Summary
Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.
Abstract
Saç hücreli meçakondüksiyon (MET) kanalı işitmede önemli bir rol oynar. Ancak MET'nin moleküler kimliği ve yapısal bilgileri bilinmemektedir. Saç hücrelerinin elektrofizyolojik çalışmalar MET kanalı büyük bir iletkenlik olduğunu ve nispeten büyük floresan katyonik moleküllere geçirilebilir olduğunu ortaya koymuştur, bazı stratil boyalar ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozit antibiyotikler de dahil olmak üzere. Bu protokolde, fonksiyonel MET kanalları için analiz etmek için kullanılabilecek Corti eksbitkilerinin organının saç hücrelerindeki floresan dekstrans alımını görselleştirmek ve değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bulduk 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran özellikle etiketler fonksiyonel işitsel saç hücreleri 1-2 h kuluçka sonra. Özellikle, 3 kDa dextran etiketler iki kısa stereocilia satır ve fonksiyonel MET kanalları mevcut olduğunda bir diffüz desen hücre gövdesinde birikir. Saç hücrelerinin hücre vücudunda ve destekleyici hücrelerde vezür benzeri bir etiketleme deseni gözlendi. Verilerimiz, hücresel boya alımı için iki yolu görselleştirmek ve incelemek için 3 kDa Texas-Red dextran'ın kullanılabileceğini göstermektedir; fonksiyonel MET kanalları ve endositoz yoluyla bir saç hücresi özgü giriş yolu, bir desen de büyük dextran için kullanılabilir.
Introduction
İç kulağın saç hücreleri, sesi algılayan ve elektrik sinyallerindeki mekanik uyaranları getkileyen duyu hücreleridir ve bu hücreler sonuçta beynimiz tarafından yorumlanır. Bu hücreler, stereosilya olarak bilinen ve apikal bölge1,2'dençıkıntı yapan üç sıra aktin bazlı filamentten oluşan merdiven şeklinde bir demet vardır. Mekanik uyaranlar stereositif filamentleri en uzun sıraya doğru saptırır ve meçakontransdüksiyon (MET) kanallarının açılmasını tetikler3. MET kanallarının açılması hücrede polarize ve dolayısıyla saç hücresibazal bölgede sinaps veziküllerin serbest sinyalleri katyon akını yol açar.
MET kanalının işitme için gerekli olan biyofiziksel özellikleri kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. Diğer özellikleri arasında, bu kanallar katyonik seçici ve nispeten büyük iletkenlik var (150-300 düşük Ca2 +pS )4,5,6,7,8,9,10. Dikkat çekici, FM1-43 ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozitler gibi büyük floresan moleküller MET kanalının perkast blokerler, floresan mikroskopi11,12,13,14kullanılarak görselleştirilebilir saç hücre gövdesinde bunların birikimi ile sonuçlanan . Tam tersine, MET kanalının moleküler kimliği ve yapısı ve geçirim yolu zor kalmıştır. Deneysel kanıt artan transmembran benzeri kanal protein 1 (TMC1) olgun saç hücrelerinde MET kanalının bir bileşeni olduğunu gösterir15,16,17,18,19. Transmembran benzeri kanal 1 'deki (TMC1) mutasyonlar MET kanal özelliklerini19,20,21,22 olarak değiştirir ve sağırlık lara neden olur. Buna ek olarak, TMC1 MET kanal18,23 sitesine lokalize ve MET kanal24,25mekanik kuvvet iletimi sorumlu ucu bağlantı ile etkileşime . Ayrıca, son biyoinformatik analizi mechanosensitive kanalları TMEM63/OSCA proteinleri ve TMEM16 proteinleri, kalsiyum aktive klorür kanalları ve lipid scramblases bir aile ile ilgili evrimsel olarak TMC proteinleri tespit etmiştir26,27,28. Bu proteinler arasındaki ilişkiye dayanan TMC1 yapısal bir model protein-lipid arayüzü nde büyük bir kavite varlığını ortaya27. Bu kavite otozomal dominant işitme kaybına neden iki TMC1 mutasyonu barındıran (DFNA36)27,29,30,31,32, ve kavite kalıntıları için sistein mutantların seçici modifikasyonMET kanal özellikleri değiştirmek28, MET kanalının permeasyon yolu olarak işlev olabileceğini belirten. TMC proteinlerinde öngörülen bu kavitenin büyük boyutu, büyük moleküllerin MET kanalına nüfuz etme yeteneğini açıklayabilir. MET kanalının alışılmadık derecede büyük bir permeasyon yolu içerdiği öngörüsünü test etmek ve TMC1'de gözlenen boşluğun büyüklüğünün sınırlarını zorlamak için Corti ekspertizlerinin organında daha büyük bir moleküle sahip 3 kDa dextran floresan ile alım deneyleri yapmak için bir protokol geliştirdik.
Dextran alfa-1,6 glikozidik bağlantılarla bağlanmış birçok D-glukoz molekülünden oluşan karmaşık dallı bir polisakkarittir. Su, düşük hücre toksisitesi ve biyoinertite yüksek çözünürlük çeşitli hücresel süreçleri incelemek için çok yönlü bir araç yapmak. Buna ek olarak, dextran boyutları geniş bir yelpazede mevcuttur ve floresan çeşitli renk floroforlar ile etiketlenmiş. Floresan etiketli dekstrans yaygın hücre ve doku geçirgenlik araştırma33,34, birden fazla hücresel sistemlerde endositon çalışması için kullanılır35,36, ve nöral izleme için37,38. İşitsel alanda, dextran molekülleri de hücre-hücre kavşak bozulması ve Corti chinchilla organında yoğun gürültüye maruz kaldıktan sonra işitsel duyusal epitel bütünlüğünün kaybı nı değerlendirmek için kullanılmıştır39,40.
Bu çalışmada, bazı küçük özellikleri istismar (3 ve 10 kDa) floresan deksan dextrans minten iç kulak saç hücrelerinde alım deneyleri gerçekleştirmek ve iç kulak saç hücresi MET kanalının permeasyon yolunun boyutunu keşfetmek için. Buna ek olarak, stereositya ve işitsel saç hücrelerinin hücre gövdesinde floresan dekstran görselleştirmek ve lokalize etmek için airyscan dedektörü ile donatılmış bir lazer tarama konfokal mikroskop (LSM) 880 kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (KJS'ye #1336 Hayvan protokolü) tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Fareler
- Yavruların doğum tarihini kontrol etmek ve yavruların yaşını takip etmek için hayvan tesisinde üremek için C57BL/6J yabani tip üreme çiftleri bir çift ayarlayın.
2. Kokleae Diseksiyonu
- Diseksiyonları gerçekleştirmek için stereomikroskoba yakın temiz bir alan ayarlayın(Şekil 1A). Alanı ve çevreyi temizlemek ve temiz bir tezgah pedi yerleştirmek için %70 etanol kullanın. Bir Tıbbi Patolojik Atık (MPW) plastik torba hayvan leşleri atmak için gerekli olacaktır.
- Bazı Leibovitz's L15 medya ile birkaç 35 mm yemekler hazırlayın.
NOT: Leibovitz's L-15 hücreli medya içerir 1-2 mM Ca2 +, uç bağlantılarının bütünlüğünü korumak için gerekli olan, ve esansiyel amino asitler içerir, vitaminler, ve hücre sağlığını ve sağkalımını artırmak için sodyum pirüuvat. Serum, düşük tanımlı bileşimi ve dekstran ile potansiyel girişim nedeniyle deneysel değişkenlik önlemek için dışlandı. - Doğum sonrası-gün-6 (P6) farelerin kafasını nisbeten ötenazi.
NOT: 6 günlük fareler inhalant anestezilere karşı biraz dirençlidir. Ötenazi için izofluran veya uzun süreli CO2 pozlama (50 dakikaya kadar) kullanılsa da, ölümü sağlamak için ikincil bir fiziksel yöntem önerilir. - Arka uç ve dış işitsel kanallar arasında ön yüzeysel bir kesim yaparak kafatası deri kaldırmak için cerrahi makas kullanın.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için deriyi buruna doğru katlayın (Şekil 2B).
- Arkadan kafatasının önüne ve göz çizgisinden(Şekil 2B-C)bir kesi yapın.
- Kafatasını iki ye ayırın ve temporal kemikleri ortaya çıkarmak için küçük bir spatula kullanarak beyni çıkarın (Şekil 2C-D).
- Küçük makas ile, temporal kemiklerin etrafında kesilmiş ve doku çıkarmak.
- Her iki temporal kemiği de 35 mm'lik bir tabağa yerleştirin ve L15 media(Şekil 2E)ile kaplanmış olduğundan emin olun.
NOT: Aşağıdaki adımlar stereomikroskop altında gerçekleştirilir. Siyah bir arka plan genellikle ince diseksiyon adımları sırasında doku görselleştirmek için yardımcı olur. - Geniş alan lı bir mercek (10X büyütme gücü (WF10X) ve harici alternatif akım (AC) halojen ışık kaynağı ile donatılmış stereomikroskop altında, çevredeki koklea dokularını, yarım daire kanalları ve cerrahi çalgılarile vestibüler organları çıkarın(Şekil 2F).
- Dextran ve L15 medyasının koklear kanala girmesine izin vermek için, biri yuvarlak pencerede diğeri apikal koklear bölgede olmak üzere, parçalanmış kokleae üzerinde iki delik sınırı gerçekleştirin.
- 9 kuyulu cam depresyon plakasından her kuyuya 300 mL Leibovitz'in L15 ortamı ekleyin.
- Her kuyuya en az üç tane parçalanmış kokleae yerleştirin.
3. Dextran Etiketleme
- Hanks'in dengeli tuz çözeltisindeki dekstranı Ca2+ ve Mg2+ (HBSS-CFM) olmadan 10 mg/mL'lik son konsantrasyonda yeniden oluşturun. Bu stok çözeltisi opak siyah tüplerde (ışıktan korunmuş) ve kullanıma kadar -30 °C'de saklanmalıdır.
NOT: Lizin düzeltilebilir dextran kullanımı bu protokolün başarılı bir sonucu için çok önemlidir. - Leibovitz'in L15 media'sının 500 mL'sinde her dekstran 2 mg/mL'lik son konsantrasyonda hazırlayın.
- Kokleadan ortamı çıkarın ve Leibovitz'in 2 mg/mL'lik son konsantrasyonda ilgi dekstraniçeren L15 ortamını ekleyin.
NOT: MET kanallarının bir kısmı41,42'deaçık olmasına rağmen, MET kanalının açık olasılığını artırmak için ekskütiflerin hafifçe sallanması ile dextran kuluçka işlemi gerçekleştirilmiştir. - 25° eğimli açıya sahip 3 boyutlu bir çalkalayıcı kullanarak hafif sallayarak 2 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatın ..
NOT: Floresan etiketli dextran mümkünolduğunda ışıktan korunmalıdır. 2 saat kuluçka sırasında dextran korumak için, alüminyum folyo sarılmış bir hücre kültürü P150 çanak içine 9 iyi cam plaka yerleştirin.
4. Görüntüleme için Örnek Hazırlama
- Dekstran ile kuluçkadan sonra, 2 dk boyunca iki kez media ve bir kez HBSS ile doku yıkayın.
- Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) %4 paraformaldehit ile 30 dk oda sıcaklığında doku kuluçka.
DİkKAT: Formaldehite maruz kalmak gözlerde, burunda ve üst solunum yollarında tahriş edici olabilir. Bazı kişilerde, formaldehit tekrarlanan cilt maruziyeti alerjik dermatit neden olabilir duyarlılık neden olabilir. Formaldehit bilinen bir insan karsinojenve şüpheli bir üreme tehlikesidir. - Paraformaldehiti çıkarmak için sabit dokuyu HBSS ile iki kez hızlı ve hafifçe yıkayın.
NOT: Kokleanın bu gelişim evresinde temporal kemiklerin kireçlenmesine gerek yoktur. - Corti organını incelemek için spiral ligamenti ve tektorial membranı ince uçlu terpler ile çıkarın (Şekil 2G).
- Doku tüm küçük parçaları çıkarın ve HBSS ile doku yıkayın.
- F-aktin etiketlemek ve görselleştirmek için 30 dakika boyunca 1:200 seyreltme de floresan etiketli phalloidin içeren PBS%0.5 Triton X-100 dokuyu permeabilize (TR veya FITC etiketli dextran alımını test ederken yeşil veya kırmızı konjuge) aktin bazlı stereocilia.
- Triton ve phalloidin fazlalığı kaldırmak için HBSS tampon ile 2-3 dakika her zaman doku yıkayın ve bir kez PBS ile tuzları kaldırmak için.
- Corti dokularının organını mikroskop slaytına monte edin ve üzerini montaj lı ortamla kapatın.
NOT: Doku monte ederken, saç hücresi stereocilia içeren doku tarafında coverslip karşı karşıya olduğundan emin olun. - Montaj ortamının eklenmesi sırasında oluşan olası kabarcıkları çıkarın ve kapak kaymasının yerleştirilmesi sırasında yeni kabarcıkların oluşmasını önleyin.
NOT: Bir pipet ile aspire herhangi bir kabarcık montaj ortamının eklenmesi sırasında oluşturulan. Hava kabarcıklarının örtü altında sıkışıp kalmamasını önlemek için, coverslip'in kenarını numunenin yakınına yerleştirin ve coverslip'i forceps veya pipet ucu kullanarak dikkatlice ve yavaşça doku üzerinde indirin. - Montaj ortamlarında dokuyu cam bir kapak fişi ile kapatın (Şekil 2H).
NOT: 0,4'ün üzerinde sayısal diyafram açıklığına sahip hedefler, #1,5 kapaklı (0,17 mm kalınlık) kullanacak şekilde tasarlanmıştır. Yanlış kapak kaymasını kullanmak, görüntülerin yoğunluğu ve kalitesi açısından ciddi sonuçlar doğurabilir. - Monte edilen dokuyu oda sıcaklığında bir gece boyunca kuluçkaya yatırın ve montaj ortamının kurumasını bekleyin ve slaytları görüntülemeye kadar 4 °C'de saklayın.
5. Görüntü Edinme ve Görüntü İşleme
NOT: Konfokal görüntüler, süper çözünürlüklü (SR) mod 43 ve63x objektifte 32 kanallı Airyscan dedektörü ile donatılmış lsm 880 konfokal mikroskop ile çekildi.
- Amaç daldırma yağı küçük bir damla ekleyin.
- Monte edilmiş doku örneğini içeren mikroskop slaytını, daldırma yağına bakan cam kapak lı mikroskop aşamasına yerleştirin.
- Örneğe odaklanın ve görüntü edinme yazılımını kullanarak görüntüleme parametrelerini ayarlayın.
- Her bağımsız deneme için x, y ve z çözünürlüğü için aynı görüntü alma ayarlarını ve en uygun parametreleri kullanın. Bir piezo odaklı odak sistemi hızlı ve hassas görüntü z-yığın elde ederken hedefi taşımak için gereklidir.
NOT: Saç hücrelerinin tüm apikal bölgesini görüntülemek için, en uygun ayarları kullanarak stereocilia'dan saç hücresi vücudunun apikal yarısına kadar bir z-görüntü yığını toplayın. Vezikül benzeri parçacıkların görüntülenmesi için saç hücresi boyunca büyük bir z-yığını toplamak çok önemlidir. - Airyscan 3D yeniden yapılandırma algoritmasını kullanarak ham confocal görüntüleri otomatik varsayılan dekonvolution filtresi ayarlarıyla işlemek için görüntü edinme yazılımını kullanın.
- Parlaklığı ve kontrastı ayarlamak, ölçek çubuğunu eklemek ve son rakamlar için görüntüleri dışa aktarmak için görüntü işleme yazılımındaki konfokal görüntüleri açın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz 3 kDa dextran floresan Texas Red (dextran-TR)(Şekil 2A-B)ile etiketli yabani tip postnatal-day-6 (P6) farelerden Corti ekstrenlerin organ 2h kuluçka sonra saç hücrelerinin sağlam ve spesifik etiketleme gözlendi. Dekstran etiketleme, Corti organının bazal, orta ve apikal bölgelerinde hem iç hem de dış saç hücrelerinde (IHC ve OHC) gözlendi(Şekil 2B).
Floresan etiketli phalloidin filamentöz aktin (F-aktin) karşı ve aktin bazlı saç hücre stereocilia görselleştirmek için kullanılmıştır. Daha kısa kuluçka zamanlarında da benzer deneyler yaptık ve saç hücresi gövdesinde dekstran-TR birikimini gözlemlesek de sinyaller 2 saat kuluçkadakilere göre daha zayıf ve değişkendi(Şekil 2C).
Daha sonra saç hücrelerinin hem stereosilya ve hücre organları görüntülenmiş ve sadece kendi hücre vücudunda 3 kDa dextran-TR içeren bu hücrelerin stereositya floresan etiketleme gösterdi gözlendi(Şekil 3A). Stereosilya ve hücre vücut etiketleme arasındaki bu ilişki hasarlı dokudan saç hücrelerinde yoktu, ayrıca duyusal epitel çeşitli hücre tiplerinde dextran spesifik olmayan etiketleme sundu (Şekil 2Bsarı kareler , ve Şekil 3B). Daha da önemlisi, MET kanalının bulunduğu kısa stereosilya satırlarının uçlarında zenginleştirme ile stereosita boyunca tek tip floresan sinyali gözlemledik18,23 (Şekil 3C). Ayrıca, saç hücrelerinin hücre vücudunda vezikül benzeri yapılar ve komşu destek hücreleri fark ettik. Bu hücrelerde vezikül benzeri alım deseni dekstran-TR'nin de endositoz la alınabileceğini düşündürmektedir (Şekil 3C).
Burada açıklanan protokol aynı zamanda daha büyük dekstrans ve farklı dekstrans kombinasyonlarının alımının incelenmesine olanak sağlar. Texas Red (dextran-TR) veya floresan (dextran-FITC) ile etiketlenmiş 10 kDa'nın daha büyük dextran'ı da saç hücrelerinin hücre vücudunda vezikül benzeri bir desen üretti ve hücreleri destekleyen hücreler, saç hücre zarının etrafında yamalı bir desen halinde birikmeye de ek olarak(Şekil 4A,B). 10 kDa dextran-TR de yüzeysel tüm saç hücrelerinin üç stereocilia satır etiketli(Şekil 4A, inset), muhtemelen saç hücre plazma zarının negatif yüklü yüzeynedeniyle44,45,46. Daha sonra Corti eksplorasyonlarının organında eş zamanlı olarak 3 kDa dextran-TR ve 10 kDa dextran-FITC alımını inceledik. 3 kDa dextran-TR için hem diffüz hem de vezikül benzeri bir desen gözlemledik. Ancak, 10 kDa dextran-FITC sadece vezikül benzeri bir desen görüntülenmiştir(Şekil 4C). Bu veriler, dekstran alımının dekstran boyutuna bağlı olarak en az iki farklı mekanizma tarafından oluştuğunu göstermektedir.
Daha sonra 3 kDa dextran-TR alımı için fonksiyonel MET kanallarının gerekli olup olmadığını değerlendirdik. Bunu yapmak için, MET kanal blokerleri (neomisin ve amilorid)13,14,47 veya Ca2 + şelatör BAPTA, ucu bağlantıları kırarak MET akımları ortadan kaldırır ve kanal25,48,49gating engelleyerek varlığında Corti ekspertiz organından saç hücrelerinde dextran dahil test . Bu deneylerde doku eksültörleri daha önce 30 dakika boyunca neomisin (500 mM), amilorid (150 mM) veya BAPTA (5mM) ile ilgili MET blokerinin varlığında 3 kDa dextran-TR eklenmeden önce kuluçkaya yatırıldı. BAPTA veya MET kanal blokerlerinin varlığı stereosite etiketlemesini(Şekil 5A)ve saç hücrelerinde 3 kDa dextran-TR alımını önledi(Şekil 5B). Ancak, MET kanalının ablukası vezikül benzeri deseni korumuştur(Şekil 5B),bu alım deseninin fonksiyonel MET kanallarından bağımsız olduğunu gösterir. Benzer sonuçlar TMC1/TMC2 çift knock-out fareler, MET eksikliği saç hücrelerinde gözlenmiştir27. İlginçtir, Bu vezikül benzeri yapılar Amilorid varlığında gözlemlenebilir değildi, Hangi Na inhibe bilinmektedir+-H+ değiştirici ve bu nedenle endositonisintin 50,51. Bu sonuçlar 3kDa dextran-TR iki farklı yollar aracılığıyla saç hücrelerine girer gösterir, bir vezikül benzeri yapılar içeren büyük dekstrans ortak ve fonksiyonel MET kanallarına bağlı başka.
Şekil 1: Corti bir minör organın diseksiyon adımları. (A) Temiz alan ve diseksiyon için gerekli malzemeler. (B) Açıkta kalan fare kafatası. Forceps burundoğru katlanmış olan deri, tutuyor. Siyah çizgiler beynin çıkarılması için gerekli olan iki kesileri gösterir. (C) İncinmiş ve bir spatula ile beynin kaldırılması için izin vermek için kafatası açıldı (sağda). (D) Beyin alındıktan sonra kafatası ve temporal kemikler. (E) Medya ile kaplı bir P35 plaka temporal kemikler (kesik siyah kareler) dahil olmak üzere excised kafatası. (F) Excised kokleae. (G) Bir cam depresyon plaka sıyrık üzerinde Corti iki parçalanmış organları. (H) Görüntülemeye hazır cam kapaklı bir üzerine monte edilmiş numune. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Saç hücreleri alımı 3 kDa dextran-TR. (A) Texas Kırmızı etiketli dextran (dextran-TR) 1.08 kDa moleküler ağırlığa karşılık gelen glikoz altı moleküliçeren şematik gösterimi. Bir succinimidyl ester reaksiyonu bir Texas Kırmızı molekülü bağlar (macenta) bir glikoz monomer için. (B) 6 günlük bir fareden Corti'nin tüm organında 3 kDa dextran-TR ile duyusal saç hücrelerinin (HC) spesifik etiketlemesini gösteren temsili konfokal görüntü. Organın bazal (BA), orta (MD) ve apikal (AP) bölgeleri belirtilir. Sarı kareler doku hasarlı bölgeleri gösterir. (C) 30, 60, 90 veya 120 dk'dan sonra 3 kDa dextran-TR floresan, Corti eksplorasyonun organı ile birlikte yeşil (üstteki görüntüler) F-aktin ile birleştirilmiş magenta'da ve gri tonlamada (alt görüntüler) bağımsız olarak gösterilir. Görüntü görüntüleme aralığı, 3 kDa dextran-TR floresanının görselleştirilmesi için gri görüntülerin her birinde doğrusal olarak ayarlandı. Ölçek çubuğu = 20 mm. Bu rakam27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Saç hücre gövdesi ve stereocilia etiketleme ile 3 kDa dextran-TR. (A) Hücre gövdesinde 3 kDa dekstran-TR floresan (macenta) görüntüleyen konfokal görüntüler ve saç hücre sınırları ve stereocilia görselleştirmek için F-actin (yeşil) etiketlemek için phalloidin ile stereosilya sayaçları. Dış saç hücrelerinin üç satır (OHC) ve iç saç hücreleri (IHC) bir satır gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 mm. (B) Hücre gövdesi ve stereocilia da 3 kDa dekstran-TR floresan (macenta) gösteren hasarlı doku bölgesinin konfokal görüntüleri. Sarı oklar duyusal olmayan destek hücrelerinin etiketlendiğini gösterir. Ölçek çubuğu = 20 mm. (C) Hücre gövdesinde 3 kDa dextran-TR floresanve dış saç hücrelerinin stereocilia (OHC, üst) ve iç saç hücrelerinin (IHC, alt) daha yakın görünümü. Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu rakam27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Daha büyük 10 kDa dextran ve 3 ve 10 kDa dextran kombinasyonunun etiketlemi. (A) Saç hücresi gövdesindeki saç hücrelerinin konfokal görüntüsü (üst) ve stereocilia (alt) düzeyleri 10 kDa dextran-TR ile kuluçkaya yatırılmış. Dekstran floresan sinyali yeşil ve bağımsız gri tonlama F-actin ile birleştirilmiş macenta gösterilir. IHC bir çift 10 kDa dextran-TR ile gözlenen stereocilia yüzeysel etiketleme takdir etmek için inset yüksek büyütme gösterilir. Ölçek çubuğu = 5 mm. (B) 10 kDa dextran-FITC ile kuluçkaya yatan saç hücrelerinin konfokal görüntüsü A. (C) Saç hücresi gövdesindeki saç hücrelerinin konfokal görüntüsü (üst) ve stereocilia (alt) düzeyleri 3 kDa dextran-TR ve 10 kDa dextran-FITC ile eş zamanlı olarak kuluçkaya yatırılır ve bağımsız kanallar kullanılarak görüntülenir ve gri renkle ayrı ayrı gösterilmiştir. Sağ panelde F-actin (mavi), 10 kDa dextran-FITC (yeşil) ve 3 kDa dextran-TR (macenta) phalloidin (mavi) ile birlikte gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 mm ve vezikül benzeri alım deseni sarı oklarla gösterilir. Bu rakam27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Fonksiyonel MET kanalları 3 kDa dEkstran-TR alımı için gereklidir. Yokluğunda 3 kDa dextran-TR ile kuluçka sonrası stereosit (A) veya hücre gövdesi(B)düzeyinde saç hücrelerinin temsili konfokal görüntüleri (kontrol) veya BAPTA veya MET kanal blokerleri amilorid ve neomisin varlığı. 3 kDa dextran-TR floresan macenta gösterilir. Doku saç hücresi stereocilia ve sınırları (yeşil) görselleştirme için F-actin etiketpoidin ile counterstained edildi. Beyaz oklar vezikül benzeri yapılara işaret eder. Dış saç hücrelerinin üç satır (OHC) ve iç saç hücreleri (IHC) bir satır gösterilir, Ölçek çubuğu = 20 mm. Bu rakam27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, 3 kDa dextran Texas Red ile Corti ekstremitelerinin murine organında alım deneylerinin nasıl yapılacağını açıklar. Bu yöntemin amacı, daha önce test edilmiş diğerlerinden daha büyük moleküllerin aynı zamanda işitsel saç hücrelerini özel olarak etiketleyip MET kanalına nüfuz edip edemediğini test etmektir. Benzer deneysel protokoller daha önce FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozitler (1.29-1.43 kDa)13,52gibi diğer floresan boyalar saç hücrelerinin geçirgenliğini değerlendirmek için kullanılmıştır . Bu floresan molekülleri kullanarak saç hücrelerinin etiketleme için gerekli zaman boyutlarına göre değişir. Maksimal etiketleme FM1-4313,53,Texas Kırmızı etiketli aminoglikozitler13için 30-60 dakika ve Texas Kırmızı etiketli 3 kDa dextran için 1,5 saat için birkaç dakika gerektirir. Bu nedenle, uzun kuluçka süreleri bu deney için çok önemlidir, çünkü kısa kuluçka zamanlarında saç hücresi gövdesinin sadece minimal etiketlemesini gördük (Şekil 2C). Bu deneyler için P6 farelerini incelemeyi seçtik çünkü bu yaşta, en apikal ve bazal saç hücreleri transdüksiyon akımları taşır ve hem TMC1 hem de TMC2 proteinlerini12, 18,54,55olarak ifade eder. MET akımları P6'dan daha erken, özellikle koklea12tabanına yakın olduğu için genç hayvanları incelemek mümkün olmalıdır. Kemik likoklea diseksiyon uğrama bu yapı56ossify devam ettikçe daha zor hale gelir, çünkü yaşlı hayvanlar çalışma daha zor olabilir.
Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. En önemlisi kortikal doku organının başarılı diseksiyon ve hazırlanmasıdır (Şekil 1). Corti organının hassas yapısı ve kemikli koklea nın encasement histolojik ve biyokimyasal analiz için bir meydan okuma sunuyor. Bu dokunun başarılı diseksiyonu için çeşitli ayrıntılı protokoller daha önce bu dergide yayınlanmıştır56,57,58 ve diğerleri59. Hücre-hücre kavşağının bozulması ve işitsel duyusal epitel bütünlüğünün kaybı 40 kDa'ya kadar dekstran alımına ve etkilenen hücrelerin etiketlemasına yol açabilir39,40. Buna uygun olarak, dekstran kuluçkadan önce diseksiyon sırasında doku kasıtsız olarak çalgılarla hasar gördüğünde saç hücrelerinin ve çevresindeki destek hücrelerinin spesifik olmayan etiketlemeleri gözlenmiştir(Şekil 2B ve Şekil 3B). Corti'nin bozulmamış bir organını uygulama ve sabır dışında diseksiyonda yeterliliğe ulaşmak için hiçbir hile veya kılavuz yoktur. Ancak, doku diseksiyonu ve alımı deneyleri sırasında 1-2 mM Ca2+'nın varlığı, mekanik kuvveti MET kanalına ileten ucu bağlantının bütünlüğünü korumak ve met kanal fonksiyonunu korumak için çok önemlidir. Doku %4 PFA ile sabitledikten sonra, tampon veya ortamda kalsiyum varlığı önemsiz hale gelir.
Bu çalışmanın sınırlamalarından biri dekstran moleküllerinin heterojen yapısında yer almaktadır. Leuconostoc bakterileri tarafından ayrıntılı dextran yaklaşık% 95 alfa-(1-6) D-bağlantıları oluşan anhidroglikoz bir polimer(Şekil 2A). Kalan bağlantılar dextran dallanma için hesap, uzunluğu ile ilişkilidir, bu yüzden düşük moleküler ağırlık dextran daha çubuk gibi ve daha büyük dextrans polidisperse60iken daha dar bir boyut dağılımı var . Bu nedenle, 3 kDa dextran her hazırlanmasında moleküllerin gerçek moleküler ağırlığı 1,5 ila 3,0 kDa arasında değişmektedir, floresan molekül de dahil olmak üzere61. Ayrıca, floresan dextran etiketli Texas Kırmızı moleküllerinin dextran (etiketleme derecesi) bağlı sayısı farklıdır. Daha düşük bir etiketleme derecesi floresan olarak etiketlenmiş dekstran'ı mikroskopi ile tespit etme yeteneğini engelleyeceği için en az 0,4 etiketleme derecesi ile dekstran kullanılması tavsiye edilir. Floresan boya dextran ve düzeltilebilir sürümlerinde lizin artıkları birleştiğinde, dextran genel şarj belirleyecektir. MET kanalının katyonik seçiciliği tercihen katyonik dekstran27alımı olacağını beri bu önemli bir husustur. Son olarak, bu deneylerde görüntülenen çözünürlüğe ulaşmak için lizin düzeltilebilir bir dextran gereklidir. Düzeltilemeyen bir dekstran doğru lokalizasyonu ve görselleştirme engel doku içine yaymak devam edecektir.
Korti örneklerinin organını görüntülemek için kullanılan Airyscan dedektörü ile donatılmış LSM 880 konfokal mikroskop, konvansiyonel konfokal mikroskoba göre iki kat çözünürlük ve daha iyi sinyal-gürültü oranı (SNR) sağladı62. Bu nedenle, bu mikroskop bize sadece hücre gövdesinde sağlam dekstran birikimini gözlemlemek için değil, aynı zamanda stereosilia ipuçları ve hücre vücudunda vezikül benzeri desen dextran birikimini tespit etmek için izin verdi. Geleneksel bir konfokal mikroskop, hücre gövdesindeki floresan dekstran birikiminin görselleştirilmesine ve ölçülmesine olanak sağlar, ancak üç stereocilia satırını ve dekstran'ın daha kısa stereocilia satırlarının uçlarında kesin lokalizasyonunu ayırt etmek zor olacaktır. LSM 880 Airyscan confocal ile elde edilene benzer bir çözünürlüğe, aşırı örnekleme ve dekonvolution içeren konvansiyonel konfokal mikroskop kullanılarak ulaşılabilmekte, ancak SNR Airyscan dedektörü ile ulaşılan çözünürlüğe göre daha düşük olacaktır.
Fonksiyonel MET kanalları için test etmek için 3 kDa dextran-TR kullanımına ek olarak, tüm dextrans test leri endositoza benzeyen hücre içi vezikül benzeri bir desen ortaya çıktığı için bu protokol saç hücrelerindeki endositik süreçleri incelemek için daha fazla kullanılabilir. Bu süreç çalışmalarımızın odak noktası değildi ve bu fenomeni tam olarak karakterize etmek için ek çalışmalar yapılması gerekecekti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz confocal görüntü edinimi yardımcı olmak için NICHD mikroskobu ve görüntüleme çekirdek Vincent Schram teşekkür, ve Tsg-Hui Chang koloni yönetimi ve fare bakımı ile paha biçilmez yardım için. Bu araştırma NINDS, NIH, Bethesda, MD Intramural Araştırma Programı tarafından K.J.S. A.B. tarafından NINDS, NIH Intramural Araştırma Programı ve intramural araştırma programından Robert Wenthold Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmiştir. NIDCD'nin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
- Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
- Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
- Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
- Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
- Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
- Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
- Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
- Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
- Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
- Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
- Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
- Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
- Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
- Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
- Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
- Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
- Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
- Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
- Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
- Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
- Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
- Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
- Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
- Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
- Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
- Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
- Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
- Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
- Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
- Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
- Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
- Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
- Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
- Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
- Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
- Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
- Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Granath, K. A.
- Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
