Tiobarbitürik Asit Reaktif Maddeler Tahlil kullanılarak Biyolojik Örneklerde Oksidatif Stresin Değerlendirilmesi
Summary
Tiyorbitürik asit reaktif madde tahlilinin amacı, 532 nm’de görünür dalga boyu spektrofotometrisi kullanarak, öncelikle malondialdehit olmak üzere lipid peroksidasyon ürünlerinin üretimini ölçerek biyolojik numunelerdeki oksidatif stresi değerlendirmektir. Burada açıklanan yöntem insan serumu, hücre lysates ve düşük yoğunluklu lipoproteinlere uygulanabilir.
Abstract
Sınırlı analitik özgüllüğüne ve sağlamlığına rağmen, tiyobakroturik asit reaktif maddeleri (TBARS) tahlili, biyolojik sıvılarda lipid peroksidasyonunun jenerik ölçümü olarak yaygın olarak kullanılmıştır. Genellikle, numunenin düzgün bir şekilde ele alınması ve depolanmış olması koşuluyla, biyolojik bir numune içindeki oksidatif stres seviyelerinin iyi bir göstergesi olarak kabul edilir. Test, lipid peroksidasyon ürünlerinin, özellikle malondialdehitin (MDA), TBARS adı verilen MDA-TBA2 adducts oluşumuna yol açan tiyorbitürik asit (TBA) ile reaksiyonunu içerir. TBARS, spektrofotometrik olarak 532 nm’de ölçülebilen kırmızı-pembe bir renk verir. TBARS tahlili asidik koşullar altında (pH = 4) ve 95 °C’de gerçekleştirilir. Saf MDA kararsızdır, ancak bu koşullar, bu yöntemde analitik standart olarak kullanılan MDA bis’ten (dimetil asetal) MDA’nın serbest bırakılmasına izin verir. TBARS tahlil, yaklaşık 2 saat içinde tamamlanabilen basit bir yöntemdir. Test reaktiflerinin hazırlanması burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bütçe bilincine sahip araştırmacılar, bu reaktifleri yalnızca tek bir standart eğrinin inşasına izin veren pahalı bir TBARS test kiti satın almak yerine düşük maliyetle birden fazla deney için kullanabilirler (ve bu nedenle yalnızca bir deney için kullanılabilir). Bu TBARS testinin uygulanabilirliği insan serumunda, düşük yoğunluklu lipoproteinlerde ve hücre lysates’lerinde gösterilmiştir. Test tutarlı ve tekrarlanabilir ve 1.1 μM algılama sınırlarına ulaşılabilir. Spektrofotometrik TBARS testinin kullanımı ve yorumlanması için öneriler sunulmaktadır.
Introduction
Lipid peroksidasyonu, reaktif oksijen türleri ve reaktif azot türleri gibi serbest radikallerin lipitlerdeki karbon-karbon çift bağlarına saldırdığı, bir hidrojenin karbondan soyutlanması ve bir oksijen molekülünün yerleştirilmesini içeren bir süreçtir. Bu işlem, birincil ürünler olarak lipid peroksil radikalleri ve hidroperoksitlerin yanı sıra malondialdehit (MDA) ve baskın ikincil ürünler olarak 4-hidroksinononal dahil olmak üzere karmaşık ürünlerin bir karışımına yol açar1.
MDA, tiaobarbitürik asit (TBA) ile olan facile reaksiyonu nedeniyle lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olarak biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Reaksiyon, 532 nm’de görünür spektrumda emilen ve kırmızı-pembe bir renk2 üreten bir konjuge olan MDA-TBA2 oluşumuna yol açar. MDA’nın yanı sıra lipid peroksidasyonundan elde edilen diğer moleküller de TBA ile reaksiyona alabilir ve 532 nm’de ışığı emerek ölçülen genel emilim sinyaline katkıda bulunabilir. Benzer şekilde, MDA diğer ana biyomolekül sınıflarının çoğuyla reaksiyona girerek TBA3,4 ile reaksiyona erişilebilirliğini potansiyel olarak sınırlayabilir. Bu nedenle, bu geleneksel test sadece “tiyobakroturik asit reaktif maddeleri” veya TBARS5’i ölçmek için kabul edilir.
Doğru uygulandığında ve yorumlandığında, TBARS tahlili genellikle biyolojik bir örnekteki genel oksidatif stres seviyelerinin iyi bir göstergesi olarak kabul edilir6. Ne yazık ki, Khoubnasabjafari ve diğerleri tarafından belgelenen TBARS tahlilleri genellikle şüpheli sonuçları kolaylaştıracak şekilde yürütülür ve yorumlanır3,4,7,8,9,10,11. Bunun nedenleri öncelikle örnekle ilgili ön analitik değişkenlere ve tahlil sonuçlarında önemli değişiklikler olmadan test protokolünde görünüşte küçük varyasyonları yasaklayan test sağlamlığı eksikliğine dayanır1,7,12,13.
Biyospepsimen elleçleme ve depolama ile ilgili preanalitik değişkenler (örneğin, geçici olarak -20 °C’de tutulan kan plazması)14,15 TBARS tahlil sonuçları üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir16,17; öyle ki, TBARS test sonuçları, açık detaylandırıcı analitik doğrulama verileri tarafından garanti edilmediği sürece farklı laboratuvarlarda karşılaştırılmamalıdır. Bu öneri, batı lekelerinin yaygın olarak nasıl kullanıldığına ve yorumlandırıldığına benzer. Bant yoğunluklarının karşılaştırılması leke içi ve belki de laboratuvar içi çalışmalar için geçerlidir, ancak laboratuvarlar arasındaki bant yoğunluklarının karşılaştırılması genellikle geçersiz bir uygulama olarak kabul edilir.
Bazı araştırmacılar, TBARS testi tarafından ölçülen MDA’nın kabul edilebilir bir biyobelirteç3,9,10,18,19’un gerektirdiği analitik veya klinik kriterleri karşılamadığını öne sürmektedir. Nitekim, tahlil 50 yıl önce geliştirilmeseydi, muhtemelen bugünkü yaygın kullanım ve zımni kabul edilebilirliği kazanamayacaktı. Oksidatif stresin belirlenmesinde kullanılan daha fazla analitik hassasiyet, özgüllük ve sağlamlığa sahip başka tahliller olmasına rağmen, 532 nm’deki absorbansa dayanan TBARS tahlilleri, lipid peroksidasyon20’nin belirlenmesi ve böylece oksidatif stresin değerlendirilmesi için açık ara en sık kullanılan tahlillerden biri olarak kalmaktadır.
TBARS tahlilleri sadece, talimatların kullanılan reaktiflerin çoğu konsantrasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlamadığı pahalı bir kit (400 ABD dolarının üzerinde) olarak bulunabilir. Ayrıca, sağlanan reaktifler yalnızca bir deneme için kullanılabilir, çünkü kit başına yalnızca bir kolorimetrik standart eğri yapılabilir. Bu, farklı zaman noktalarında birkaç örnek içinde oksidasyon seviyelerini belirlemeyi amaçlayan araştırmacılar için sorunlu olabilir, çünkü aynı standart eğri birden çok kez kullanılamaz. Bu nedenle, birden fazla deney için birden fazla kit satın alınması gerekir. Şu anda, pahalı bir kit satın alınmadığı sürece, TBARS testini nasıl gerçekleştireceklerine dair ayrıntılı bir protokol yoktur. Geçmişte bazı araştırmacılar bir TBARS tahlilinin nasıl gerçekleştirildiğini belirsiz bir şekilde tanımlamıştır21,22, ancak TBARS tahlilinin pahalı bir kit olmadan nasıl yürütüleceklerine dair tam ayrıntılı bir protokol veya kapsamlı bir video literatürde mevcut değildir.
Burada, TBARS testlerinin basit, tekrarlanabilir ve ucuz bir şekilde nasıl gerçekleştirilacağı hakkında ayrıntılı, analitik olarak doğrulanmış bir amaç için metodoloji rapor ediyoruz. Cu(II) iyonları ile tedavi üzerine insan serumu, HepG2 lisates ve düşük yoğunluklu lipoproteinlerin lipid peroksidasyonundaki değişiklikler TBARS testi için açıklayıcı uygulamalar olarak gösterilmiştir. Sonuçlar, bu TBARS tahlilinin günlük olarak tutarlı ve tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sınırlamalarına rağmen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 ve laboratuvarlar arasında karşılaştırmaya uygunluk eksikliği, TBARS tahlil en </sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada bildirilen araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından ödül no altında desteklendi. R33 CA217702 ve Öğrenci Gelişimini En Üst Düzeye Çıkarma Girişimi (IMSD) programı. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşünü temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| 1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642–262 | cell lysis reagent |
| 50 mL self-standing centrifuge tube | Corning, NY | CLS430897 | General material |
| 96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | To measure absorbance |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL purification |
| Caps for glass tubes | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | for TBARS assay |
| Copper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | to induce oxidation |
| Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | for TBARS assay |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | General material |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | General material |
| Fetal Bovine Serum US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
| Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cell lysis reagent |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL solvent |
| HepG2 Cells | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
| Hydrocloric acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
| Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | General material |
| Low Density Lipoprotein, Human Plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biological matrix prototype |
| Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | General material |
| Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standard |
| Multiskan Go Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | To measure absorbance |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cell lysis reagent |
| Sodium Chloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cell lysis reagent |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Reagent |
| Sodium hydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS Reagent |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | For concentrating cell lysates |
| T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap | USA Scientific, FL | 658175 | cell culture |
| Thiobarbituric Acid | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Reagent |
| TRIS base | Fluka, GA | 93362 | cell lysis reagent |
| Trypsin (1x) | VWR, PA | 16777-166 | To detach HepG2 cells |
References
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
- Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
- Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
- Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
- Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
- Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning “Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis”. Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on “Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action”. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on “An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer”. Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
- Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
- Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
- Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
- Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
- Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
- Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
- Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
- Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , 153-196 (2014).
- Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , 1-24 (2007).
- Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
- Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
- Yagi, K., Armstrong, D. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).
- Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
- Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
- Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
- Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
- Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
- Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
- Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
- Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
- Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).
