هنا ، نقدم طريقة لتصور استيعاب 3 kDa تكساس الأحمر المسمى dextran في خلايا الشعر السمعية مع قنوات mechanotransduction وظيفية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام dextrans من 3-10 كيلو دا لدراسة الخلايا الانبسية في الشعر والخلايا الداعمة لجهاز كورتي.
تلعب قناة mechanotransduction خلية الشعر (MET) دورًا مهمًا في السمع. ومع ذلك ، فإن الهوية الجزيئية والمعلومات الهيكلية للMET لا تزال غير معروفة. كشفت الدراسات الكهربية لخلايا الشعر أن قناة MET لديها التوصيل الكبير ونفاذها إلى جزيئات الموجبة الفلورية الكبيرة نسبيا، بما في ذلك بعض الأصباغ الستيريلي والمضادات الحيوية الأمينوغليكوسيد تكساس الحمراء المسمى. في هذا البروتوكول، ونحن نصف طريقة لتصور وتقييم الاستفادة من dextrans الفلورسنت في خلايا الشعر من الجهاز من explants كورتي التي يمكن استخدامها لتفحص لقنوات MET وظيفية. وجدنا أن 3 kDa تكساس الأحمر المسمى dextran على وجه التحديد تسميات خلايا الشعر السمعية الوظيفية بعد 1-2 h الحضانة. على وجه الخصوص، 3 كدا dextran تسميات اثنين من صفوف ستيريوسيليا أقصر ويتراكم في جسم الخلية في نمط منتشر عندما قنوات MET وظيفية موجودة. لوحظ نمط إضافي يشبه الحويصلة من الوسم في جسم الخلية من خلايا الشعر والخلايا الداعمة المحيطة بها. تشير بياناتنا إلى أنه يمكن استخدام 3 kDa Texas-Red dextran لتصور ودراسة مسارين لإستمعاء الصبغة الخلوية. طريق دخول خاص بخلية الشعر من خلال قنوات MET الوظيفية وenocytosis ، وهو نمط متاح أيضًا لـ dextran الأكبر.
خلايا الشعر في الأذن الداخلية هي الخلايا الحسية التي تكشف الصوت وسرية المحفزات ميكانيكيا في الإشارات الكهربائية، والتي يتم تفسيرها في نهاية المطاف من قبل الدماغ. هذه الخلايا لديها حزمة على شكل درج من ثلاثة صفوف من خيوط المستندة إلى أكتين، والمعروفة باسم stereocilia، والتي تبرز من منطقتهم apical1،2. المحفزات الميكانيكية تحويل خيوط stereocilia نحو أطول صف والزناد فتح قنوات mechanotransduction (MET)3. فتح قنوات MET يؤدي إلى تدفق الاتلاف التي depolarizs الخلية وبالتالي يشير إلى الإفراج عن الحويصلات المشبك في المنطقة القاعدية من خلية الشعر.
وقد تميزت الخصائص البيوفيزيائية للقناة MET الضرورية للسمع على نطاق واسع. من بين خصائص أخرى، وهذه القنوات هي انتقائية الكاتيون ية ولها التوصيل كبيرة نسبيا (150-300 pS في كاليفورنيا منخفضة2 +)4،5،6،7،8،9،10. ومن اللافت للنظر أن جزيئات الفلورسنت الكبيرة مثل FM1-43 وتكساس الحمراء المسماة الأمينوغليكوزيدات هي حاصرات محاذية لقناة MET، مما يؤدي إلى تراكمها في جسم خلايا الشعر التي يمكن تصورها باستخدام المجهر الفلوري11،12،13،14. وعلى العكس من ذلك، ظلت الهوية الجزيئية وبنية قناة MET ومسار نفاذها بعيدي المنال. تشير الأدلة التجريبية المتزايدة إلى أن بروتين القناة العابر للأغشية 1 (TMC1) هو مكون من قناة MET في خلايا الشعر الناضجة15،16،17،18،19. الطفرات في القناة العابرة للأغشية 1 (TMC1) تغير خصائص قناة MET19،20،21،22 وتسبب الصمم. بالإضافة إلى ذلك ، TMC1 توطين موقع قناة MET18،23 ويتفاعل مع وصلة تلميح المسؤولة عن نقل القوة الميكانيكية إلى قناة MET24،25. وعلاوة على ذلك، فقد حددت تحليل المعلوماتية الحيوية الأخيرة البروتينات TMC كما التطورية المتعلقة قنوات mechanosensitive TMEM63/OSCA البروتينات والبروتينات TMEM16، وهي عائلة من قنوات كلوريد الكالسيوم تفعيلها والمخفوقات الدهون26،27،28. وكشف نموذج هيكلي من TMC1 على أساس العلاقة بين هذه البروتينات وجود تجويف كبير في واجهة البروتين والدهون27. هذا التجويف يأوي الطفرات TMC1 اثنين التي تسبب فقدان السمع المهيمنة الأوتوسومية (DFNA36)27،29،30،31،32، والتعديل الانتقائي للطفرات السيستين للمخلفات في تجويف تغيير خصائص قناة MET28، مشيرا إلى أنه يمكن أن تعمل كمسار نفاذية من قناة MET. الحجم الكبير لهذا التجويف المتوقع في بروتينات TMC يمكن أن يفسر قدرة الجزيئات الكبيرة على اختراق قناة MET. لاختبار التنبؤ بأن قناة MET تحتوي على مسار نفاذية كبير بشكل غير عادي ولدفع حدود حجم التجويف الملاحظ في TMC1 ، وضعنا بروتوكولًا لإجراء تجارب التموعات في جهاز Corti explants مع جزيء أكبر ، 3 KDa dextran الفلوري المسمى بـ Texas Red.
Dextran هو متعدد السكاريد المتفرع ة المعقدة التي تتألف من العديد من جزيئات D-الجلوكوز ملزمة بوصلات ألفا-1,6 جليكوسيديك. الذوبان عالية في الماء، سمية الخلايا المنخفضة، وbioinertity جعله أداة متعددة الاستخدامات لدراسة العديد من العمليات الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، dextran يتوفر في مجموعة واسعة من الأحجام ووصفت الفلورسنت مع الفلوروفوريات من عدة ألوان. وتستخدم عادة dextrans المسمى الفلوري في أبحاث نفاذية الخلايا والأنسجة33،34، لدراسة الانبطفي في أنظمة خلوية متعددة35،36، ولتتبعالعصبية 37،38. في المجال السمعي ، تم استخدام جزيئات dextran أيضًا لتقييم اضطراب تقاطع الخلية وفقدان سلامة الظهارة الحسية السمعية بعد التعرض لضوضاء شديدة في جهاز الشينشيلا في Corti39،40.
في هذا العمل، استغلنا خصائص بعض من أصغر (3 و 10 كيلو دا) الفلورسنت dextrans لإجراء تجارب التموجدا في خلايا شعر الأذن الداخلية المورين واستكشاف حجم مسار نفاذية من قناة الأذن الداخلية الشعر MET الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمنا المجهر البؤري بالليزر (LSM) 880 المجهز بكاشف Airyscan لتصور وتوطين dextran الفلوري في المجسمة وجسم الخلية من خلايا الشعر السمعية.
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تجارب التمويع في جهاز مورين من Explants Corti مع 3 kDa dextran Texas Red. والهدف من هذه الطريقة هو اختبار ما إذا كانت جزيئات أكبر من غيرها من التجارب السابقة قادرة أيضا على تسمية خلايا الشعر السمعية على وجه التحديد وتتخلل من خلال قناة MET. وقد استخدمت بروتوكولات تجريبية مماثلة …
The authors have nothing to disclose.
نشكر فنسنت شرام من المجهر NICHD والتصوير الأساسية للمساعدة في الحصول على صورة confocal، وTsg-Hui تشانغ للحصول على مساعدة لا تقدر بثمن مع إدارة المستعمرة ورعاية الفئران. تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الجدران من NINDS، المعاهد القومية للصحة، Bethesda، MD، إلى K.J.S. A.B. بدعم من برنامج البحوث داخل الجدران من NINDS، المعاهد القومية للصحة، وزمالة روبرت وينتهولد ما بعد الدكتوراه من برنامج البحوث داخل المدرسة من NIDCD.
#1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |