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Bioengineering

Fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques multi-composants à l’aide du test de motilité de la kinésine glissante

Published: July 26, 2021 doi: 10.3791/60899
Automatic Translation
1, 1
1Center for Integrated Nanotechnologies, Sandia National Laboratories

Summary

Ce protocole décrit un processus de fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques en utilisant la motilité de la kinésine glissante en conjonction avec des vésicules lipidiques unilamellaires géantes.

Abstract

Les réseaux de nanotubes lipidiques (LNT) représentent un système modèle in vitro pour l’étude du transport moléculaire et de la biophysique des lipides en rapport avec les tubules lipidiques omniprésents présents dans les cellules eucaryotes. Cependant, les LNT in vivo sont des structures hautement non équilibrées qui nécessitent l’assemblage, la maintenance et la réorganisation de l’énergie chimique et des moteurs moléculaires. De plus, la composition des LNT in vivo est complexe, comprenant plusieurs espèces de lipides différentes. Les méthodes typiques d’extrusion des LNT sont à la fois chronophages et laborieuses, et nécessitent une pince optique, des microbilles et des micropipettes pour extraire de force des nanotubes de vésicules lipidiques géantes. Présenté ici est un protocole pour le test de motilité de glissement (GMA), dans lequel des réseaux LNT à grande échelle sont rapidement générés à partir de vésicules unilamellaires géantes (GUV) en utilisant la motilité de microtubule alimentée par la kinésine. En utilisant cette méthode, les réseaux LNT sont formés à partir d’un large éventail de formulations lipidiques qui imitent la complexité des LNT biologiques, ce qui les rend de plus en plus utiles pour les études in vitro de la biophysique des lipides et du transport associé à la membrane. De plus, cette méthode est capable de produire de manière fiable des réseaux LNT en peu de temps (<30 min) à l’aide d’équipements de laboratoire couramment utilisés. Les caractéristiques du réseau LNT telles que la longueur, la largeur et le partitionnement lipidique sont également accordables en modifiant la composition lipidique des GUV utilisés pour fabriquer les réseaux.

Introduction

La fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques (LNT) présente un intérêt croissant pour l’examen in vitro des structures lipidiques non équilibrées 1,2,3. Les cellules utilisent des tubules lipidiques pour le transport diffusif des protéines4 et des acides nucléiques5 ainsi que pour la communication de cellule à cellule 6,7. Le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi sont particulièrement intéressants, car ces organites liés à la membrane sont les principaux emplacements pour la synthèse des lipides et des protéines ainsi que pour le transport de ces biomolécules intégrales dans le cytoplasme d’une cellule 8,9. Les membranes de ces organites sont composées de plusieurs espèces lipidiques, y compris les sphingolipides, le cholestérol et les phospholipides10 qui aident finalement à définir leur fonctionnalité. Ainsi, pour répliquer et étudier plus étroitement ces organites, les LNT in vitro doivent être fabriqués à partir de vésicules avec des formulations lipidiques de plus en plus complexes11.

Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont utilisées de manière omniprésente pour étudier le comportement de la membrane lipidique, car elles peuvent être synthétisées de manière fiable avec des formulations complexes comprenant le cholestérol, la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS) et le phosphatidylinositol (PI)12,13. Décrit ici est une méthode pour fabriquer des LNT à partir de GUV avec différentes formulations lipidiques en utilisant le test de motilité de glissement (GMA), dans lequel les LNT sont extrudés en fonction du travail effectué par les moteurs de kinésine et les filaments de microtubules agissant sur les GUV. Dans ce système, les protéines motrices de la kinésine adsorbées à une surface propulsent des microtubules biotinylés, convertissant l’énergie chimique de l’hydrolyse de l’ATP en un travail utile (en particulier, l’extrusion de LNT à partir de vésicules biotinylées)11. Le réseau LNT qui en résulte fournit une plate-forme modèle pour étudier les effets des différences dans les phases lipidiques sur les changements dans la morphologie des LNT.

En bref, les protéines motrices de la kinésine sont introduites dans une chambre d’écoulement dans une solution contenant de la caséine, ce qui permet l’adsorption des moteurs sur la surface vitrée de la chambre. Ensuite, les microtubules biotinylés dans une solution contenant de l’ATP circulent à travers la chambre et sont autorisés à se lier aux moteurs de kinésine et à commencer la motilité. Une solution de streptavidine est ensuite introduite dans la chambre et laissée se lier de manière non covalente aux microtubules. Enfin, les GUV contenant un lipide biotinylé sont introduits dans la chambre et se lient aux microtubules recouverts de streptavidine, puis extrudent les LNT pour former des réseaux à grande échelle pendant 15 à 30 minutes. Cette méthode produit de grands réseaux LNT ramifiés en utilisant des équipements de laboratoire standard et des réactifs à faible coût11.

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Protocol

1. Préparation de solutions de microtubules mères

ATTENTION : Des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire doivent toujours être portés tout au long du protocole.

  1. Préparer 5x tampon BRB80 : ajouter 24,19 g de PIPES (pipérazine-N,N′-bis[acide 2-éthanesulfonique]) et 0,38 g d’EGTA (éthylène glycol-bis[β-aminoéthyléther]-N,N,N′,N′-tétraacétique) dans une bouteille en verre de 1 L. Ajouter 1 mL de 1 M MgCl2 et ajuster le pH à 6,9 avec KOH. Ajouter de l’eau désionisée pour porter la solution à un volume final de 500 mL.
  2. Préparer un stock de 100 mM de solution de GTP : peser 52 mg de GTP et suspendre dans 1 mL d’eau distillée. Répartir la solution de 100 mM en aliquotes de 20 μL et conserver à -20 °C.
  3. Préparer la solution GPEM : mélanger 200 μL de 5x BRB80, 10 μL de solution GTP de 100 mM, 100 μL de glycérol à 100% et 600 μL d’eau désionisée. Répartir la solution GPEM dans des aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
  4. Préparer une solution de microtubules en reconstituant des flacons de tubuline lyophilisée disponible dans le commerce (un flacon de biotinylée, marquée par fluorescence et non marquée) dans une solution de GPEM froide (4 °C) à une concentration en stock de 5 mg/mL.
  5. Effectuer la polymérisation des microtubules en mélangeant 4 μL de tubuline biotinylée, 4 μL de tubuline marquée par fluorescence et 24 μL de tubuline non marquée (le tout à des concentrations de 5 mg/mL) pour créer un rapport de 1:1:6 à un volume final de 32 mL. Gardez-le sur la glace. Diviser le mélange de tubuline en aliquotes de 2 μL et conserver à -80 °C jusqu’à ce que nécessaire.
    REMARQUE : Une polymérisation efficace exige que la concentration de tubuline soit égale ou supérieure à la concentration critique (5 mg/mL)14. Ici, la sélection du rapport de tubuline est optimisée pour une concentration suffisante de tubuline biotinylée pour lier efficacement la streptavidine et les GUV, ainsi qu’une concentration suffisante de tubuline fluorescente pour la caractérisation microscopique.

2. Préparation de vésicules unilamellaires géantes (GUV)

  1. Préparation du film d’agarose
    REMARQUE : Ce protocole est adapté de Greene et al.15.
    1. Préparer une solution à 1 % p/v en mélangeant 1 g d’agarose dans 100 mL d’eau désionisée dans une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL. Utilisez un four à micro-ondes standard pour chauffer la solution d’agarose pendant 1 à 2 min.
      REMARQUE: La solution deviendra translucide une fois que l’agarose est complètement dissoute. Laisser refroidir la solution à 65–75 °C avant utilisation.
    2. Utilisez une pointe de pipette coupée de 1 000 μL pour pipeter 300 à 400 μL de solution d’agarose sur un couvercle en verre de 25 mm x 25 mm. Tout en tenant le bord du couvercle avec des doigts gantés, utilisez une autre pointe de pipette de 1 000 μL pour répartir uniformément l’agarose fondue sur le couvercle.
      REMARQUE: Le maintien de l’agarose à 65–75 °C permettra un étalement efficace sur la surface du couvercle.
    3. Sécher les couvercles recouverts d’agarose dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 2 h, moment auquel l’agarose deviendra transparente. Stockez les couvercles en plaçant la surface enduite d’agarose vers le haut sur une surface propre telle que du papier non pelucheux ou un film à base de cire à température ambiante (RT).
  2. Formulation lipidique
    1. Récupérez les lipides dissous dans le chloroforme dans un congélateur à -20 °C et placez-les dans une hotte chimique jusqu’à ce qu’ils atteignent RT.
    2. Calculer le volume de lipides de chaque lipide composant nécessaire à la formulation en utilisant la formule suivante:
      Equation 1
      Où: Vlipide est le volume de lipide à utiliser, mol % est le pourcentage molaire de la composante lipidique, n est le nombre total de moles de lipide utilisées dans la formulation, et M est la concentration de lipide dans les unités molaires.
      NOTE: Par exemple, si vous utilisez une formulation contenant 45 mol% de 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) avec une concentration en solution mère de 12,72 mM et 1 micromole de lipides totaux dans la formulation, le volume de stock de DOPC utilisé dans la formulation serait:
      Equation 2
    3. Mélanger les lipides ensemble au rapport calculé dans un flacon en verre dans la hotte chimique.
    4. Pipeter 30 μL de solution lipidique sur les couvercles enduits d’agarose sur une plaque chauffante préchauffée qui est placée au-dessus du point de fusion du composant lipidique saturé de la formulation (par exemple, plaque chauffante à 50 °C pour un lipide avec Tm de 40 °C).
    5. Étaler la solution sur le film d’agarose dans un mouvement circulaire en utilisant le long bord d’une aiguille de 18 G jusqu’à ce que le chloroforme se soit évaporé et qu’une couche uniforme de lipides se soit formée. Tenez le bord du couvercle avec les doigts gantés tout en effectuant cette étape.
      REMARQUE: Il faut veiller à ne pas endommager la couche d’agarose avec l’aiguille.
    6. Placez le couvercle avec la couche d’agarose et le film lipidique dans une boîte de Petri recouverte de papier d’aluminium, côté film orienté vers le haut et placez la boîte de Petri dans un dessiccateur sous vide pendant au moins 2 h pour éliminer le solvant résiduel.
  3. Entre-temps, préparer une solution de saccharose de 560 mM en mélangeant 1,92 g de saccharose avec 10 mL d’eau désionisée.
    REMARQUE: La concentration de la solution de saccharose dépend de l’osmolarité du tampon dans lequel les GUV sont dilués. En règle générale, l’osmolarité de la solution de saccharose ne doit pas dépasser de plus de 10 % le tampon dans lequel les GUV seront dilués, en particulier le tampon de motilité (voir étape 3.11).
  4. Formation de GUV
    1. Collez une chambre adhésive sur le couvercle recouvert du film lipidique en appuyant doucement sur la chambre adhésive sur le couvercle recouvert de lipides avec le film lipidique tourné vers le haut, en veillant à ce qu’un joint étanche soit formé.
    2. Ajouter 400 μL de solution de saccharose de 560 mM (préparée à l’étape 2.3) à la chambre.
    3. Placez le couvercle dans la chambre d’humidité et fermez le couvercle.
    4. Placez la chambre d’humidité sur une plaque chauffante préchauffée située au-dessus du point de fusion du composant lipidique saturé de la formulation.
    5. Laisser les vésicules se former pendant ≥1 h avant la récupération.
      REMARQUE: La formation de vésicules peut être vérifiée par microscopie à fluorescence avec une lentille d’objectif d’air 40x.

3. Préparation des stocks et des réactifs des essais de motilité

  1. Préparation du stock de caséine
    1. Ajouter 3 g de caséine sèche dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL, puis ajouter 30 mL de 1x BRB80 et faire pivoter jusqu’à ce que la solution devienne visqueuse. Centrifuger le tube à 15 000 x g pendant 30 min.
    2. Transférer le surnageant dans un autre tube de centrifugeuse conique de 50 mL et jeter la pastille. Filtrer la solution à travers un filtre à seringue de 1 μm, en recueillant la solution dans un flacon conique de 50 mL. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm, en recueillant la solution dans un flacon conique de 50 mL.
    3. Déterminer la concentration en protéines en mesurant l’absorbance à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis et d’une cuvette à quartz.
    4. Calculer la concentration de caséine en mg/mL à l’aide de la formule suivante :
      Equation 3
    5. Diluer la solution à 20 mg/mL dans 1x BRB80, diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
  2. Préparer la solution mère de glucose oxydase (2 mg/mL) en mélangeant 2 mg de glucose oxydase avec 1 mL de 1x BRB80. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
  3. Préparer la solution mère de catalase (0,8 mg/mL) en mélangeant 0,8 mg de catalase avec 1 mL de 1x BRB80. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
  4. Préparer 2 M de solution de glucose en suspendant 0,3 g de D-glucose dans 1 mL d’eau désionisée. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
  5. Préparer un stock de TNT de 100 mM en suspendant 0,015 g de TNT dans 1 mL d’eau désionisée. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
  6. Préparer 100 mM de Mg-ATP en suspendant 0,055 g d’ATP disodique dans une solution de 1 mL de 100 mMMgCl2. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
  7. Préparer une solution de Mg-AMP-PNP de 100 mM en suspendant 0,055 g d’AMP-PNP dans une solution de 1 mL de 100 mM deMgCl2, puis répartir en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
  8. Préparer 100 mM de solution de Trolox en ajoutant 25,03 mg de Trolox à 1 mL de méthanol et conserver à -20 °C.
  9. Préparer 10 mg/mL de solution de streptavidine en ajoutant 1 mg de streptavidine à 100 μL de BRB80, puis diviser en aliquotes de 2 μL et conserver à -80ۛ °C.
  10. Préparer BRB90CAT en mélangeant 200 μL de 5x BRB80, 20 μL de solution de caséine, 10 μL de solution de MgATP, 10 μL de Trolox, 5 μL de solution de paclitaxel et 765 μL d’eau DI. Conserver à 4 °C.
  11. Préparer la solution de motilité en mélangeant 192 μL de BRB80CAT, 2 μL de solution de D-glucose, 2 μL de solution de glucose oxydase, 2 μL de solution de TNT et 2 μL de solution de catalase. Conserver à 4 °C.
  12. Préparer une solution de kinésine de 1 μM en diluant la solution mère de kinésine dans du BRB80CAT (p. ex., 2 μL de solution de kinésine de 50 mM dans 98 μL de BRB80CAT) et conserver à 4 °C.
  13. Préparer une solution de microtubules de 10 μg/mL en diluant 10 μL de microtubules stabilisés dans 90 μL de BRB80CAT à température ambiante. Magasinez chez RT.
  14. Préparer une solution de streptavidine à 10 μg/mL en ajoutant 0,1 μL de solution de streptavidine à 10 mg/mL dans 99,9 μL de solution de motilité. Conserver à 4 °C.
  15. Préparer une solution de GUV 12x en diluant 5 μL de bouillon DEV dans 55 μL de solution de motilité. Conserver à 4 °C.
  16. Polymérisation de la tubuline en microtubules
    1. Prélever une aliquote de tubuline de 2 μL préalablement préparée dans le congélateur à -80 °C (préparée à l’étape 1.5) et la placer dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
    2. Préparer une solution de paclitaxel de 2 mM en ajoutant 1,71 mg de paclitaxel dans 1 mL de DMSO anhydre, diviser en aliquotes de 10 μL et conserver à -20 °C.
    3. Préparer fraîchement le BRB80T en mélangeant 99,5 μL de 1x BRB80 avec 0,5 μL de paclitaxel de 2 mM.  Chauffer 100 μL de BRB80T à 37 °C au bain-marie.
    4. Après 30 min, ajouter les 100 μL de BRB80T à l’aliquote de tubuline pour stabiliser les microtubules. Magasinez chez RT.

4. Test de motilité de glisse (GMA)

  1. Préparer une chambre d’écoulement en apposant deux bandes de ruban adhésif double face séparées de 5 mm sur une lame de verre. Répétez ce processus jusqu’à ce que trois couches de ruban adhésif composent chaque bande.
  2. Placez un couvercle sur le dessus du ruban adhésif, puis appuyez doucement sur l’interface couvercle/ruban adhésif à l’aide d’une pince ou d’un stylo pour assurer une adhérence suffisante.
    REMARQUE: Le canal doit avoir une largeur de 5 mm par une longueur de 25 mm et une hauteur de 300 mm.
  3. Pipette 30 μL de solution de kinésine de 1 mm (préparée à l’étape 3.12) dans la cellule d’écoulement et laisser incuber pendant 5 min.
    REMARQUE: La caséine forme une bicouche à la surface de la glissière de couverture / verre et facilite la fixation de la queue de kinésine à la surface.
  4. Pipette 30 μL de solution de microtubules de 10 μg/mL (préparée à l’étape 3.13) dans la cellule d’écoulement, à l’aide d’une lingette de laboratoire pressée doucement contre l’extrémité opposée du canal d’écoulement pour faciliter l’échange de solution. Incuber pendant 5 min.
  5. Laver la cellule d’écoulement 1x–3x avec 1x solution de motilité à RT (préparée à l’étape 3.11).
    REMARQUE: La microscopie à fluorescence utilisant un objectif d’air 40x peut être utilisée à ce stade pour confirmer la fixation et la motilité des microtubules. Les microtubules apparaissent sous forme de filaments fluorescents (des dizaines de microns de longueur) se déplaçant (glissant) sur la surface à ~0,5 μm/s (Figure 1).
  6. Pipeter 30 μL de solution de streptavidine de 10 μg/mL (préparée à l’étape 3.14) dans la cellule d’écoulement à l’aide d’une lingette de laboratoire pressée doucement contre l’extrémité opposée du canal d’écoulement pour faciliter l’échange de la solution. Incuber pendant 10 min.
  7. Verser 30 μL de solution 12x GUV (préparée à l’étape 3.15) dans le flux à l’aide d’une lingette de laboratoire pressée doucement contre l’extrémité opposée du canal d’écoulement pour faciliter l’échange de solution. Incuber pendant 30 min.
  8. Ajouter 2 μL de solution AMP-PNP de 100 mM (préparée à l’étape 3.7) pour arrêter la motilité, puis sceller la chambre avec du scellant.

5. Caractérisation du réseau LNT

  1. Transférez la chambre d’écoulement dans un microscope inversé pour l’imagerie.
  2. Choisissez le jeu de filtres approprié en fonction des longueurs d’onde des lipides fluorescents ou de la tubuline utilisés. Par exemple, lorsque vous utilisez des lipides marqués Texas Red, utilisez un filtre d’excitation de 560 nm / 25 nm et un filtre d’émission de 607 nm / 36 nm.
  3. Utilisez un objectif d’huile 100x pour vous concentrer sur la surface du couvercle.
  4. Imagez les réseaux LNT à l’aide de la microscopie à fluorescence.
    REMARQUE: Les LNT sont des structures linéaires extrudées à partir des plus grandes vésicules. Les LNT sont beaucoup plus petits que les GUV et ont des signaux de fluorescence plus faibles. Ainsi, l’exposition et le contraste doivent être ajustés en fonction des LNT d’image. Ces ajustements conduisent également à une surexposition des GUV, et il est donc recommandé que la lamellélarité et la séparation de phase dans les GUV soient caractérisées indépendamment.
  5. Concentrez le microscope sur un réseau d’intérêt et prenez une image standard ou carrelée.
  6. Ajustez les filtres de temps d’exposition et de densité neutre pour imager les LNT et minimiser l’exposition saturée des GUV. Acquérez des images à la fois dans les canaux rouges et verts.
    REMARQUE: Ici, le canal rouge permet la visualisation des lipides Texas-Red, tandis que le canal vert permet la visualisation des microtubules (par exemple, les lipides Oregon Green et les colorants HiLyte488).
  7. Créez une image composite en superposant les couches rouge et verte (Figure 1).
  8. Caractérisation des réseaux LNT en mesurant la longueur LNT
    1. Ouvrez les images acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images tel que ImageJ.
    2. Calibrez l’échelle du microscope à l’aide de la fonction d’échelle définie, remplissez les pixels au facteur de conversion mm, puis cliquez sur OK.
      REMARQUE: Le facteur de conversion dépend du microscope, de l’objectif et de l’appareil photo, et il peut être obtenu à l’aide d’une lame d’étalonnage du microscope. Il est généralement exprimé en pixels/mm.
    3. Utilisez l’outil Ligne multipoint pour mesurer la longueur des nanotubes à partir du GUV parent. Maintenez la touche Ctrl + M enfoncée pour mesurer la longueur.
    4. Continuez à mesurer les longueurs des tubes individuels en suivant les étapes ci-dessus. L’outil de traitement d’image enregistrera chaque nouvelle mesure dans la fenêtre de résultats.
    5. Maintenez ctrl + D après avoir tracé chaque ligne pour garder une trace des tubes qui ont été mesurés.
  9. Mesure de l’épaisseur LNT (Figure 2)
    1. Ouvrez l’image dans ImageJ et sélectionnez la fonction Seuil sous l’onglet Image .
    2. Cliquez sur Appliquer pour appliquer le seuil.
    3. Dessinez un rectangle de longueur connue sur le tube souhaité (les pixels noirs ont une valeur de 0 et les pixels rouges ont une valeur de 255).
    4. Mesurez la densité intégrée de la zone.
    5. Divisez la densité par la longueur (en pixels) du LNT pour obtenir l’épaisseur (en pixels).
      REMARQUE: Les mesures d’épaisseur ne peuvent être comparées entre les images que lorsque les paramètres d’imagerie et le seuil sont définis de manière identique.
  10. Détermination du partitionnement lipidique dans les nœuds des LNT (Figure 3)
    1. Ouvrez l’image dans ImageJ.
    2. Utilisez l’outil Ligne pour tracer une ligne sur le nœud souhaité.
    3. Mesurez l’intensité des nœuds dans les canaux Vert de l’Oregon et Rouge du Texas.
    4. Déplacez la ligne vers le LNT et mesurez l’intensité du LNT dans les canaux Oregon Green et Texas Red.

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Representative Results

Les réseaux LNT (Figure 4) ont été fabriqués à l’aide du protocole décrit, qui utilise le travail effectué par le transport de kinésine de microtubules pour extruder des LNT à partir de GUV. En bref, les GUV ont été préparés à l’aide d’une réhydratation en gel d’agarose à l’aide d’une solution de saccharose, et les microtubules ont été polymérisés dans une solution GPEM et stabilisés dans BRB80T. Ensuite, des moteurs à kinésine ont été introduits dans une cellule d’écoulement formant une couche active de moteurs à la surface du couvercle. Des microtubules ont ensuite été introduits et une solution de streptavidine a été ajoutée, ce qui a facilité la liaison entre les lipides biotinylés et les GUV (qui ont ensuite été introduits).

Avec tous les composants présents dans la cellule d’écoulement, les LNT ont été autorisés à se former pendant 30 minutes, moment auquel l’AMP-PNP a été introduit pour arrêter la motilité. Ensuite, les LNT ont été photographiés sous un microscope à épifluorescence à l’aide d’un objectif d’huile 100x. Les LNT peuvent être assez grands; ainsi, un objectif de puissance inférieure peut également être utilisé pour capturer des LNT plus grands. Les réseaux LNT sont caractérisés par de minces protubérances ressemblant à des toiles s’étendant à partir de GUV et les connectant. Le nombre et la ramification des LNT dépendent de plusieurs facteurs, notamment la densité des microtubules à la surface, la concentration de streptavidine et le nombre de GUV présents.

Cette méthode peut générer des GUV et des LNT composés de phases solides, désordonnées en liquide et ordonnées par liquide, ainsi que des vésicules séparées par phase qui présentent la coexistence de ces phases sur un large éventail de compositions différentes (Figure 4). Par exemple, la synthèse de vésicules avec 45% de lipides saturés et 55% de lipides insaturés donne des vésicules qui se séparent en phases liquides désordonnées et solides coexistantes. Si le cholestérol est inclus, cependant, la coexistence liquide-liquide peut alors être observée. Par exemple, un mélange composé de 50% de lipides insaturés, de 30% de cholestérol et de 20% de lipides saturés créera des GUV qui se séparent en phases coexistantes d’ordre liquide (Lo) et de désordre liquide (LD). L’incorporation de cholestérol dans cette formulation fluidise les lipides saturés, permettant la formation d’une phase liquide.

De plus, on a observé la formation de nœuds (c.-à-d. des structures sphériques rondes plus grandes que les LNT) dans les mélanges séparés en phase (figure 4). Le partitionnement des types de lipides dans les nanotubes et les nœuds peut être caractérisé à l’aide de l’outil de profil de ligne pour trouver l’intensité maximale de crête soustraite en arrière-plan d’un nœud. Les profils linéaires du nœud et du LNT ont été déterminés et la fluorescence de fond de ces profils a été soustraite pour déterminer la valeur maximale. Le partitionnement est ensuite calculé en divisant la valeur maximale de la fluorescence dans le nœud par la valeur de fluorescence maximale du LNT. Cette approche permet le partitionnement des lipides à la fois dans le LNT ainsi que dans les nœuds qui se forment dans les réseaux plus grands.

Figure 1
Figure 1 : Image composite de LNT fabriqués à partir de GUV et de microtubules. Les LNT sont extrudés à partir de GUV par des microtubules mobiles glissant sur des moteurs de kinésine. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Processus de seuillage pour acquérir de l’épaisseur. (A) Sélectionnez Seuil sous l’onglet Image | Ajuster. (B) Appliquez le seuil. (C) Dessinez un rectangle de longueur connue sur le tube souhaité. Les pixels noirs ont une valeur de 0 et les pixels rouges ont une valeur de 255. D) Mesurer la densité intégrée de la zone. Pour calculer la largeur du tube, divisez la densité intégrée par 255, puis divisez cette sortie par la longueur du rectangle créé en (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Détermination du partitionnement lipidique dans les nœuds. (A) Ouvrez l’image dans ImageJ et utilisez l’outil ligne pour tracer une ligne sur le nœud souhaité. (B) Mesurer l’intensité du nœud dans le canal Oregon Green. (C) Déplacez la ligne vers le LNT et mesurez l’intensité dans le canal Oregon Green. (D,E,F) Répétez le processus pour le canal Texas Red. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : LNT fabriqués à partir de différentes formulations lipidiques GUV. Les LNT extrudés à partir de la phase liquide désordonnée (LD) sont minces et longs, tandis que les LNT extrudés à partir de la phase liquide ordonnée (Lo) sont courts et épais. Les LNT des deux types sont observés lorsque des vésicules Lo-L D séparées par phase sont utilisées dans l’AMG. Les LNT des GUV en phase liquide-solide ressemblent à ceux extrudés des GUV LD . Les formulations ordonnées par liquide peuvent être créées en utilisant une combinaison de lipides saturés et de cholestérol, tandis que les formulations désordonnées liquides sont créées à l’aide de lipides insaturés. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Les réseaux LNT sont un outil utile pour les études in vitro des propriétés membranaires et du transport de biomolécules telles que les protéines transmembranaires. De plus, l’utilisation de formulations lipidiques complexes pour fabriquer des réseaux de LNT permet des études plus pertinentes sur le plan biologique. D’autres études de fabrication ont utilisé soit 1) des formulations lipidiques simples et des vésicules multilamellaires, soit 2) des techniques de motilité plus lourdes pour fabriquer des réseaux à partir de GUV composés de formulations lipidiques complexes. La méthode décrite ici permet la fabrication efficace de réseaux LNT à grande échelle à partir de formulations lipidiques complexes et de GUV et en utilisant des réactifs et des équipements peu coûteux. En tant que telle, cette méthodologie offre la possibilité d’étudier une gamme de processus biologiques, y compris la séparation de phase et le transport de protéines membranaires. Le protocole utilise un modèle in vitro dans lequel la composition des LNT peut être réglée de manière optimale pour se rapprocher de leurs analogues biologiques (par exemple, l’appareil de Golgi).

La formation de réseaux LNT dans la méthode décrite ici présente de nombreux avantages. Par exemple, les microtubules sont facilement et rapidement polymérisés à l’aide de tubuline lyophilisée, et ils restent stables à RT pendant au moins 1 à 2 semaines lorsqu’ils sont stabilisés avec du paclitaxel16. En tant que tels, ils sont facilement mis en œuvre pour conduire l’extrusion de LNT et la formation d’un réseau à grande échelle 1,2. De plus, les GUV composés de plusieurs composants lipidiques (c’est-à-dire des lipides insaturés et saturés et du cholestérol) peuvent être rapidement formés sur la base d’un protocole précédent avec de légères modifications. Ces modifications permettent la synthèse des GUV capables de subir le processus physico-chimique de séparation de phase membranaire. Une fois préparés, les GUV peuvent être stockés pendant des semaines ou des mois en fonction des conditions de stockage. Cependant, il est recommandé d’utiliser GUVS jusqu’à 1 mois avant de préparer un nouveau lot. Les solutions lipidiques peuvent être conservées à -20 °C ou -80 °C pendant plusieurs mois, ainsi que le gel d’agarose et les couvercles enduits, qui peuvent être conservés à RT pendant des mois. Les films lipidiques sur les couvercles recouverts d’agarose doivent être stockés sous vide et réhydratés dans les 48 heures.

L’un des défis de l’utilisation de cette technique pour former des LNT à partir de GUV est d’équilibrer la concentration de GUV, de streptavidine et de microtubules dans la cellule d’écoulement. Par exemple, la formation de LNT sera limitée si le rapport entre les microtubules et les GUV n’est pas correct. Si la concentration de GUV est trop faible, les agrégats ne se formeront pas, ce qui est la première étape de la formation de LNT. Pour les concentrations de microtubules et de GUV décrites dans ce protocole, une dilution 10x du stock de microtubules et une dilution 12x du stock GUV ont généralement abouti à de bons réseaux LNT. Des dilutions de 5x et 6x, respectivement, ont également donné de bons réseaux.

Un autre défi consiste à s’assurer que la solution GUV est osmotiquement équilibrée avec la solution de microtubules. Si la différence d’osmolarité entre les deux solutions est trop grande, les GUV deviendront instables et potentiellement éclater. Si les solutions ne sont pas équilibrées sur le plan osmotique (p. ex., une différence de 10 % entre l’osmolarité mesurée entre les deux solutions), une solution de saccharose concentrée (p. ex., 2 M) doit être utilisée pour augmenter l’osmolarité de la solution avec l’osmolarité mesurée plus faible. Une autre limitation de ce système est la stabilité des réseaux LNT résultants, qui sont stables de l’ordre de l’heure et dépendent fortement de l’hydratation continue de la chambre d’écoulement (ou de l’étanchéité de la chambre avec du scellant). Une fois la solution évaporée de la chambre d’écoulement, les LNT ne seront plus utiles, malgré le fait que la présence de quelques LNT résiduels puisse persister après évaporation.

Les réseaux LNT créés à partir de ces microtubules et GUV planants peuvent être utiles pour comprendre la dynamique des bicouches lipidiques ainsi que la diffusion des protéines (par exemple, les protéines transmembranaires) sur les surfaces membranaires. Le protocole décrit ici peut rapidement créer des réseaux LNT composés de diverses formulations lipidiques qui imitent plus facilement les nanotubes à effet tunnel biologiques de type LNT ainsi que les nanotubes présents dans les organites liés à la membrane (c’est-à-dire le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi). La capacité de former des réseaux LNT à grande échelle est une première étape clé vers l’étude de la communication cellulaire, l’étude du transport de biomolécules nanofluidiques et le développement de réseaux neuronaux synthétiques. Ce protocole ouvre la porte à des études plus larges sur les propriétés physico-chimiques des LNT à l’aide d’un système de modèle in vitro minimal dans lequel la composition des LNT peut être facilement modifiée pour imiter les structures cellulaires naturelles.

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Disclosures

Sandia National Laboratories est un laboratoire multi-missions géré et exploité par National Technology & Engineering Solutions de Sandia, LLC., une filiale en propriété exclusive de Honeywell International, Inc., pour la National Nuclear Security Administration du DOE des États-Unis sous contrat DE-NA-0003525. Ce document décrit des résultats techniques objectifs et des analyses. Les points de vue ou opinions subjectifs qui pourraient être exprimés dans le document ne représentent pas nécessairement les points de vue du département de l’Énergie des États-Unis ou du gouvernement des États-Unis.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Département de l’énergie des États-Unis, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). La synthèse de la kinésine et la microscopie à fluorescence ont été réalisées dans le cadre d’un projet utilisateur (ZIM) au Center for Integrated Nanotechnologies, une installation d’utilisateurs du Bureau des utilisateurs du Bureau des sciences du Bureau des sciences du Département de la science des États-Unis ( DOE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective Olympus 1-U2B836 Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread
Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter Olympus Neutral Density Filter
AMP-PNP Sigma-Aldrich A2647 (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP Sigma-Aldrich A7699 Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set Semrock LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein Sigma-Aldrich 22090 Casein hydrolysate for microbiology
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Catalase from Bovine Liver
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol Avanti 700000P cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021 D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC Avanti 850375C 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin Avanti 870282C 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC Avanti 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin Avanti 870285P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT Sigma-Aldrich 43816 DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA Sigma-Aldrich E4378 EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase Sigma-Aldrich G6125 Glucose Oxidase from Aspergillus niger
Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol Fisher G33 Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-Aldrich G8877 Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope Olympus N/A IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH Sigma-Aldrich 1050121000 Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M1028 1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera Hamamatsu C13440-20CU ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE Invitrogen O12650 Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher P3456 Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE Invitrogen T1395MP Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Triethylammonium Salt
Trolox Sigma-Aldrich 238813 (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin Cytoskeleton T333P Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488 Cytoskeleton TL488M Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled Cytoskeleton T240 Tubulin protein porcine brain

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References

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Bioingénierie Numéro 173 bioingénierie nanotubes lipidiques kinésine microtubule motilité de glissement séparation de phase
Fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques multi-composants à l’aide du test de motilité de la kinésine glissante
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Imam, Z. I., Bachand, G. D. Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay. J. Vis. Exp. (173), e60899, doi:10.3791/60899 (2021).

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