Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.
Saç hücreli meçakondüksiyon (MET) kanalı işitmede önemli bir rol oynar. Ancak MET’nin moleküler kimliği ve yapısal bilgileri bilinmemektedir. Saç hücrelerinin elektrofizyolojik çalışmalar MET kanalı büyük bir iletkenlik olduğunu ve nispeten büyük floresan katyonik moleküllere geçirilebilir olduğunu ortaya koymuştur, bazı stratil boyalar ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozit antibiyotikler de dahil olmak üzere. Bu protokolde, fonksiyonel MET kanalları için analiz etmek için kullanılabilecek Corti eksbitkilerinin organının saç hücrelerindeki floresan dekstrans alımını görselleştirmek ve değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bulduk 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran özellikle etiketler fonksiyonel işitsel saç hücreleri 1-2 h kuluçka sonra. Özellikle, 3 kDa dextran etiketler iki kısa stereocilia satır ve fonksiyonel MET kanalları mevcut olduğunda bir diffüz desen hücre gövdesinde birikir. Saç hücrelerinin hücre vücudunda ve destekleyici hücrelerde vezür benzeri bir etiketleme deseni gözlendi. Verilerimiz, hücresel boya alımı için iki yolu görselleştirmek ve incelemek için 3 kDa Texas-Red dextran’ın kullanılabileceğini göstermektedir; fonksiyonel MET kanalları ve endositoz yoluyla bir saç hücresi özgü giriş yolu, bir desen de büyük dextran için kullanılabilir.
İç kulağın saç hücreleri, sesi algılayan ve elektrik sinyallerindeki mekanik uyaranları getkileyen duyu hücreleridir ve bu hücreler sonuçta beynimiz tarafından yorumlanır. Bu hücreler, stereosilya olarak bilinen ve apikal bölge1,2’dençıkıntı yapan üç sıra aktin bazlı filamentten oluşan merdiven şeklinde bir demet vardır. Mekanik uyaranlar stereositif filamentleri en uzun sıraya doğru saptırır ve meçakontransdüksiyon (MET) kanallarının açılmasını tetikler3. MET kanallarının açılması hücrede polarize ve dolayısıyla saç hücresibazal bölgede sinaps veziküllerin serbest sinyalleri katyon akını yol açar.
MET kanalının işitme için gerekli olan biyofiziksel özellikleri kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. Diğer özellikleri arasında, bu kanallar katyonik seçici ve nispeten büyük iletkenlik var (150-300 düşük Ca2 +pS )4,5,6,7,8,9,10. Dikkat çekici, FM1-43 ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozitler gibi büyük floresan moleküller MET kanalının perkast blokerler, floresan mikroskopi11,12,13,14kullanılarak görselleştirilebilir saç hücre gövdesinde bunların birikimi ile sonuçlanan . Tam tersine, MET kanalının moleküler kimliği ve yapısı ve geçirim yolu zor kalmıştır. Deneysel kanıt artan transmembran benzeri kanal protein 1 (TMC1) olgun saç hücrelerinde MET kanalının bir bileşeni olduğunu gösterir15,16,17,18,19. Transmembran benzeri kanal 1 ‘deki (TMC1) mutasyonlar MET kanal özelliklerini19,20,21,22 olarak değiştirir ve sağırlık lara neden olur. Buna ek olarak, TMC1 MET kanal18,23 sitesine lokalize ve MET kanal24,25mekanik kuvvet iletimi sorumlu ucu bağlantı ile etkileşime . Ayrıca, son biyoinformatik analizi mechanosensitive kanalları TMEM63/OSCA proteinleri ve TMEM16 proteinleri, kalsiyum aktive klorür kanalları ve lipid scramblases bir aile ile ilgili evrimsel olarak TMC proteinleri tespit etmiştir26,27,28. Bu proteinler arasındaki ilişkiye dayanan TMC1 yapısal bir model protein-lipid arayüzü nde büyük bir kavite varlığını ortaya27. Bu kavite otozomal dominant işitme kaybına neden iki TMC1 mutasyonu barındıran (DFNA36)27,29,30,31,32, ve kavite kalıntıları için sistein mutantların seçici modifikasyonMET kanal özellikleri değiştirmek28, MET kanalının permeasyon yolu olarak işlev olabileceğini belirten. TMC proteinlerinde öngörülen bu kavitenin büyük boyutu, büyük moleküllerin MET kanalına nüfuz etme yeteneğini açıklayabilir. MET kanalının alışılmadık derecede büyük bir permeasyon yolu içerdiği öngörüsünü test etmek ve TMC1’de gözlenen boşluğun büyüklüğünün sınırlarını zorlamak için Corti ekspertizlerinin organında daha büyük bir moleküle sahip 3 kDa dextran floresan ile alım deneyleri yapmak için bir protokol geliştirdik.
Dextran alfa-1,6 glikozidik bağlantılarla bağlanmış birçok D-glukoz molekülünden oluşan karmaşık dallı bir polisakkarittir. Su, düşük hücre toksisitesi ve biyoinertite yüksek çözünürlük çeşitli hücresel süreçleri incelemek için çok yönlü bir araç yapmak. Buna ek olarak, dextran boyutları geniş bir yelpazede mevcuttur ve floresan çeşitli renk floroforlar ile etiketlenmiş. Floresan etiketli dekstrans yaygın hücre ve doku geçirgenlik araştırma33,34, birden fazla hücresel sistemlerde endositon çalışması için kullanılır35,36, ve nöral izleme için37,38. İşitsel alanda, dextran molekülleri de hücre-hücre kavşak bozulması ve Corti chinchilla organında yoğun gürültüye maruz kaldıktan sonra işitsel duyusal epitel bütünlüğünün kaybı nı değerlendirmek için kullanılmıştır39,40.
Bu çalışmada, bazı küçük özellikleri istismar (3 ve 10 kDa) floresan deksan dextrans minten iç kulak saç hücrelerinde alım deneyleri gerçekleştirmek ve iç kulak saç hücresi MET kanalının permeasyon yolunun boyutunu keşfetmek için. Buna ek olarak, stereositya ve işitsel saç hücrelerinin hücre gövdesinde floresan dekstran görselleştirmek ve lokalize etmek için airyscan dedektörü ile donatılmış bir lazer tarama konfokal mikroskop (LSM) 880 kullandık.
Bu protokol, 3 kDa dextran Texas Red ile Corti ekstremitelerinin murine organında alım deneylerinin nasıl yapılacağını açıklar. Bu yöntemin amacı, daha önce test edilmiş diğerlerinden daha büyük moleküllerin aynı zamanda işitsel saç hücrelerini özel olarak etiketleyip MET kanalına nüfuz edip edemediğini test etmektir. Benzer deneysel protokoller daha önce FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 ve Texas Kırmızı et…
The authors have nothing to disclose.
Biz confocal görüntü edinimi yardımcı olmak için NICHD mikroskobu ve görüntüleme çekirdek Vincent Schram teşekkür, ve Tsg-Hui Chang koloni yönetimi ve fare bakımı ile paha biçilmez yardım için. Bu araştırma NINDS, NIH, Bethesda, MD Intramural Araştırma Programı tarafından K.J.S. A.B. tarafından NINDS, NIH Intramural Araştırma Programı ve intramural araştırma programından Robert Wenthold Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmiştir. NIDCD’nin.
#1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |