Summary
Este protocolo demuestra el registro en tiempo real de las relaciones de dosis-respuesta completa para la activación gpCR inducida por agonistas a partir de una sola capa de células cultivada en un solo microelectrodo mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. El nuevo esquema de dosificación aumenta significativamente el rendimiento sin pérdida en la resolución de tiempo.
Abstract
Los ensayos basados en impedancia sin etiquetas se utilizan cada vez más para estudiar de forma no invasiva la activación de GPCR inducida por ligandos en experimentos de cultivo celular. El enfoque proporciona supervisión de celdas en tiempo real con una resolución de tiempo dependiente del dispositivo hasta varias decenas de milisegundos y está altamente automatizado. Sin embargo, cuando los números de muestra son altos (por ejemplo, estudios de dosis-respuesta para varios ligandos diferentes), el costo de las matrices de electrodos desechables, así como la resolución de tiempo disponible para grabaciones secuenciales bien por pozo pueden llegar a ser limitador. Por lo tanto, aquí presentamos un protocolo de adición agonista en serie que tiene el potencial de aumentar significativamente la salida de ensayos GPCR sin etiquetas. Usando el protocolo de adición agonista en serie, un agonista GPCR se agrega secuencialmente en el aumento de las concentraciones a una sola capa de celda mientras se supervisa continuamente la impedancia de la muestra (modo agonista). Con este enfoque en serie, ahora es posible establecer una curva de dosis-respuesta completa para un agonista GPCR a partir de una sola capa de células. El protocolo de adición agonista en serie es aplicable a diferentes tipos de acoplamiento GPCR, Gq Gi/0 o Gs y es compatible con los niveles de expresión recombinantes y endógenos del receptor en estudio. El bloqueo de receptores por los antagonistas de GPCR también es evaluable (modo antagonista).
Introduction
Este informe presenta una descripción detallada de un protocolo de adición en serie desarrollado para la cuantificación de la activación del receptor acoplado a proteínaS G inducida por ligandos (GPCR) en células cultivadas adherentemente mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) participan en una multitud de funciones fisiológicas y enfermedades humanas1. Debido a esto y su buena accesibilidad en la superficie celular, los PCPR son uno de los objetivos de drogas más importantes. Esta evaluación se refleja en un número estimado de 700 medicamentos aprobados dirigidos a los GPCR, equivalente a una cuota del 35 % en todos los medicamentos comercializados2.
El desarrollo de nuevos fármacos comprende dos procesos centrales: i) la identificación y caracterización funcional de las moléculas diana biológicas, y ii) el descubrimiento de nuevas sustancias de plomo y su desarrollo en fármacos administrables. En ambos procesos, se requieren métodos eficientes para evaluar cuantitativamente las interacciones farmacológicas y la posterior respuesta biológica posterior. Diferentes etapas del proceso de desarrollo de fármacos preclínicos utilizan diferentes métodos de análisis que van desde estudios de interacción biomolecular entre fármaco y objetivo, sobre estudios funcionales sobre células en cultivo, hasta experimentos con material orgánico extirpado o animales enteros. Tanto el significado fisiológico como la complejidad biológica aumentan de los3primeros a los segundos. Aunque el objetivo general es minimizar los experimentos en animales, los estudios farmacológicos que utilizan órganos aislados de animales de laboratorio o incluso animales enteros se consideran inevitables para caracterizar exhaustivamente a los nuevos candidatos a fármacos. En términos de lectura analítica, los estudios farmacológicos de órganos proporcionan una respuesta funcional distal e integradora "holística" de mayor relevancia fisiológica. Un inconveniente de estos experimentos es que no son compatibles con el cribado de alto rendimiento por razones técnicas y éticas y han sido sustituidos en gran medida por estudios basados en el cultivo celular in vitro4.
Los métodos para cuantificar la activación de GPCR en cultivos celulares incluyen diferentes ensayos químicos basados en etiquetas, que detectan específicamente a los segundos mensajeros, el estado de fosforilación de las proteínas de señalización aguas abajo, la activación transcripcional a través de ciertos factores de transcripción o el tráfico de receptores intracelulares inducido por ligando4,5. Un inconveniente de estos ensayos basados en etiquetas es la necesidad de etiquetar las células con colorantes potencialmente dañinos o marcadores radiactivos. Esto a menudo requiere ejecutar el ensayo como una determinación de punto final para un tiempo de exposición que debe especificarse a priori. El uso de ensayos de punto final basados en etiquetas sufre de este momento muy limitado y sesgado del experimento y el riesgo de que las etiquetas químicas y las sondas puedan interferir con la fisiología celular regular, potencialmente desapercibida para el experimentador.
En los últimos años, han surgido ensayos sin etiquetas para el seguimiento de la activación de GPCR, como técnicas basadas en impedancia o métodos ópticos que aplican rejillas de guía de onda resonantes5,6. El etiquetado de las células no es necesario experimentalmente con estos enfoques. Como estas lecturas físicas operan en señales de baja amplitud, estos métodos se consideran no invasivos, permiten la supervisión continua de células potencialmente en tiempo real y el tiempo de observación sólo está limitado por el cultivo celular no por la lectura. Al igual que las lecturas de órganos enteros, los enfoques sin etiquetas suelen informar sobre las respuestas celulares holísticas, muy por debajo de la activación del receptor cuando la integración a lo largo de toda la red de señalización conduce a cambios dependientes del tiempo, sino más bien poco específicos en la morfología celular o la redistribución masiva. Mientras que los ensayos basados en impedancia miden la firma dieléctrica de los cambios en la forma de la célula7,8, las mediciones que utilizan rejillas de guía de onda resonantes son sensibles a los cambios en el índice de refracción en la interfaz de sustrato celular que se derivan de la redistribución dinámica de masa (DMR)9. El carácter integrador hace que los métodos libres de etiquetas sean extremadamente sensibles a los eventos mediados por receptores independientemente del tipo(s) de proteína G (Gq, Gi/0, Gs, G12/13)o -arrestina implicada en la cascada de señalización6 y adecuada para los niveles de expresión endógena del receptor.
En un ensayo estándar basado en impedancia sin etiquetas, las células se cultivan adherentemente en placas de varios pocillos con electrodos coplanares de película de oro depositados en la parte inferior de cada pozo10. Estas matrices de electrodos están conectadas a un analizador de impedancia y las respuestas celulares a un estímulo experimental se registran a partir de pozos individuales mediante lecturas de impedancia resueltas en el tiempo. En un ensayo típico de GPCR se añade un ligando en concentraciones individualmente diferentes a cada individuo bien. Los cambios inducidos por ligando en el curso de tiempo de impedancia se analizan con respecto a las características de la curva, como el cambio máximo de señal, el área bajo la curva, el cambio de señal dentro de un intervalo de tiempo determinado o la pendiente de la curva en un punto de tiempo especificado, con el fin de cuantificar la potencia y eficacia del ligando11.
El costo de las matrices de electrodos puede limitar la aplicación de esta técnica en campañas de detección de alto rendimiento (HTS). Además, con un número cada vez mayor de muestras a seguir en paralelo, el número de mediciones individuales aumenta y, por lo tanto, reduce la resolución de tiempo disponible para cada pocal gradualmente, incluso para las grabaciones multicanal de última generación. En tales condiciones, las respuestas celulares rápidas y transitorias pueden escapar de la medición. Además, el pozo convencional – un enfoque de concentración impone un factor de tiempo y costo significativo a los desarrollos de órgano en chip o cuerpo en chip perfundidos con respecto a su idoneidad en el análisis de interacción ligando-GPCR.
Por esta razón, desarrollamos un protocolo de dosificación escalonada que permite el registro de curvas de dosis-respuesta completa de activación GPCR inducida por ligando en monocapas celulares cultivadas mediante el monitoreo continuo de la impedancia de un solo pozo mientras que la concentración agonista se incrementa escalonadamente. El protocolo de adición agonista en serie aumenta significativamente el rendimiento por pozo de una concentración a 10 o más concentraciones, como se muestra en el ejemplo actual de células humanas U-373 MG, que endógenamente expresan el receptor de histamina 1 (H1R). Por lo tanto, el método tiene el potencial de mejorar significativamente el rendimiento en estudios de dosis-respuesta sin etiquetas, mientras que la resolución de tiempo se mantiene al máximo instrumental.
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Protocol
1. Sembrado celular en matrices de electrodos
NOTA: La selección del diseño del electrodo es un equilibrio entre la sensibilidad y el número de células en estudio. Cuanto más pequeño es el electrodo, más sensible es la medida, pero cuanto menor es el número de células en estudio. Para las células que muestran fuertes fluctuaciones de impedancia a lo largo del tiempo en condiciones basales, son preferibles electrodos más grandes o interdigitados.
- Precaliente todas las soluciones necesarias para el paso y la sembración de células estándar en un baño de agua de 37 oC. Para los ensayos con células Humanas U-373 MG se necesita: solución salina tamponada de fosfato (PBS) sin calcio y magnesio, 0,05% (p/v) de tripasina, medio de cultivo celular (Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) complementado con 5% (v/v) de suero de becerro fetal (FCS), 2 mM de lglutamina y 100 g/mL de penicilina/streptomicina).
- Enjuague la capa celular del cultivo de material cultivado en la parte inferior de los matraces o platos de cultivo celular convencionales con PBS dos veces.
- Retire el PBS, agregue la solución de trippsina (1 mL para 25 cm2)y deje que las células incuban a 37 oC durante 5 min (se aplica a las células Mg de U-373).
- Control para el desprendimiento completo de las células desde la parte inferior del sustrato de crecimiento mediante microscopía.
- Detener la reacción de trippsina tan pronto como las células se separan por completo agregando 9 ml de medio de cultivo celular por 1 ml de trippsina a la suspensión celular. Enjuague cuidadosamente las celdas restantes de la parte inferior del sustrato de cultivo celular pipeteando la suspensión sobre el sustrato.
- Recoger la suspensión celular con una pipeta y transferirla a un tubo de centrifugación (tubo de 15 ml o 50 ml).
- Gire las células por centrifugación a 110 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender a fondo el pellet celular en el medio de cultivo antes de contar las células (por ejemplo, utilizando un hemacitómetro para microscopios de contraste de fase y conteo manual).
- Ajuste la suspensión de la celda a la densidad celular deseada. Para experimentos con células Mg U-373, utilice 100 000 células/cm2 para cultivar una capa celular confluente dentro de 48 h. Esto se traduce en una densidad celular de 200 000 celdas/ml para matrices de electrodos de 8 pozos con un área de crecimiento de 0,8 cm2 y un volumen de pozo de 400 ol.
NOTA: Para experimentos de activación de GPCR reproducibles, las células deben crecer a monocapas confluentes en las matrices de electrodos. Para garantizar la expresión adecuada del receptor en la superficie celular, las células deben ser sembradas al menos 36 h antes de realizar el experimento. Probar diferentes densidades celulares para la sembración celular a menudo es significativo para identificar las mejores condiciones experimentales. - Añadir la suspensión celular a los pozos de la matriz de electrodos y dejar que las ventas se asienten a temperatura ambiente durante 10 – 15 minutos con el fin de asegurar la distribución homogénea de las células en la parte inferior de los pozos.
- Cultivar células durante al menos 36 h en una incubadora de cultivo celular estándar con 5% deCO2 (dependiendo del tipo medio) a 37oC y atmósfera humidificada. Cambiar el medio de cultivo celular 24 h antes del experimento.
- El día del experimento, inspeccione las capas celulares en las matrices de electrodos mediante microscopía (contraste de fase) para asegurar una cobertura completa de electrodos con células.
2. Equilibrio de células en medio libre de suero
- Medio precálido sin suero, en este estudio: Medio L15 de Leibovitz.
- Retire el medio de cultivo celular de las células cultivadas en matrices de electrodos y sustitúyalos por un medio precalentado sin suero. Utilice 200 l para matrices de electrodos con formato de 8 pozos y 150 l para matrices de electrodos de 96 pozos.
- Dejar que las células se equilibren en un medio libre de suero a 37 oC durante al menos 2 h. El tiempo de equilibrio depende en gran medida del tipo de celda. Por ejemplo, las células MG U-373 necesitan 2 h, las células CHO necesitan 4 h, BAEC puede requerir equilibrio durante la noche en el medio L-15.
NOTA: El medio L-15 es independiente del CO2 y requiere una atmósfera libre de CO2. Para el equilibrio en L-15 fije la incubadora en 0 % CO2. El equilibrio puede ser monitoreado por lecturas de impedancia, lo que recomendamos hacer para los primeros experimentos.
3. Monitoreo del equilibrio celular con lecturas de impedancia
- Coloque la matriz de electrodos en el soporte de la matriz de conexión del analizador de impedancia.
- Garantice un contacto adecuado de baja impedancia entre los electrodos y el analizador de impedancia. Esta comprobación es diferente individualmente para diferentes instrumentos.
NOTA: Si el instrumento no puede conectarse a los electrodos, vuelva a abrir la abrazadera de contacto, vuelva a ajustar la matriz de electrodos para un posicionamiento adecuado dentro del soporte y vuelva a intentarlo. - Seleccione el tipo de electrodo y/o el formato multipozo en la interfaz de usuario del software.
- Configure los parámetros de medición. Hay diferentes opciones disponibles.
NOTA: Para seleccionar la frecuencia de CA más sensible, nos referimos a la literatura y los manuales de instrumentos, ya que depende de la disposición del electrodo y el tipo de celda en estudio. Típicamente, la frecuencia de sensación está en el rango de 4 kHz – 50 kHz. Aquí, las células U-373 MG se cultivaban con electrodos de trabajo circulares de 250 m de diámetro y fueron monitoreadas a una frecuencia de CA de 12 kHz.- Si hay disponibles modos de adquisición de datos de frecuencia única y múltiple, seleccione el modo de frecuencia única para garantizar la máxima resolución de tiempo. La medición se realizará con esta única frecuencia. Para los instrumentos más extendidos, hay una serie de frecuencias preestablecidas a lo largo de la ventana de frecuencia disponible.
- Si el número de pozos en estudio es bajo o la resolución de tiempo no es crítica, seleccione varias grabaciones de frecuencia en su lugar. Las lecturas de impedancia en un número especificado de frecuencias se registrarán para cada pozo para un análisis en profundidad posterior.
NOTA: La resolución de tiempo disminuye con el aumento del número de frecuencias registradas por pozo y el número creciente de pozos. Las opciones de selección de frecuencia y modo de adquisición de datos varían según el tipo de instrumento y la versión.
- Inicie la adquisición de los datos del curso de tiempo.
- Siga la impedancia de la capa celular (al menos 2 h) hasta que la impedancia se haya estabilizado. Mientras tanto, prepare las soluciones agonistas.
- Cuando las capas de celda han alcanzado un nivel de impedancia estable, (i) procede a la adición agonista en serie dentro del mismo experimento o (ii) termina la adquisición de datos e inicia un nuevo conjunto de datos para supervisar la activación del receptor inducida por agonistas.
4. Preparación de soluciones agonistas para experimentos en modo agonista
- Calcular la concentración de soluciones agonistas según sea necesario para cada paso de la dosificación en serie de acuerdo con la ecuación (1). n oscila entre 1 y el número total de adiciones en serie i. x denota concentración y volumen en el pozo en el paso n. y denota la concentración y el volumen de la "solución a agregar" en el paso n.
NOTA: Considere el número de réplicas y calcule el volumen total de "solución para agregar" para cada paso de concentración. Los resultados de un cálculo típico se dan en los Cuadros 1-4. Se necesita una idea general sobre el rango de concentración agonista a estudiar, ya que el rango define las concentraciones y el número de porciones que se administrarán durante la adición en serie. Usando el protocolo de adición agonista en serie la concentración agonista se incrementa escalonadamente. Por lo tanto, la cantidad de agonista ya en el pozo cuando se añade la siguiente dosis debe tenerse en cuenta. Cuando el número de moléculas agonistas ya presentes en el pozo es nx á cx x Vx (con la concentración actual cx y volumen Vx) y el número de moléculas en el pozo después de la siguiente adición es nx+y, el número de moléculas que se añadirán ny se determina por la concentración cy el volumen Vy de la solución que se aplicará al pozo (ny a cy Vy Y). Después de añadir una porción de agonista, la nueva cantidad de moléculas agonistas en el pozo es: cx+y á Vx+y á cx vx x cy a V y aV y. Este cálculo se aplica a cada paso siguiente. Debido a la interdependencia de la concentración agonista en el pozo y la cantidad de agonista en las porciones que se añadirán con cada paso, es importante definir las concentraciones finales después de cada paso de antemano.
Modo 1: El volumen en el pozo aumentará con cada paso a medida que el líquido se agrega continuamente.
Usando este modo y un formato de 8 pozos, utilice Vx1 a 200 l y Vy1 .... Vyi a 30 ol.
Modo 2: El volumen en el pozo es constante ya que el volumen añadido con cada paso se elimina justo antes de la adición posterior.
Usando este modo y un formato de 96 pozos, utilice Vx1 a 150 l y Vy1 .... Vyi a 75 ol.
- Imprima la hoja de datos con el volumen total por concentración e instrucciones detalladas para pipeteo.
- Prepare todas las soluciones en la cantidad requerida. Haga todas las soluciones agonistas en el mismo medio libre de suero que se utiliza para el equilibrio de las células.
ADVERTENCIA: El dihidrocloruro de histamina se considera peligroso por la Norma de Comunicación de Peligros de la OSHA de 2012 (29 CFR 1910.1200). La histamina causa irritación de la piel, irritación ocular grave, puede causar una reacción alérgica en la piel, alergia, síntomas de asma o dificultades respiratorias si se inhala y puede causar irritación respiratoria. Tenga en cuenta la ficha de datos de seguridad.
NOTA: Haga que las soluciones agonistas sean lo más frescas posible. La estabilidad de los agonistas en la solución puede variar considerablemente. Almacene las soluciones a 4 oC o menos hasta su uso en el experimento. Para algunas moléculas aditivos estabilizadores adicionales, como BSA cuando se utilizan moléculas basadas en péptidos o lípidos, se pueden considerar para prevenir la adsorción a las paredes de pozos y tubos. - Si realiza el experimento en formato de 96 pocillos, transfiera soluciones a una placa convencional de 96 pocillos (sin electrodos) y utilice una tubería de canal de 8 (o 12) para una transferencia rápida de líquido a la matriz de electrodos.
5. Preparación de soluciones agonistas para experimentar en modo antagonista
NOTA: Prepare la(s) solución(es) antagonista(s) con la concentración que se aplicará en todo. El volumen y la concentración de la solución antagonista dependen del modo de adición agonista (1 o 2). Ejemplos de experimentos en formato de 8 o 96 pozos en el modo de adición 2: (A) formato de 8 pozos (Vx1 a 200 l,antagonista v a 200 ol); (B) Formato de 96 pozos (Vx1 a 150 l,antagonista de V a 75 ol).
- Calcule la concentración de cada solución agonista necesaria para cada paso de la dosificación en serie como se describe en el paso 4.1.
- Hacer todas las soluciones agonistas en el mismo medio libre de suero que se utiliza para el equilibrio de las células y añadir el antagonista en la misma concentración final que se planeó para los pozos respectivos en el experimento.
NOTA: En este caso, la solución de stock de histamina (10 mM) se prepara en medio L-15. Cuando los agonistas se disuelven en otros disolventes (por ejemplo, dimetil sulfoxid (DMSO), etanol) se debe incluir un control de disolvente para tener en cuenta el aumento de la carga de disolvente según cada paso de adición.
6. Realizar el protocolo de adición en serie en modo agonista
- Inicie la adquisición de datos como se describe en los pasos 3.1 – 3.5.
- Precaliente las soluciones agonistas antes de su uso colocándolas en la incubadora unos 10 – 15 minutos antes de la adición.
NOTA: Cuando se utilizan sustancias termolábiles, las soluciones no deben mantenerse a 37 oC durante demasiado tiempo. Si el precalentamiento durante 10 – 15 minutos se considera crítico, lleve soluciones a 37 oC poco antes de la adición en un baño de agua. - Ejecute la dosificación en serie agonista en función del modo de adición seleccionado. El siguiente modo 1 el volumen total del pozo aumenta con cada adición de la siguiente dosis. En el modo 2 el mismo volumen que se añade con cada paso también se elimina de nuevo justo antes de añadir la siguiente dosis más alta.
NOTA: El tiempo necesario para el equilibrio de la capa celular entre dos dosis agonistas posteriores depende del tiempo de respuesta de las células. Un experimento inicial en modo paralelo (un pozo – una concentración) revela (i) tiempos de respuesta de celda para diferentes concentraciones agonistas y (ii) el parámetro de curva más sensible (por ejemplo, impedancia máxima, impedancia después del tiempo x).
R: Modo 1 / 8-formato de pozo
- Añadir 30 ml de la primera solución con la menor concentración de agonista a las células que se equilibraron en 200 oL de medio libre de suero.
- Deje que las células respondan y equilibren durante el período de tiempo predefinido (por ejemplo, 15 min).
- Añadir 30 sde la segunda solución con la siguiente concentración más alta.
- Repita los pasos 6.3.1-6.3.3 con la tercera, cuarta, etc., solución agonista.
NOTA: Al trabajar con 10 pasos de concentración, se producirá un volumen total de 500 l al final del experimento, que está justo por debajo del volumen máximo aplicable de estos pozos de 550 ol.
B: Modo 2 / 96-formato de pozo
NOTA: Pausa la adquisición de datos durante cada paso de manipulación de líquidos (adición/eliminación) a través del software del instrumento de impedancia cuando se ejecutan experimentos en formato de 96 pozos. El manejo de líquidos más elaborado puede interferir con la adquisición de datos. Utilice una pipeta multicanal.
- Pausa la adquisición de datos.
- Añadir 75 ml de la primera solución con la menor concentración de agonista a las células que se equilibraron en 150 oL de medio libre de suero.
- Reanudar la adquisición de datos.
- Deje que las células respondan y equilibren durante el período de tiempo predefinido (por ejemplo, 15 min).
- Aproximadamente 1 – 2 min antes de que termine el tiempo de equilibrio regular, detenga la medición y retire 75 s de cada pocal.
NOTA: El punto de tiempo en el que se debe eliminar la solución depende del número de pozos monitoreados en paralelo y de la velocidad de pipeteo. El tiempo necesario para la eliminación de las soluciones no debe exceder el tiempo entre pasos posteriores. - Añadir 75 ml de la segunda solución con la siguiente concentración más alta y reanudar la medición.
- Repita los pasos 6.3.8-6.3.10 con la tercera, cuarta, etc., solución agonista.
7. Realizar el protocolo de adición en serie en modo antagonista
- Inicie la medición como se describe en los pasos 3.1 – 3.5.
- Durante el equilibrio de las capas celulares, prepare la solución antagonista (p. ej., 200 ml de clorhidrato de difenhidramina de 1,5 m en medio L15).
ADVERTENCIA: El clorhidrato de difenhidramina tiene posibles efectos agudos para la salud. Es perjudicial si se ingiere o inhala, puede causar irritación de los ojos y la piel. Puede causar irritación respiratoria y del tracto digestivo. Tenga en cuenta la ficha de datos de seguridad. - Precalentar las soluciones antagonistas y agonistas colocándolas en la incubadora unos 10 – 15 minutos antes de la adición a los cultivos celulares (cf. 6.2). Si los pozos libres de antagonistas también están incluidos en el ensayo, también se precalienta el medio libre de suero.
- Agregue la solución antagonista a los pozos designados. Deje que las células se equilibren con antagonista durante 15 – 20 min. Si se incluyen pozos libres de antagonistas, agregue el mismo volumen de medio libre de suero a estos pozos.
- Según la adición antagonista en el modo 2,eliminar la solución de los pozos
(A) Formato de 8 pozos (200 l)
(B) Formato de 96 pozos (75 l) - Ejecute la secuencia de adición agonista como se describe en el paso 6.3.
8. Exportación y análisis de datos
- Exporte datos utilizando el software del instrumento de impedancia para convertir todos los datos grabados de propiedad a formatos de datos comunes (por ejemplo, csv). Este paso permite la reorganización y presentación de datos con otros paquetes de software.
- Cargue los datos con formato csv en software de análisis de datos científicos.
- Normalice los valores de impedancia restando la impedancia del último punto de datos antes de la primera adición de la solución agonista y estableciendo la hora de adición a t a 0. Trazar el curso de tiempo de impedancia normalizada.
- Trazar los cursos de tiempo individuales e identificar el máximo en impedancia después de cada paso de adición. Componga una hoja de datos con estos valores.
- Trazar los valores de los cambios de impedancia máximo (o mínimo, si procede) en función de la concentración agonista. Esto se puede hacer para pozos individuales o para los promedios (media de SD).
- Utilice una rutina de ajuste de datos para determinar las concentraciones efectivas medias máximas (EC50) y la respuesta máxima (EMax)utilizando el modelo logístico de cuatro parámetros (ecuación 2):
NOTA: c indica la concentración agonista, A1 es el mínimo y A2 es la asintota máxima de la curva de dosis-respuesta sigmoidal (A2 o EMax). EC50 es la concentración en el punto de inflexión de la curva, y n corresponde a la pendiente de la colina.
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Representative Results
Un esquema típico para la preparación de las diversas soluciones agonistas se muestra para un experimento utilizando matrices de electrodos de 8 pozos con histamina como agonista en las Tablas 1-4. La Tabla 1 y la Tabla 2 presentan volúmenes y concentraciones para un experimento utilizando el modo de adición 1 (cf., Figura 1), mientras que la Tabla 3 y la Tabla 4 presentan volúmenes y concentraciones para un experimento siguiendo el modo de adición 2 (cf., Figura 1). Los datos se han calculado utilizando la ecuación (1).
Un experimento representativo se muestra en la Figura 2 para las capas de confluente de células MG De U-373, que expresan endógenamente el receptor de histamina 1, cultivado en una matriz de electrodos de 8 pozos con un electrodo de trabajo de 250 m de diámetro utilizando histamina como agonista. La medición se realizó a una sola frecuencia de 12 kHz. La adición de la serie de concentración agonista se realizó siguiendo el modo 1. En el experimento seleccionado se añadieron 10 soluciones con el aumento de la concentración de histamina (preparadas según el paso 4) secuencialmente cada 15 minutos(Figura 2A). El esquema de dosificación en serie se aplicó a siete de ocho pozos. En un medio libre de agonistas (L-15) se añadió secuencialmente como un control negativo en nueve de diez pasos. La última adición a este control fue una solución de histamina que proporciona una concentración final de 100 m de histamina en el pozo. Los datos se han trazado con software de análisis de datos y se muestran como cambiodes de impedancia Z 12 kHz / k a lo largo del experimento, con el cambio de impedancia y el punto de tiempo de la primera adición que se establece en cero. El tiempo de equilibrio inicial en el búfer experimental de 2 h no se muestra en esta gráfica. Los puntos de tiempo de adición agonista se indican mediante flechas.
El cambio en la impedancia con respecto a la línea base después de cada paso de concentración se extrajo de las curvas utilizando un cursor de datos. En pasos sin un máximo claro, se utilizó el último punto de datos antes de la siguiente adición para el análisis. Cambios de impedancia ? Z Se trazaron 12 kHz en función de la concentración de histamina (cx+y)(Figura 2B, símbolos). La función de transferencia de un modelo logístico de cuatro parámetros (cf. paso 8.6) se ha instalado en los puntos de datos experimentales de siete pozos(Figura 2B,líneas). Los resultados de ajuste se muestran en la Tabla 5. La Figura 2C y la Figura 2D muestran el resultado de promediar los datos de la Figura 2A y la Figura 2B,presentando la media de SD para siete pozos. Los datos del curso de tiempo medio se resumen en la Figura 2C, mientras que la curva dosis-respuesta media se proporciona en la Figura 2D.
En las relaciones dosis-respuesta, tal y como se muestra en la Figura 2B,D, el procedimiento de ajuste se aplicó a todo el rango de concentración que devuelveCE 50 o (0,86 a 0,13) m. La respuesta de impedancia aumenta monotónicamente con el aumento de la concentración de histamina, excepto en los dos últimos pasos de concentración (30 m, 100 m de concentración final). Esta respuesta se explica presumiblemente por la regulación del receptor de histamina, la desensibilización o la sobreestimulación de las células (ver discusión). Para tener en cuenta este efecto, se ha reducido el rango de datos para el análisis, como se muestra para un único experimento de dosificación en serie(Figura 3; pozo 1) seleccionado a partir de los datos que se muestran en la Figura 2. Por otra parte, establecer la asíntota inferior (A1) a cero durante la optimización menos cuadrada asumiendo que no hay ningún cambio de impedancia en respuesta a 0 M histamina está bien justificado. La aplicación de esta optimización de tres parámetros proporciona un EC50 de (0,75 a 0,12) m (cf., figura 3B). Se constató que los valores de las CE50 eran insensibles para cualquiera de los modos de análisis de datos y no eran significativamente diferentes.
Los resultados típicos de un experimento de placa de 96 pocillos se resumen en la Figura 4. Las células Mg U-373 se cultivaron en matrices de electrodos de 96 pozos como se describió anteriormente. Se incluyeron 32 pozos en la medición. 8 pozos sirvieron como controles libres de agonistas, expuestos a medios solamente. 24 pozos fueron sometidos a una serie de concentraciones crecientes de histamina calculadas y preparadas para el modo de adición 2. El curso de tiempo de cambio de impedancia se muestra para los 32 pozos individuales en la Figura 4A. Una de las curvas (resaltada en rojo) muestra un curso de tiempo inusual y fue excluida de un análisis posterior. En consecuencia, los datos de 23 pozos se promediaron y trazaron como curso de tiempo de cambio de impedancia promedio (media de SD) en la Figura 4B. Cada curva individual se analizó como se describió anteriormente para la relación dosis-respuesta. Los puntos de datos se promediaron y trazaron en función de la concentración final de histamina(Figura 4C). Los datos de dosis-respuesta se analizaron mediante el modelo logístico de cuatro parámetros, que devolvió un valor medio de EC50 de (1,0 a 0,3) M.
Un resultado típico para el protocolo de adición de agonista en serie en modo antagonista se muestra en la Figura 5. Aquí, un pozo fue pre-tratado con 0.75 m del antagonista del receptor de histamina difenhidramina (curva roja) 20 min antes de que se añadiera la primera histamina(Figura 5A). El control recibió un medio libre de antagonistas (curva azul). El antagonista fue añadido siguiendo el modo 2,lo que significa que se eliminaron 200 l de los finalmente 400 l antes de que se aplicara la serie agonista. El agonista (histamina) fue añadido siguiendo el modo de dosificación en serie 1 como se describe en los ejemplos anteriores. Es importante para los experimentos en modo antagonista que la concentración antagonista se mantenga constante durante todo el curso del tiempo del experimento. En consecuencia, todas las soluciones agonistas añadidas al pozo también deben contener la concentración de antagonistas predefinida (en este caso, 0,75 m), mientras que el control sigue estando libre de antagonistas. Un efecto antagónico se hace evidente por un aumento "retrasado" de la impedancia dentro del esquema de dosificación en serie correspondiente a concentraciones agonistas más altas necesarias para inducir una respuesta celular. En la relación dosis-respuesta, el efecto del antagonista se expresa como un desplazamiento hacia la derecha de las curvas, que corresponde a un aumento deLA 50, siempre que el antagonista sea un ligando competitivo en relación con el agonista(Figura 5B). Se determinó que la CE50 (0,92 a 0,05) en ausencia del antagonista y (14,7 a 0,6) de M en su presencia.
Figura 1: Modos de adición de agonistas en serie. (A) Esquema que ilustra los cálculos de concentración. Mediante la adición de la solución agonista de concentración cy y volumen Vy a un pozo con volumen Vx y concentración agonista cx, el volumen aumenta a Vx+y y la concentración aumenta a cx+y. (B) Dos modos diferentes para la adición de agonista en serie. Modo 1: El volumen total en el pozo Vx+y aumenta con cada adición. Modo 2: El volumen añadido en cada paso de concentración se elimina de nuevo antes de añadir la siguiente dosis, lo que mantiene constante el volumen total en el pozo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados de un experimento típico en formato de 8 pozos. (A) Curso de tiempo de cambio de impedancia a 12 kHz para las capas de células MG U-373 confluentes cultivadas en electrodos de trabajo circulares de 250 m de diámetro. En siete de ocho pozos se aplicó la adición en serie de histamina. Un pozo (curva gris) se cargó secuencialmente con búfer libre de histamina en cada paso (modo 1), excepto para el último paso cuando se añadieron histamina de 100 M como un control positivo. (B) Relaciones dosis-respuesta generadas a partir del cambio máximo de impedancia en relación con la línea de base para siete pozos individuales después de cada paso de concentración. (C) Curso de tiempo medio de cambio de impedancia (media - SD) generado a partir de siete pozos individuales como se muestra en (A). (D) Relaciones dosis-respuesta medias generadas a partir de conjuntos de datos individuales como se muestra en (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Adaptación de los modos de análisis de datos. (A) Curso de tiempo típico de cambio de impedancia a 12 kHz para una sola capa de células MG U-373 confluente cultivada en electrodos de trabajo circulares de 250 m de diámetro. (B) Relación dosis-respuesta experimental (símbolos rellenos) generada a partir del cambio máximo de impedancia en relación con la línea de base después de cada aumento de la concentración. El conjunto de datos completo se sometió al procedimiento de ajuste (curva negra y gris) o el último punto de datos -que indica el inicio de la desensibilización y/o internalización del receptor- se omitió del análisis cuantitativo (curva roja y magenta). Los cuatro parámetros se ajustaron durante la optimización cuadrada menor (curva negra y roja) o el parámetro A1, que representa la asíntota inferior, se estableció y se fijó en cero (curva gris y magenta). Los valores de las CE50 no eran significativamente diferentes para los dos modos de análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Experimento típico en formato de 96 pozos. (A) Curso de tiempo de cambio de impedancia medido a 12 kHz para las capas de células MG U-373 confluentes cultivadas en una matriz de electrodos de 96 pozos. Los datos se muestran para 32 pozos. 24 pozos fueron sometidos a una serie de concentraciones crecientes de histamina añadidas con un tiempo de equilibrio de 15 minutos entre cada paso. La curva resaltada en rojo se excluyó del promedio. Ocho pozos (control) fueron tratados con medio libre de histamina en cada punto de adición. (B) Curso de tiempo de cambio de impedancia promedio para 23 pozos individuales en respuesta a la adición en serie de histamina y ocho pozos de control como se muestra en (A). (C) Relación dosis-respuesta media generada a partir del cambio máximo de impedancia en relación con el valor basal después de cada aumento de la concentración (media de SD). Los datos se equiparon con una función logística de cuatro parámetros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Experimento típico en modo antagonista. (A) Curso de tiempo de cambio de impedancia a 12 kHz para las capas de células MG U-373 confluentes cultivadas en electrodos de trabajo circulares de 250 m de diámetro, previa adición de aumento de las concentraciones de histamina con o sin presencia de difenhidramina antagonista del receptor de histamina. Se añadieron difenhidramina (0,75 m) o medio libre de antagonistas (L15) 20 minutos antes de que comenzara la dosificación en serie agonista. (B) Relaciones dosis-respuesta generadas a partir del cambio máximo de impedancia en relación con la línea de base después de cada aumento de concentración a partir de los datos mostrados en (A). La presencia de 0,75 m de difenohidramina aumentó la EC50 de (0,92 a 0,05) a (14,7 a 0,6) M. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución # | cx+y (M) | cx (M) | Vx (L) | Vx+y (L) | Vy (L) | cy (M) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tabla 1: Esquema de cálculo de concentración para experimentos utilizando matrices de electrodos de 8 pozos siguiendo el modo de adición 1.
| Solución # | cy (M) | Vy (L) | hacer de | c (M) | factor de dilución | hacer el total de V (l) | uso (l) | añadir V (l) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM Stock | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tabla 2: Esquema de pipeteo para experimentos utilizando matrices de electrodos de 8 pozos siguiendo el modo de adición 1.
| Solución # | cx+y (M) | cx (M) | Vx (L) | Vx+y (L) | Vy (L) | cy (M) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tabla 3: Esquema de cálculo de concentración para experimentos utilizando matrices de electrodos de 8 pozos siguiendo el modo de adición 2.
| Solución # | cy (M) | Vy (L) | hacer de | c (M) | factor de dilución | hacer el total de V (l) | uso (l) | añadir V (l) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 m de stock | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tabla 4: Esquema de pipeteo para experimentos utilizando matrices de electrodos de 8 pozos siguiendo el modo de adición 2.
| Bien | EC50 | Emáx.(A 2) | A1 | N |
| (M) | (ká) | (o) | ||
| 1 | 0,9 a 0,1 | 1680 x 70 | 150 x 80 | 1,9 x 0,5 |
| 2 | 0,7 a 0,2 | 1770 x 90 | 200 x 140 | 1,3 á 0,4 |
| 3 | 0,6 a 0,2 | 1700 a 100 | 60 x 250 | 1,1 a 0,5 |
| 4 | 0,6 a 0,2 | 2000 a 100 | 140 x 180 | 1,3 á 0,4 |
| 5 | 0,9 a 0,1 | 1810 a 60 | 160 x 80 | 1,4 x 0,3 |
| 6 | 0,8 a 0,1 | 1950 a 70 | 200 x 110 | 1,3 á 0,3 |
| 7 | 0,6 a 0,3 | 1700 x 200 | 260 x 250 | 1,6 x 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 a 0,2 | 1900 a 100 | 100 x 100 | 1,1 a 0,2 |
Tabla 5: Los resultados obtenidos a partir de cuatro parámetros logísticos se aplican a los datos típicos de dosis-respuesta. Los datos de dosis-respuesta utilizados para el análisis se presentan en la Figura 2. El rango de concentración completo se aplicó al análisis de los pozos individuales uno a siete(Figura 2B) y para los datos medios obtenidos de los pozos uno a siete(Figura 2D). Ninguno de los parámetros de la función logística se ha corregido durante la optimización de mínimos cuadrados. Los resultados de ajuste se redondearon a la década del error, excepto si el valor era menor que el error.
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Discussion
Este protocolo describe un método para mediciones de impedancia sin etiquetas para determinar la relación dosis-respuesta de activación GPCR inducida por agonistas en ausencia o presencia de antagonistas específicos para el mismo receptor. La prueba de concepto de este método se presentó en una publicación reciente12. Hasta nuestro conocimiento, es el primer estudio que describe el establecimiento de una curva de dosis-respuesta completa de activación GPCR mediada por agonistas utilizando una sola capa celular in vitro. El enfoque requiere inevitablemente el uso de enfoques de supervisión de celdas sin etiquetas y no será aplicable a los ensayos de punto final.
El protocolo se ha demostrado en el ejemplo de las células Mg U-373, que expresan endógenamente el receptor de histamina 1 humano (hHR1) que se estimula con una serie de concentraciones crecientes de su histamina agonista endógena mientras se registra continuamente la impedancia de las células. Para demostrar la aplicabilidad del protocolo a los estudios antagonistas, los experimentos se repitieron en presencia de una concentración constante de difenhidramina, un antagonista competitivo del hH1R. Las grabaciones de impedancia también se han utilizado con éxito para estudiar otros agonistas H1R (por ejemplo, UR-KUM53011, dosificación individual y escalonada) y antagonistas (por ejemplo, Mepyramine)12 además de los ejemplos que se muestran aquí. Por otra parte, el protocolo se ha aplicado también a otras líneas celulares y receptores, por ejemplo, CHO-D2R expresando el receptor de dopamina D2 (D2R) o BAEC expresando el receptor -adrenergic2(2AR)12 que indica que presenta un esquema general para la generación muy eficiente de datos de dosis-respuesta. Mientras que las células U373-MG y BAEC expresan los receptores respectivos H1R y2AR en niveles endógenos, el CHO-D2R es un ejemplo para un modelo de células recombinantes. En conjunto, el protocolo serie es en general aplicable a los tipos de células con expresión GPCR endógena o ectópica, GPCRs con diferentes tipos de acoplamiento Gq (por ejemplo, H1R), Gs (por ejemplo,2AR), Gi (por ejemplo, D2R) así como diferentes tipos de ligandos (agonista/antagonista). En todos esos tipos de células/receptores mencionados anteriormente, la impedancia aumenta con el aumento de la concentración agonista. Sin embargo, algunas células responden a la activación de GPCR mediante una disminución de impedancia. Probamos el protocolo para uno de esos casos (HaCaT/histamine) y encontramos también una disminución escalonada dependiente de la concentración, apoyando la noción de un enfoque generalmente aplicable que también es compatible con los cambios de impedancia inversa. Se ha propuesto que el curso de tiempo detallado de los datos de impedancia indique el tipo de acoplamiento de proteína G de un receptor determinado. Aunque el concepto es atractivo, el conjunto de nuestros datos no admite una regla de aplicación general que correlacione el perfil de tiempo de impedancia con el acoplamiento de proteína G de un GPCR6determinado.
El protocolo de adición en serie es adaptable a diferentes tipos de diseños de electrodos y formatos multipozo. Es aplicable a los sistemas de perfusión en chip, que es una ventaja significativa sobre muchos enfoques basados en etiquetas que a menudo requieren una capa de celda para que se pruebe una concentración. En consecuencia, el esquema de dosificación en serie puede allanar el camino a estudios de dosis-respuesta en modelos biológicos más complejos como los enfoques de órgano en chip o incluso de humano sobre un chip. Las mediciones de impedancia detectan una respuesta distal integrada de las células a la activación del receptor que, en última instancia, induce cambios en la morfología celular. Esta lectura más bien general e inespecífica, pero también imparcial es la base de su amplia aplicabilidad que no se limita a los GPCR, sino que también podría funcionar para otras clases de receptores de superficie celular, receptores citoplasmáticos o incluso proteínas intracelulares como dianas.
Es fundamental que el protocolo de adición agonista escalonada funcione con capas de células confluentes en los electrodos, ya que los cultivos dispersos interferirán con la sensibilidad, reproducibilidad e interpretación de datos. Un requisito previo adicional para la supervisión exitosa de la activación del receptor incluso en monocapas de células confluentes es un cambio en la forma celular a lo largo de la cascada de transducción de señal. Si las células en estudio no cambian su morfología a lo largo del experimento, las lecturas basadas en impedancia son ciegas y no informarán sobre ningún cambio en la actividad del receptor. Para diseñar correctamente el protocolo de adición en serie, se recomienda la prueba previa inicial en el modo convencional de concentración de uno-bien-uno para determinar el rango de concentración del agonista aproximadamente y el intervalo de tiempo entre las adiciones agonistas posteriores. Los intervalos de tiempo entre las dosis secuenciales del agonista deben adaptarse de tal forma que el sistema adopte un nuevo equilibrio antes de la siguiente dosis más alta. En consecuencia, el método puede ser menos útil para los receptores que desencadenan una respuesta muy rápida y sólo transitoria de las células o una respuesta muy lenta que puede tardar horas en completarse. Esta última situación aumentaría el tiempo total del experimento y pediría protocolos de adición paralelos para reducir el tiempo de laboratorio. En los ejemplos presentados anteriormente, el tiempo de ejecución total del experimento fue de 2,5 – 3,5 h, dependiendo del número de concentraciones (8 o 10) y una posible preincubación con antagonista. El mismo experimento en el modo de adición agonista paralelo convencional sólo tomaría 1 h para el mismo modelo de receptor celular, pero con un rendimiento mucho menor. Una clara ventaja del enfoque serial es que el número de concentraciones que deben probarse para una relación dosis-respuesta completa no está limitado por el número de pozos disponibles. Si se necesitan concentraciones agonistas más altas, el experimento se extiende y completa fácilmente sin ningún trabajo adicional de cultivo celular. La adición agonista en sí debe llevarse a cabo cuidadosamente, ya que algunas células son sensibles a la tensión cortante y responden con cambios de impedancia considerables simplemente debido a la estimulación mecánica impuesta por la manipulación de líquidos. Las células podrían incluso salir del electrodo. Sin embargo, este problema no es exclusivo de la supervisión de celdas basada en impedancia, pero también se aplica a otras técnicas. Para las células sensibles se recomienda el modo de adición 1 debido a la reducción de la carga mecánica en las células. Sin embargo, este modo funciona con menores volúmenes de líquido durante la adición, lo que aumenta el riesgo de mezcla incompleta, ya que no se recomienda una agitación intensiva para evitar respuestas celulares inespecíficas.
El modo de adición 1 va junto con un aumento escalonado del volumen total en el pozo, mientras que el modo 2 mantiene el volumen total constante ya que las cantidades iguales de solución se eliminan secuencialmente. Estas son sólo las dos estrategias extremas y podrían adaptarse para tipos de células especiales, formatos multi-pozo o diseños de electrodos de cualquier manera intermedia. En el caso del modelo U373-MG/H1R se han observado ligeras diferencias en los valores EC50 y EMax para el modo de adición en serie en comparación con el modo de adición paralelo convencional (serie, N a 30: EC50: (0,8 x 0,3) m, EMáx.:(1,9 x 0,2) k o paralelo, N a 15: EC50: (0,5 a 0,2) , EMax: (1,3 x 0,3) k, mientras que otros modelos de células/receptores no mostraban ninguna diferencia. Los cambios en los valores EC50 y EMax podrían originarse a partir de la desensibilización del receptor que es más probable que ocurra cuando los receptores están expuestos al agonista durante tiempos más largos. La influencia de la desensibilización dependerá en gran fuerza del receptor y del ligando bajo estudio. Queda por aclarar si un análisis detallado de la adición agonista serial y paralela puede proporcionar un nuevo medio para estudiar la desensibilización del receptor.
Recomendamos realizar un experimento de control con la adición agonista de modo paralelo convencional con el fin de probar posibles cambios en las curvas de dosis-respuesta. Otros controles deben incluir una muestra tratada únicamente con medio/disolvente en dosis adecuadas para desentrañar cualquier efecto debido a la carga de disolvente o tensión mecánica a la adición media. Esto se vuelve particularmente importante si la solución en stock del ligando se prepara en otros disolventes distintos del medio (por ejemplo, DMSO, etanol). Al investigar el efecto de diferentes ligandos se debe incluir un agonista estándar como referencia.
Las instrucciones futuras deben incluir unidades automáticas de manipulación de líquidos, lo que podría permitir una dosificación o valoración completamente automatizada. La aplicación del modo de adición en serie en sistemas de perfusión tiene un gran potencial para los enfoques de laboratorio en un chip y órgano a-chip, así como para experimentos realizados bajo tensión de cizallamiento líquido.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Barbara Goricnick y Nadja Hinterreiter por su ayuda con el cultivo celular y la preparación de soluciones experimentales. Los autores agradecen el apoyo financiero del Research Training Group 1910 "Medicina química de ligandos GPCR selectivos" financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) bajo el número de subvención 222125149. JAS está particularmente agradecido por una beca otorgada por el Programa Bávaro de Igualdad de Género.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
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