Aqui, apresentamos um método para visualizar a captação de 3 kDa Texas Red-labeled dextran em células ciliadas auditivas com canais funcionais de mecanotransdução. Além disso, a dextrans de 3 a 10 kDa pode ser usada para estudar endocitose em cabelos e células de apoio do órgão de Corti.
O canal de mecanotransção de células para cabelo (MET) desempenha um papel importante na audição. No entanto, a identidade molecular e as informações estruturais do MET permanecem desconhecidas. Estudos eletrofisiológicos de células ciliadas revelaram que o canal MET tem uma grande condução e é permeável a moléculas cationic fluorescentes relativamente grandes, incluindo alguns corantes isofiis e antibióticos de aminoglicolado com rótulo vermelho do Texas. Neste protocolo, descrevemos um método para visualizar e avaliar a captação de dextrans fluorescente em células ciliadas do órgão de corti explantas que podem ser usadas para ensaio para canais MET funcionais. Descobrimos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran especificamente rotula células ciliadas auditivas funcionais após 1-2 h de incubação. Em particular, 3 kDa dextran rotula as duas linhas de estereoilia mais curtas e se acumula no corpo celular em um padrão difuso quando os canais MET funcionais estão presentes. Um padrão adicional de rotulagem semelhante a vesícula foi observado no corpo celular das células ciliadas e nas células de suporte circundantes. Nossos dados sugerem que 3 kDa Texas-Red dextran pode ser usado para visualizar e estudar duas vias para a captação de tinta celular; uma rota de entrada específica para células para celular através de canais MET funcionais e endocitose, um padrão também disponível para dextran maior.
As células ciliadas do ouvido interno são as células sensoriais que detectam som e encobrem os estímulos mecanicamente em sinais elétricos, que são finalmente interpretados pelo nosso cérebro. Essas células têm um feixe em forma de escadaria de três fileiras de filamentos à base de actin, conhecidos como estereoilia, que se projetam de sua região apical1,2. Os estímulos mecânicos desviam os filamentos estereoilia em direção à linha mais longa e desencadeiam a abertura dos canais de mecanotransdução (MET)3. A abertura dos canais MET leva a um fluxo de cárinos que despolariza a célula e, consequentemente, sinaliza a liberação de vesículas de sinapse na região basal da célula cilia.
As propriedades biofísicas do canal MET essenciais para a audição foram extensivamente caracterizadas. Entre outras propriedades, esses canais são seletivos cationic e possuem uma realização relativamente grande (150-300 pS em baixa Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Notavelmente, grandes moléculas fluorescentes como aminoglicoglicolados de marca vermelha do Texas são bloqueadores perversos do canal MET, resultando em seu acúmulo no corpo de células ciliadas que podem ser visualizados usando microscopia de fluorescência11,12,13,14. Por outro lado, a identidade molecular e a estrutura do canal MET e seu caminho de permeação permaneceram evasivos. Evidências experimentais crescentes indicam que a proteína do canal transmembrana 1 (TMC1) é um componente do canal MET em células ciliadas maduras15,16,17,18,19. Mutações no canal 1 (TMC1) alteram as propriedades do canal MET19,20,21,22 e causam surdez. Além disso, o TMC1 localiza o site do canal MET18,23 e interage com o tip-link responsável por transmitir a força mecânica para o canal MET24,25. Além disso, a recente análise bioinformática identificou as proteínas TMC como evolutivas relacionadas aos canais mecanosensíveis TMEM63/OSCA e as proteínas TMEM16, uma família de canais de cloreto ativados com cálcio e mexidas lipídicas26,27,28. Um modelo estrutural do TMC1 baseado na relação entre essas proteínas revelou a presença de uma grande cavidade na interface protein-lipídica27. Esta cavidade abriga as duas mutações TMC1 que causam perda auditiva autossômica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, e modificação seletiva de mutantes de cisteína para resíduos nas propriedades do canal met da cavidade alter28,indicando que poderia funcionar como o caminho de permeação do canal MET. O grande tamanho dessa cavidade prevista em proteínas TMC poderia explicar a capacidade de grandes moléculas de permear o canal MET. Para testar a previsão de que o canal MET contém um caminho de permeação extraordinariamente grande e para empurrar os limites do tamanho da cavidade observada no TMC1, desenvolvemos um protocolo para realizar experimentos de captação no órgão de explantas corti com uma molécula maior, 3 kDa dextran fluorescente rotulado com Texas Red.
Dextran é um complexo polissacarídeo ramificado composto por muitas moléculas de glicose D amarradas por ligações glicosídicas alfa-1,6. Sua alta solubilidade em água, baixa toxicidade celular e bioinertidade fazem dela uma ferramenta versátil para estudar vários processos celulares. Além disso, o dextran está disponível em uma ampla gama de tamanhos e fluorescentemente rotulado com fluoroforres de várias cores. Dextrans rotulado fluorescente são comumente utilizados na pesquisa de permeabilidade celular e tecidual33,34, para estudar endocitose em múltiplos sistemas celulares35,36, e para rastreamento neural37,38. No campo auditivo, moléculas dextran também têm sido usadas para avaliar a interrupção da junção celular-célula e perda da integridade auditiva sensorial de epitélio após exposição ao ruído intenso no órgão chinchilla de Corti39,40.
Neste trabalho, exploramos as propriedades de algumas das menores (3 e 10 kDa) fluorescentes dextrans para realizar experimentos de captação em células de ouvido internos de murina e explorar o tamanho da via de permeação do canal MET da célula capilar interna do ouvido. Além disso, usamos um microscópio confocal de varredura a laser (LSM) 880 equipado com um detector de airyscan para visualizar e localizar dextran fluorescente na estereoilia e no corpo celular de células cilias auditivas.
Este protocolo descreve como realizar experimentos de captação em órgão surina de explants corti com 3 kDa dextran Texas Red. O objetivo deste método é testar se moléculas maiores do que outras testadas anteriormente também foram capazes de rotular especificamente células ciliadas auditivas e permear através do canal MET. Protocolos experimentais semelhantes foram usados anteriormente para avaliar a permeabilidade das células ciliadas para outros corantes fluorescentes, como FM1-43 (0,56 kDa)…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Vincent Schram, do núcleo de microscopia e imagem nichd, por ajudar na aquisição de imagens confocais, e tsg-Hui Chang por ajuda inestimável com a gestão de colônias e cuidados com ratos. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, Bethesda, MD, para K.J.S. A.B. foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, e por uma Bolsa de Pós-Doutorado Robert Wenthold do programa de pesquisa intramural do NIDCD.
#1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |