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Bioengineering

Étiquetage Dextran et prise en vie et fonctionnelle cellules courines Murine

Published: February 08, 2020
doi:
10.3791/60769
,
1Molecular Physiology and Biophysics Section,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Ici, nous présentons une méthode pour visualiser l’apaisement de 3 kDa Texas Red-labeled dextran dans les cellules ciliées auditives avec des canaux fonctionnels de mécannotransduction. En outre, dextrans de 3 à 10 kDa peuvent être utilisés pour étudier l’endocytose dans les cheveux et les cellules de soutien de l’organe de Corti.

Abstract

Le canal de mécanotransduction de cellules capillaires (MET) joue un rôle important dans l’audition. Cependant, l’identité moléculaire et les informations structurelles du MET restent inconnues. Les études électrophysiologiques des cellules ciliées ont indiqué que le canal de MET a une grande conductance et est perméable aux molécules cationic fluorescentes relativement grandes, y compris quelques colorants de styryl et antibiotiques d’aminoglycoside Red-étiquetés du Texas. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour visualiser et évaluer l’utilisation du dextrans fluorescent dans les cellules ciliées de l’organe des explants de Corti qui peuvent être utilisés pour évaluer les canaux MET fonctionnels. Nous avons constaté que 3 kDa Texas Red-labeled dextran étiquette spécifiquement les cellules ciliées auditives fonctionnelles après l’incubation de 1/2 h. En particulier, 3 kDa dextran étiquette les deux lignes stéréocilia plus courtes et s’accumule dans le corps cellulaire dans un modèle diffus lorsque les canaux MET fonctionnels sont présents. Un modèle supplémentaire de vésicule-comme de l’étiquetage a été observé dans le corps cellulaire des cellules ciliées et des cellules de soutien environnantes. Nos données suggèrent que le dextran Texas-Rouge de 3 kDa puisse être employé pour visualiser et étudier deux voies pour l’utilisation cellulaire de colorant ; une voie d’entrée spécifique aux cellules capillaires à travers les canaux MET fonctionnels et l’endocytose, un modèle également disponible pour les plus grands dextran.

Introduction

Les cellules ciliées de l’oreille interne sont les cellules sensorielles qui détectent le son et les stimuli mécaniquement dans les signaux électriques, qui sont finalement interprétés par notre cerveau. Ces cellules ont un faisceau en forme d’escalier de trois rangées de filaments à base d’actine, connus sous le nom de stéréocilia, qui dépassent de leur région apaïque1,2. Les stimuli mécaniques détournent les filaments stéréociliens vers la plus longue rangée et déclenchent l’ouverture des canaux de mécanotransduction (MET)3. L’ouverture des canaux MET conduit à un afflux de cations qui dépolarise la cellule et signale par conséquent la libération de vésicules synapses à la région basale de la cellule capillaire.

Les propriétés biophysiques du canal MET essentielles à l’audition ont été largement caractérisées. Entre autres propriétés, ces canaux sont cationic sélective et ont une conductance relativement grande (150-300 pS en basse Ca2)4,5,6,7,8,9,10. Remarquablement, de grandes molécules fluorescentes telles que FM1-43 et les aminoglycosides à étiquette rouge du Texas sont des bloqueurs perméats du canal MET, ce qui entraîne leur accumulation dans le corps des cellules capillaires qui peuvent être visualisées à l’aide de la microscopie de fluorescence11,12,13,14. Inversement, l’identité moléculaire et la structure du canal MET et sa voie de perméation sont restées insaisissables. De plus en plus de preuves expérimentales indiquent que la protéine de canal transmembrane-like 1 (TMC1) est un composant du canal MET dans les cellules ciliées matures15,16,17,18,19. Les mutations dans le canal transmembrane-comme 1 (TMC1) modifient les propriétés de canal DE MET19,20,21,22 et causent la surdité. En outre, TMC1 localise le site du canal MET18,23 et interagit avec le lien de pointe responsable de la transmission de la force mécanique au canal MET24,25. En outre, l’analyse bioinformatique récente a identifié les protéines TMC comme évolutives liées aux canaux mécanosensibles TMEM63/OSCA protéines et les protéines TMEM16, une famille de canaux de chlorure activés par le calcium et brouillages lipidiques26,27,28. Un modèle structurel de TMC1 basé sur la relation entre ces protéines a révélé la présence d’une grande cavité à l’interface protéine-lipide27. Cette cavité abrite les deux mutations TMC1 qui causent la perte auditive dominante autosomique (DFNA36)27,29,30,31,32, et la modification sélective des mutants de cystéine pour les résidus dans la cavité modifient les propriétés du canal MET28, indiquant qu’il pourrait fonctionner comme la voie de perméation du canal MET. La grande taille de cette cavité prévue dans les protéines TMC pourrait expliquer la capacité des grosses molécules à imprégner le canal MET. Pour tester la prédiction que le canal MET contient une voie de perméation exceptionnellement grande et pour repousser les limites de la taille de la cavité observée dans TMC1, nous avons développé un protocole pour effectuer des expériences d’adoption dans l’organe des explants de Corti avec une molécule plus grande, 3 kDa dextran fluorescente étiquetée avec Texas Red.

Dextran est un polysaccharide ramifié complexe composé de nombreuses molécules de D-glucose liées par des liaisons alpha-1,6 glycosidiques. Sa solubilité élevée dans l’eau, sa faible toxicité cellulaire et sa bioinerité en font un outil polyvalent pour étudier plusieurs processus cellulaires. En outre, dextran est disponible dans un large éventail de tailles et fluorescente étiqueté avec des fluorophores de plusieurs couleurs. Les dextrans étiquetés fluorescents sont couramment utilisés dans la recherche sur la perméabilité des cellules et des tissus33,34, pour étudier l’endocytose dans plusieurs systèmes cellulaires35,36, et pour le traçage neuronal37,38. Dans le domaine auditif, des molécules de dextran ont également été utilisées pour évaluer la perturbation de la jonction cellule-cellule et la perte de l’intégrité auditive de l’épithélium sensoriel après l’exposition à un bruit intense dans l’organe chinchilla de Corti39,40.

Dans ce travail, nous avons exploité les propriétés de certains des plus petits (3 et 10 kDa) dextrans fluorescents pour effectuer des expériences d’uptake dans les cellules ciliées de l’oreille interne murine et d’explorer la taille de la voie de perméation de la cellule capillaire de l’oreille interne MET canal. En outre, nous avons utilisé un microscope confocal à balayage laser (LSM) 880 équipé d’un détecteur Airyscan pour visualiser et localiser le dextran fluorescent à la stéréocilie et au corps cellulaire des cellules ciliées auditives.

Protocol

Les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été effectués conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, qui ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (protocole animal #1336 à KJS). 1. Souris Établiz un couple de couples reproducteurs de type sauvage C57BL/6J pour qu’ils se reprod…

Representative Results

Nous avons observé un étiquetage robuste et spécifique des cellules ciliées après l’incubation de 2h d’organes d’explants de Corti provenant de souris de type sauvage postnatal-jour-6 (P6) avec 3 kDa dextran fluorescents étiquetés avec Texas Red (dextran-TR) (Figure 2A-B). L’étiquetage de Dextran a été observé dans les cellules ciliées intérieures et externes (IHC et OHC) aux régions basales, moyennes et apatiques de l’organe de Corti (<strong class="…

Discussion

Ce protocole décrit comment effectuer des expériences d’adoption dans l’organe murine des explants de Corti avec 3 kDa dextran Texas Red. L’objectif de cette méthode est de tester si les molécules plus grandes que d’autres précédemment testées ont également été en mesure d’étiqueter spécifiquement les cellules ciliées auditives et imprégner par le canal MET. Des protocoles expérimentaux similaires ont déjà été utilisés pour évaluer la perméabilité des cellules ciliées à d’autres color…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Vincent Schram du noyau de microscopie et d’imagerie NICHD pour son aide à l’acquisition d’images confocales, et Tsg-Hui Chang pour son aide inestimable dans la gestion des colonies et les soins aux souris. Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros du NINDS, NIH, Bethesda, MD, à K.J.S. A.B. a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros du NINDS, NIH, et par une bourse postdoctorale Robert Wenthold du programme de recherche intra-muros du NIDCD.

Materials

#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
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References

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. . The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. . Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

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Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).
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