) Brandt (Wertheim, Germany) 26300
Trypsin Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) T4174 in PBS with 1 mM EDTA
Tube, 15 mL Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) 188 271
Tube, 50 mL Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) 210 261
U-373 MG cells ATCC (Rockville, MD, USA) ATCC HTB-17
water bath (TW21) Julabo (Seelbach, Germany) \

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
  2. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
  3. Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
  4. Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
  5. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
  6. Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
  7. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
  9. Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
  10. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
  11. Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
  12. Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).

Tags

बायोकेमिस्ट्री इश्यू 156 जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) बाधा लेबल-फ्री सेल आधारित परख एकाग्रता-प्रतिक्रिया संबंध एगोनिस्ट विरोधी हिस्टामाइन
लेबल-फ्री बाधा-आधारित जीपीसीआर अखस में वृद्धि थ्रूपुट के लिए स्टेपवाइज डोजिंग प्रोटोकॉल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stolwijk, J. A., Mildner, A. K.,… More

Stolwijk, J. A., Mildner, A. K., Kade, C., Skiba, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., Huebner, H., Gmeiner, P., Wegener, J. Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays. J. Vis. Exp. (156), e60686, doi:10.3791/60686 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter