Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Identifisering, isolasjon og karakterisering av Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) og Myogenic Progenitors (MPs) i skjelettmuskulaturen i rotten

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/61750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen skisserer en metode for å isolere Fibro-adipogene forfedre (FAPer) og myogene forfedre (MPs) fra rotte skjelettmuskulatur. Utnyttelse av rotten i muskelskademodeller gir økt vevstilgjengelighet fra atrofisk muskel for analysen og et større repertoar av validerte metoder for å vurdere muskelstyrke og gang i fritt bevegelige dyr.

Abstract

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) er bosatt interstitiale celler i skjelettmuskulatur som sammen med myogene forfedre (MPs) spiller en nøkkelrolle i muskel homeostase, skade og reparasjon. Gjeldende protokoller for FAPs identifikasjon og isolasjon bruker strømningscytometri/fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og studier som evaluerer deres funksjon in vivo til dags dato har blitt utført utelukkende hos mus. Den større iboende størrelsen på rotten gir mulighet for en mer omfattende analyse av FAPs i skjelettmuskulaturskademodeller, spesielt i alvorlig atrofisk muskel eller når etterforskere krever betydelig vevsmasse for å gjennomføre flere nedstrømsanalyser. Rotten gir i tillegg et større utvalg av muskelfunksjonelle analyser som ikke krever dyresedasjon eller offer, og dermed minimerer sykelighet og dyrebruk ved å muliggjøre serievurderinger. Strømningscytometri/FACS-protokollene som er optimalisert for mus er artsspesifikke, spesielt begrenset av egenskapene til kommersielt tilgjengelige antistoffer. De har ikke blitt optimalisert for å skille FAPs fra rotte eller svært fibrotisk muskel. En strømningscytometri/FACS-protokoll for identifisering og isolering av FAPer og MPs fra både sunn og denervated rotte skjelettmuskulatur ble utviklet, avhengig av differensialuttrykket til overflatemarkører CD31, CD45, Sca-1 og VCAM-1. Ettersom rottespesifikke, strømningscytometri-validerte primære antistoffer er sterkt begrenset, ble intern konjugering av antistoffet rettet mot Sca-1 utført. Ved hjelp av denne protokollen ble vellykket Sca-1-konjugering bekreftet, og strømningscytometrisk identifikasjon av FAPer og MPs ble validert av cellekultur og immunisering av FACS-isolerte FAPer og MPs. Til slutt rapporterer vi et nytt FAPs-tidskurs i en langvarig (14 uker) rottefornektermodell. Denne metoden gir etterforskerne muligheten til å studere FAPs i en ny dyremodell.

Introduction

Fibro-adipogene stamceller (FAPs) er en populasjon av bosatte multipotente stamceller i skjelettmuskulatur som spiller en kritisk rolle i muskel homeostase, reparasjon og regenerering, og omvendt, også megle patologiske responser på muskelskade. Som navnet antyder, ble FAPs opprinnelig identifisert som en forfedrepopulasjon med potensial til å skille seg ut i fibroblaster og adipocytter1 og ble påstått å være de viktigste mediatorene for fibro-fettinfiltrasjon av skjelettmuskulatur i kronisk skade og sykdom. Videre studie viste at FAPs er i tillegg i stand til osteogenese og kondrogenese2,3,4. Dermed er de mer bredt merket i litteraturen som mesenchymale eller stromale forfedre3,5,6,7,8. Ved akutt skjelettmuskulaturskade hjelper FAPs indirekte til regenerativ myogenese ved forbigående spredning for å gi et gunstig miljø for aktiverte muskelsatellittceller og deres nedstrøms myogene forfedre (MPs) kolleger1,9,10. Parallelt med vellykket regenerering gjennomgår FAPer apoptose, og returnerer tallene sine til baseline nivåer1,9,10,11. I motsetning, i kronisk muskelskade, overstyrer FAPs pro-apoptotiske signaler, noe som resulterer i deres utholdenhet9,10,11 og unormal muskelreparasjon.

In vivo-studier som evaluerer de cellulære og molekylære mekanismene som FAPs formidler muskelresponser har brukt murine dyremodeller til dags dato1,7,9,10,11,12,13,14. Mens genmodifiserte mus er kraftige verktøy for bruk i disse analysene, begrenser den lille størrelsen på dyret vevstilgjengeligheten for studier i langsiktige lokaliserte skademodeller der muskelatrofi kan være dyp, for eksempel traumatisk denervasjon. Videre krever måling av muskelstyrke og fysisk funksjon ex vivo- eller in situ-målinger som nødvendiggjør avslutning av musen, eller in vivo-metoder som krever kirurgi og / eller en generell bedøvelse for å tillate evaluering av muskelkontraktil ytelse15,16,17,18,19,20 . Hos rotter eksisterer godt validerte og globalt utnyttede muskelfunksjonsanalyser, i tillegg til analyser for mer kompleks motorisk atferd som ganganalyse (f.eks. isjiasfunksjonsindeks, CatWalk-analyse) og utføres hos våkne og spontant bevegelige dyr21,22,23,24 . Dette optimaliserer i tillegg prinsippene for minimal sykelighet i dyreforsøk, og antall forskningsdyr som brukes. Rotten gir dermed FAPs etterforsker den ekstra fleksibiliteten til større skadet muskelvolum for protein- og cellulære analyser og evnen til å foreta serielle vurderinger av muskelkompleks statisk og dynamisk funksjonell aktivitet og atferd, i varslingsdyret.

FAPs har primært blitt identifisert og isolert fra hele muskelprøver ved hjelp av henholdsvis flow cytometri og fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Dette er laserbaserte analyser som kan identifisere flere spesifikke cellepopulasjoner basert på karakteristiske trekk som størrelse, granularitet og en bestemt kombinasjon av celleoverflate eller intracellulære markører25. Dette er svært fordelaktig i studiet av et organsystem som skjelettmuskulatur, da homeostase og regenerering er komplekse, multifaktorielle prosesser koordinert av en mengde celletyper. En seminalstudie identifiserte FAPer, så vel som MPs, ved hjelp av strømningscytometriske metoder i mus skjelettmuskulatur1. De viste at FAPs er mesenchymale i naturen, da de manglet overflateantigener som var spesifikke for celler fra endotel (CD31), hematopoietisk (CD45) eller myogen (Integrin-α7 [ITGA7]) opprinnelse, men uttrykte den mesenchymale stamcellemarkøren Sca-1 (Stamcelleantigen 1)1 og differensiert i fibrogene og adipogene celler i kulturen. Andre studier viste vellykket isolasjon av mesenchymale forfedre i muskel basert på uttrykket av en alternativ stamcellemarkør, blodplate-avledet vekstfaktorreseptor alfa (PDGFRα)2,7,8 og videre analyse viste at disse sannsynligvis vil være samme cellepopulasjon som FAPs3. FAPer identifiseres nå ofte i flytcytometri ved hjelp av enten Sca-1 eller PDGFRα som et positivt utvalgsmerke1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Bruken av PDGFRα er imidlertid fortrinnsrett for humant vev, da en direkte menneskelig homolog av murin Sca-1 ennå ikke er identifisert32. I tillegg er andre celleoverflateproteiner rapportert som markører av MPs (f.eks. VCAM-1), noe som gir et potensielt alternativ til ITGA7 som en indikator på celler med myogen avledning under FAPs isolasjon33.

Mens flow cytometri / FACS er en kraftig metodikk for å studere faps rolle og patogene potensial i skjelettmuskulatur1,9,10,11,13,29, er det begrenset teknisk av spesifisiteten og optimaliseringen av de nødvendige reagensene. Siden strømningscytometrisk identifisering og isolering av FAPs er utviklet og utført i musedyrmodeller1,9,10,11,29, gir dette utfordringer for forskere som ønsker å studere FAPs i andre modellorganismer. Mange faktorer - som optimal vevsstørrelse som skal behandles, samt reagens og / eller antistoff spesifisitet og tilgjengelighet - varierer avhengig av arten som brukes.

I tillegg til de tekniske barrierene for å studere FAPs i en ny dyremodell, har de i stor grad blitt studert i en akutt, giftig setting - vanligvis via intramuskulær kjemisk injeksjon eller kardiotoksin. Evaluering av FAPs langsiktige dynamikk er hovedsakelig begrenset til vurdering i Duchennes muskeldystrofi, ved hjelp av mdx-musemodellen9,10,11og modeller av kombinasjonsmuskelskade som massiv rotatormansjettrivning der samtidig senetranseksjon og denervasjon utføres på skuldermuskulaturen26,27,28 . Faps respons på den eneste fornærmelsen av kronisk traumatisk denervasjon, en vanlig forekomst i arbeidsstedsulykker i tungindustri, landbruk og i fødselstraumer (brachial plexusskade)34,35,36,37 med betydelig sykelighet, har ikke vært så godt karakterisert, ofte begrenset til en kortsiktig tidsramme11,38.

Vi beskriver en metode for å identifisere og isolere FAPs og MPs fra sunn samt alvorlig atrofisk og fibrotisk skjelettmuskulatur i rotten. Først blir identifisering av CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs og CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs ved hjelp av en vevsfordøye- og strømningscytometrifargingsprotokoll demonstrert, og etterfølgende validering av funnene våre utføres gjennom kultur og immunocytokjemisk farging av FACS-isolerte celler. Ved hjelp av denne metoden rapporterer vi også et nytt FAPs-tidskurs i en langsiktig isolert denervasjonsskademodell i rotten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etterforskere som gjennomfører denne protokollen må få tillatelse fra sitt lokale dyreetiske styre/omsorgsutvalg. Alt dyrearbeid ble godkjent av St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC #918) og ble utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av Canadian Council on Animal Care (CCAC). Et skjema for flytcytometriprotokollen vises i figur 1. Hvis nedstrømsapplikasjonen er FACS og påfølgende cellekultur, bør alle trinnene fullføres med riktig aseptisk teknikk.

1. Muskel høsting

  1. Bedøv rotter ved hjelp av en passende bedøvelse og offer i henhold til lokale retningslinjer for vivarium og dyreetikk. Denne protokollen høster gastrocnemius muskelen fra voksne kvinnelige Lewis rotter (200-250 g), som et eksempel. Rotter ble bedøvet ved hjelp av 2-3% Isofluran og ble ofret ved intrakariac injeksjon av T61.
  2. Når dyret har blitt ofret, barber hele bakbenet for å lette plasseringen av muskelen og minimere pelsforurensning av høstet vev.
  3. Bruk en steril skalpell, lag to snitt i huden: den første rundt omkretsen av ankelleddet og den andre opp midtlinjen av mediale aspektet av bakbenet fra ankelen til hoften.
  4. Skrell tilbake huden og overfladiske muskellag for å avsløre den underliggende gastrocnemius, som stammer fra medial og laterale kondyler av lårbenet og innsatser på akillessenen.
  5. Bruk stump disseksjon for å skille gastrocnemius fra det omkringliggende vevet, håndtere muskelen bare av senen for å unngå knuseskade.
  6. Skill gastrocnemius fra innsettingen ved å transektere akillessenen så distalt som mulig med skarp saks. Når du er kuttet, ta tak i akillessenen med tang og skrell gastrocnemius forsiktig av underlagsbenet. Hold fortsatt muskelen med tang i den ene hånden, finn gastrocnemius' to opprinnelser og kutt ved mediale og laterale femorale kondyler.
  7. Flekk den utskilte gastrocnemius forsiktig mot et sterilt stykke gasbind for å fjerne så mye blod som mulig. Trim muskelen på en steril overflate og fjern overflødig bindevev så vel som akillessenen.
  8. Plasser muskelen i en veiebåt og vei ved hjelp av en presisjonsvekt. Denne protokollen er optimalisert for å fordøye muskler med en våt vekt fra 200-600 mg. Operatører kan om ønskelig dele opp overflødig høstet vev for andre nedstrømsanalyser.
  9. Del forsiktig høstede muskler som skal brukes til strømningscytometri i 3-4 mindre stykker (ca. 1-2 cm3) og senk nedsenket i iskald 1x PBS. Hold deg kald på is til alle prøver er høstet.

2. Muskel fordøyelse

  1. Fjern muskelen fra PBS og legg i en steril 10 cm cellekulturrett. Riv forsiktig og hakk vev med tang til brikkene er ca. 3-4 mm3, og fjern så mye bindevev som mulig. Når det er grundig hakket, overfør til et sterilt 50 ml konisk rør som inneholder 6 ml DMEM + 1% penicillin/streptomycin (P/S).
  2. Tilsett 10 μL 300 mM CaCl2-oppløsning til 365 μL Kollagenase II-oppløsning (lagerkonsentrasjon 4800 U/ml) for å aktivere kollagenaseenzymet. Tilsett den aktiverte kollagen II-oppløsningen i det koniske røret på 50 ml som inneholder vevsslammet. Den endelige Kollagen II-konsentrasjonen er 250 U/ml.
  3. Inkuber rør i en shaker i 1 time ved 37 °C, 240 x g, sørg for å virvle manuelt hver 15 min for å løsne ethvert vev som har festet seg til siden av røret.
  4. Etter 1 time, fjern rørene fra shaker og legg til følgende per prøve: 100 μL collagenase II (4800 U/ml) og 50 μL dispase (4,8 U/ml).
  5. Pipetteprøver ved hjelp av en serologisk pipette 15-20 ganger til løsningen er homogen. Hvis du behandler flere prøver, bruk en separat steril pipette for hver prøve for å unngå prøvekrysskontaminering.
  6. Inkuber igjen i en shaker i 30 min ved 37 °C og 240 x g. Etter 15 min, rist prøver for hånd for å løsne tilhengervev fra siden av røret.

3. Generering av encellet suspensjon

  1. Skjær sakte prøver gjennom en 10 ml sprøyte med en 20 G nål i 10 sykluser.
    MERK: En syklus innebærer å ta opp muskeloppløsning i sprøyten, og injisere den tilbake i røret. Sørg for å minimere eventuelle bobler ved å fullføre skjære sakte, da overdreven skumming kan forårsake ytterligere celledød39.
  2. Plasser en 40 μm cellesil på et sterilt 50 ml konisk rør og fukt det ved å pipettere 5 ml DMEM + 10% FBS &1% P / S.
  3. Pipette 1 ml av prøven om gangen gjennom cellesilen.
  4. Vask cellesilen ved å pipettere DMEM med 10% FBS og 1% P / S gjennom silen for å bringe det totale volumet i røret til 25 ml.
  5. Del 25 ml av prøven likt i to koniske rør på 15 ml og sentrifuger ved 15 °C, 400 x g i 15 minutter.
    MERK: Splitting av muskelløsningen i to 15 ml koniske rør sikrer bedre cellegjenoppretting etter sentrifugering sammenlignet med et enkelt rør.
  6. Aspirer supernatanten og re-suspender pelletsen i 1 ml 1x RBC Lysis-buffer (se Tilleggsfil) ved romtemperatur i 7 minutter for å eliminere erytrocytter.
  7. Ta opp volumet til 10 ml med 9 ml vaskebuffer (se Tilleggsfil) og spinnrør ved 400 x g, 15 °C i 15 minutter.
  8. Aspirer de supernatante og rekombinpellets ved å suspendere i 1 ml vaskebuffer.
  9. Overfør et passende volum celler til et separat 1,5 ml mikrosenterrør og bland med trypanblå fargestoff. Tell levende celler på et lysmikroskop ved hjelp av et hemocytometer.

4. Antistofffarging for strømningscytometri

MERK: Sca-1-antistoffet må konjugeres til APC før strømningscytometri/FACS-eksperimenter, i henhold til produsentens instruksjoner. Ytelsen må valideres for hver gruppe konjugater (figur 2). Endelige konjugeringer kan lagres i 20 μL aliquots ved -20 °C og er stabile i tre uker. Se tilleggsfilen for fullstendig konjugeringsprotokoll.

  1. For strømningscytometri, overfør 1-2 x10 6 celler per eksperimentell prøve til et sterilt 1,5 ml mikrosenterrør. Ta med volum opp til 1 ml med vaskebuffer og legg på is.
  2. For hvert eksperiment konfigurerer du følgende nødvendige kontroller: i) uoppnåelige og ii) levedyktighetskontroller for å velge nøyaktig for den aktive cellepopulasjonen. iii) fluorescens minus en (FMO) kontroller på enkeltcelle suspensjoner for å angi nøyaktige porter for CD31-/CD45-brøker, FAPer og MPs; og iv) enkeltfargede kompensasjonsperler for å korrigere for fluorescenssøl mellom kanaler.
    1. For alle cellekontroller, aliquot 5 x 105 - 1 x 106 celler i 1 ml vaskebuffer i et 1,5 ml mikrosenterrør og legg på is.
    2. For perlekontroller, tilsett 1 dråpe positive kompensasjonsperler (~ 1,5 x 105 per dråpe) til hver merket 1,5 ml mikrosenterrør. Det fullstendige komplementet av kontroller er oppført i Tabell 1.
      MERK: Hvis eksperimentet utføres for første gang, kjør enkeltfargede kontroller for hvert konjugerte antistoff på enkeltcellede suspensjoner (i tillegg til unstained, levedyktighet, enkeltfarget kompensasjonsperle og FMO-kontroller) for å vurdere den positive fargede populasjonen i celler og validere farging observert på kompensasjonsperler. Valider hver nykonjugert Sca-1::APC-forberedelse ved å utføre enkeltfarging på kompensasjonsperler og enkeltcelle suspensjoner. Se tabell 1 hvis du vil se en fullstendig liste over fargekontroller.
  3. For å forberede levedyktighetskontrollen, overfør halvparten av volumet av celler fra "levedyktighet" -røret til et nytt 1,5 ml mikrosenterrør. Merk dette røret "Død".
  4. Inkuber "Død" rør ved 65 °C i 2-3 min for å drepe cellene, og legg deretter på is. Etter 2-3 min kombinerer du døde celler på nytt med levende celler som er igjen i levedyktighetskontrollrøret. Denne populasjonen av celler vil bli brukt til å angi kompensasjonsverdier (om nødvendig) og riktig angi porter for levedyktighetsfargen.
  5. Sentrifuger enkeltcellefjæringene (eksperimentelle prøver og kontroller) ved 500 x g, 4 °C i 5 minutter.
  6. Aspirer supernatanten og re-suspender cellepellets i 100 μL vaskebuffer.
  7. Tilsett antistoffer, avhengig av eksperimentell prøve eller kontroll. Se fargematrisen (tabell 2) hvis du vil ha informasjon om antistoffkombinasjoner og -mengder.
  8. Flikk forsiktig hver prøve for å sikre fullstendig blanding og inkubering på is i mørket i 15 minutter. For kompensasjon perler, inkubere ved romtemperatur i mørket i 15 min.
  9. For eksperimentelle og kontrollprøver med enkeltcelle suspensjon får du opp volumet til 1 ml ved å legge til 900 μL vaskebuffer. For kompensasjonsperlekontroller, få opp volumet til 1 ml med 900 μL 1x PBS.
  10. Sentrifuger enkeltcellede suspensjonsprøver ved 500 x g, 4 °C i 5 minutter. Sentrifugekompensasjon perlekontroller ved 300 x g, 4 °C i 5 minutter.
  11. For alle enkeltcellede suspensjonsprøver, aspirerer og kaster supernatant og suspenderer cellepellet i 300 μL vaskebuffer. For kompensasjon perle kontroller, aspirere og kaste supernatant, suspendere pellet i 300 μL av 1x PBS, deretter legge til 1 dråpe (~ 1,5 x 105) av negative kompensasjon perler.
  12. Hold alle enkeltcellefjæringsprøver på is under aluminiumsfolie og fortsett å strømme cytometrisk oppkjøp. Kompensasjonsperlekontroller bør også beskyttes mot lys, men kan holdes ved romtemperatur.
    MERK: Hvis eksperimentelt endepunkt er FAPs identifikasjon ved flowcytometri, følger du trinn 5.1.1-5.1.11. Hvis endepunkt er celleisolasjon via FACS for kultur og farging, følger du trinn 5.2.1-5.2.9 og avsnitt 6-7.

5. Strømningscytometri og fluorescensaktivert cellesortering (FACS)

  1. Flowcytometri
    MERK: Denne protokollen bruker et benkstrømcytometer utstyrt med 405 nm, 488 nm og 640 nm lasere som samtidig kan skille 10 forskjellige farger. Bandpassfiltre og deres tilknyttede fluorokromer som brukes i denne protokollen er som følger: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) og 670/30 (APC). Spenninger for hver detektor er som følger: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Blå 360; APC 570. Forsikre deg om at du er opplært i riktig drift av strømningscytometeret eller cellesorteringen før bruk.
    1. Forsikre deg om at cytometeret er slått på i 10-20 minutter før bruk og har blitt primet ved å rengjøre sekvensielt med rene, skylle- og hylsevæskeløsninger i 30-45 s hver. Avslutt med en skylling med dH2O. Sørg for at det er tilsatt et tilstrekkelig volum hylsevæske til lagringsbeholderen for å opprettholde riktig prøvestrøm gjennom oppkjøpet.
    2. Definer gatingstrategien for å identifisere FAPer og MPer som avgrenset i figur 3.
      MERK: FAPer og MPer identifiseres ved hjelp av følgende hierarkiske gatingstrategi: i) SSC-A vs FSC-A (sidecellespredningsområde kontra fremovercellespredningsområde for å skille celler vs rusk), ii) FSC-W vs FSC-H (fremovercellespredning bredde kontra fremover celle scatter høyde for å diskriminere singlets fra dobler i FSC parameteren), iii) SSC-W vs SSC-H (sidecelle scatter bredde versus sidecelle scatter høyde for å diskriminere singlets fra doublets i SSC parameteren), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (for å skille levende versus døde singlets), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (for å ekskludere CD31+ og CD45+ celler fra videre analyse), og vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E fra CD31-/CD45- (Lineage; Lin-) populasjon (identifikasjon av FAPer og parlamentsmedlemmer). FAPer identifiseres som CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-hendelser, og MPs identifiseres som CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+-hendelser.
    3. Kjør først hver enkeltfarget kompensasjonsperlekontroll gjennom cytometeret på lav hastighet for å generere kompensasjonsverdier som brukes til å korrigere for fluorescensutslipp mellom kanaler. Vurder kompensasjon ved å sammenligne fluorescerende signal for hver kontroll i sin egen detektor (f.eks. SSC-A vs APC for Sca-1::APC enkeltfargede perler) samt alle andre detektorer. Det bør være to forskjellige populasjoner (en med negativ og en med positivt signal) i riktig detektor og bare en negativ befolkning i alle andre detektorer. Sett stoppporten til 10 000 kompensasjonsperler og registrer dataene.
      MERK: Mellom anskaffelsen av hver prøve må du kjøre dH2O gjennom cytometeret i 10-20 sek for å unngå prøve-til-prøve-forurensning.
    4. Deretter behandler du de uoppdagede og levedyktighetskontrollprøvene for å kunne gate på direkte enkeltceller. Sett stoppporten til 10 000 singlet-hendelser og registrer data.
      MERK: Omtrent 5 minutter før oppkjøpet av hver enkelt celle suspensjonsprøve med unntak av den unstained prøven, tilsett 1 μL SYTOX Blå levedyktighetsfargestoff (300 μM arbeidskonsentrasjon fortynnet fra 1 mM lagerløsning) til hver prøve og flikk forsiktig for å blande (sluttkonsentrasjon 1 μM).
    5. Hent deretter de resterende kontrollprøvene for enkeltcelleoppheng. Vurder hver FMO-kontroll med riktig plott i gatingstrategien (figur 3). Vurder for eksempel FITC-signalet til CD31+CD45 FMO for å sikre en nøyaktig CD31-/CD45-port. Et optimalt eksempel vises i figur 3G. Hvis protokollen utføres for første gang, bør enkeltfargede kontroller på celler kjøres før anskaffelse av FMO-kontroller.
    6. Vurder fluorescerende signalet til hver enkeltfarget celleprøve i riktig detektor, så vel som i alle andre detektorer for å validere riktig kompensasjon. Sett stoppporten til 10,000 live singlet hendelser og ta opp på programvaren.
    7. Når alle kontroller (enkeltcelle suspensjoner og perler) er behandlet, forberede alle eksperimentelle prøver ved først å måle og registrere volumet av hver prøve. Disse målingene vil bli brukt til å kvantifisere FAPer og MPs nøyaktig, som beskrevet i trinn 5.1.11. Tilsett deretter 50 μL presisjonstellingsperler og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned 2-3 ganger.
    8. Kjør kort det første eksperimentelle utvalget for å validere identifisering av telleperlepopulasjonen. Denne populasjonen vises som en liten, distinkt sektorgruppe atskilt fra den generelle cellepopulasjonen på tegneplottet FSC-A vs SSC-A (Figur 3A, rød boks). Lag en port rundt den tellende perlepopulasjonen. Innhente deretter data for hver eksperimentelle prøve ved å behandle gjennom cytometeret på lav hastighet. Sett stoppporten til 10 000 tellende perlehendelser og rekord.
      MERK: Etterforskere kan alternativt identifisere telleperler ved å sette opp en ekstra tomt som vurderer SSC-A kontra noen av detektorene, da telleperlene er fluorescerende i alle detektorer.
    9. Når alle prøvene er behandlet, rengjør du cytometeret ved hjelp av de riktige protokollene. Eksporter alle data for analyse.
    10. Åpne alle datafiler på en passende programvare for flytcytometrianalyse. Angi gatingstrategien slik den brukes til datainnsamling som beskrevet i trinn 5.1.2. Undersøk kontroller i samme rekkefølge som ved datainnsamling (f.eks. ustabil, levedyktighet, enkeltflekker og deretter FMO-kontroller) for å validere gatingstrategien på nytt. Når nøyaktige porter er angitt ved hjelp av FMO-kontroller, bruker du portene på alle eksperimentelle prøver. Eksporter rådata som et regneark for kvantifisering.
    11. Beregn antall FAPer og MPer i hvert eksperimentelt utvalg ved hjelp av telleperlene:
      Equation 1
      hvor, Ervervet Celleantall er antall registrerte hendelser av relevant cellepopulasjon (f.eks FAPs eller MPs) på oppkjøpsprogramvaren; Ervervet perletelling er antall registrerte hendelser ved telling av perler på oppkjøpsprogramvaren; Telle perler Volum er volumet av telle perle løsning lagt i trinn 5.1.7; Prøvevolum er volumet av hver farget eksperimentell prøve før tilsetning av telleperler.; Perlekonsentrasjon er antall perler per μL-løsning; Denne verdien finnes i produktdataarket.
  2. FACS - sortering for cellekultur
    MERK: Denne protokollen utfører FACS på en cellesortering utstyrt med 4 lasere (UV, Violet, Blue, Red) som er i stand til samtidig å skille 11-14 farger. Følg den eksperimentelle prøvefargingen (avsnitt 4) og flytcytometriprotokollen, med unntak av trinn 1 til 3 avgrenset nedenfor, for å optimalisere FACS-arbeidsflyten:
    1. Øk konsentrasjonen av celler i de eksperimentelle prøvene som skal sorteres til 7 x 106 celler /ml for å generere robuste utbytter av FAPer og MPs.
    2. For å gjøre rede for denne betydelige økningen i cellekonsentrasjonen, dobler du alle antistoffkonsentrasjoner i de eksperimentelle prøvene som skal sorteres.
    3. Behandle de endelige fargede celleprøvene gjennom en 40 μM cellesilhette festet til et 5 ml polystyrenrør umiddelbart før sortering for å redusere cellekumping og øke sorteringsutbyttet.
    4. Samle enkeltstående, levende rotte-FAPer og MPs direkte fra cellesorteringen i et 5 ml polypropylenoppsamlingsrør som inneholder 1 ml sterilt, 100% fetal bovint serum (FBS). Hold celler på is til sorteringen er fullført.
      MERK: Hvis du utfører FACS på et sted utenfor stedet, må du overføre alle sorterte celler på is og i en sikret, tildekket beholder.
    5. Arbeide i et sterilt biosikkerhetsskap (BSC), bringe volum av sorterte FAPer, og MP vekstmedier (MP GM) for sorterte MPs; se Supplementary File for oppskrifter) og sentrifuge ved 500 x g, 4 °C i 7 minutter for å fjerne så mye gjenværende vaskebuffer som mulig.
    6. Resuspendpellets i 1 ml passende vekstmedier og plate i en 12-brønnsplate som inneholder en steril, kollagenbelagt 12 mm glassdekslerlip/brønn for etterfølgende immunstaining (se avsnitt 6).
      MERK: Hvis immunocytokjemi farging for kollagen, plate sortert celler i en 12 brønn plate som inneholder en steril, laminin-belagt 12 mm glass dekslerlip / brønn, i stedet for kollagen-belagt. Hvis immunocytokjemi eksperimenter av umiddelbart isolerte forfedre er nødvendig, frø FAPs og MPs med en tetthet på 15,000 celler per cm2 og gå direkte til trinn 6.1. For langsiktige kulturer for å indusere forfedredifferensiering, frø FAPs med en tetthet på 5000 celler per cm2, og MPs med en tetthet på 7500 celler per cm2.
    7. Inkuber celler ved 37 °C og 5 % CO2 i en cellekulturinkubator. Etter 72 timer i kultur, endre halvparten av media. Bytt medium helt hver 2-4 d etter.
    8. For å indusere myocyttutvikling, bytt MPs kulturer til MP differensiering (MD) medium på dag 9 av kulturen. For å indusere adipocytter, bytt FAPs kulturer til FAP adipogenic differensiering (AD) medium på dag 10 av kulturen.
    9. For å indusere fibrogenese kan FAPer byttes til fibrogene differensieringsmedier (FD) på variable tidspunkter under kultur, eller alternativt kan frøs direkte inn i FD-medier etter isolasjon (trinn 5.2.6) (Se Tilleggsfil for alle medieoppskrifter).

6. Immunocytokjemi av kultiverte FAPer og MPs

  1. For å validere cellesortering og demonstrere renheten til FAPer og MPs kulturer, immunostain med celletypespesifikke markører, inkludert PDGFRα (FAPs-markør), Pax-7 (muskelstamme [satellitt] cellemarkør), Fibroblast-spesifikt protein (FSP-1, fibroblastmarkør), Perilipin-1 (Plin-1, adipocyttmarkør), Kollagen type 1 (Kol1a1, indikator på fibrose), Myosin Heavy Chain (MHC, moden myocyttmarkør).
    1. For immunisering av nysorterte celler, sentrifuger 12-brønnsplaten ved 200 x g i 3 minutter ved romtemperatur for å lette overholdelse av celler til dekslene/brønnen. Dette trinnet er ikke nødvendig for langsiktige kulturer. Fjern kulturmedier.
    2. For immunstaining med FSP-1, fest celler med 1 ml 100% metanol (MeOH) i 2 min ved 4 °C. Hvis immunostaining for PDGFRα, Plin-1, Pax7 eller Col1a1, fikse cellekulturer med 1 ml 4% PFA i 1x PBS i 15 minutter ved romtemperatur. MHC immunostaining tolererer enten fixative.
      MERK: For metanolfaste celler hopper du over trinn 6.2 og går videre til trinn 6.3.
  2. Aspirer 4% PFA og vask raskt cellekulturer 3-4 ganger med 1x PBS. Tilsett 1 ml 100 mM Glycin i 1x PBS og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur for å inaktivere gjenværende PFA. Aspirer og vask 1-2 ganger med 1x PBS.
    MERK: Celler kan stå på dette stadiet i 2 ml 1x PBS, innpakket i klamfilm og lagret ved 4 °C i maksimalt 7-10 dager.
  3. Etter vask, tilsett 1 ml 0,1% Triton-X i 1x PBS og inkuber i 20 min for å permeabilisere cellemembraner.
  4. Vask brønner 2-3 ganger med 1-2 ml 1x PBS og blokker deretter celler med 1 ml 1x PBS + 3% BSA per brønn i 1 time ved romtemperatur.
  5. Pipette 80 μL primær antistoff fortynnet i 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 ryddig, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) på et stykke parafilm tapet til en mobil beholder. Bruk sterile fine tang, løft forsiktig dekslene ut av brønnen og snu på dråpen av antistoffoppløsning. Inkuber dekslerlip med to våte stykker papirhåndkle og dekkbeholder i plastfilm for å unngå fordampning av antistoffløsningen. Inkuber over natten ved 4 °C.
    MERK: Fargingsdeksler ut av brønnen bruker mindre antistoff (~80 μL) enn farging inne i brønnen (minimum 500 μL).
  6. På dag 2, la dekslerlips ved romtemperatur i 30 min å varme. Bruk tang forsiktig til høyre og overfør deksler tilbake til sine respektive brønner (celler vendt opp) og vask 2-3 ganger med 1-2 ml 1x PBS i 2 minutter hver for å fjerne så mye primært antistoff som mulig.
  7. Bruk samme fargingsteknikk som med primær antistofffarging, flekkceller med geit anti-kanin Alexa Fluor 488 sekundært antistoff (1:400) for å oppdage FSP-1, Plin-1, Col1a1 eller PDGFRα og geit antimus Alexa Fluor 555 sekundært antistoff (1:300) for å oppdage MHC eller Pax-7. Inkuber celler i 1 time ved romtemperatur og hold cellene beskyttet mot lys.
  8. Returner celler til brønnen og inkuber celler med Hoechst (1:10,000) i 2-4 min ved romtemperatur. Vask cellene ytterligere 2-3 ganger med 1x PBS i 2 minutter hver for å fjerne overflødig Hoechst.
  9. Monter deksler på glasssklier ved hjelp av et anti-fade fluorescerende monteringsmedium og la lysbildene tørke over natten i mørket ved romtemperatur. Oppbevar monterte deksler ved 4 °C i mørket.

7. Oljerød O (ORO) farging av kultiverte FAPer og MPs

  1. Utfør ORO-farging på ikke-permeabiliserte celler, da permeabilisering av cellemembranen kan føre til ikke-spesifikk / uønsket farging av ikke-adipogene celletyper. Før farging påbegynnes, klargjør du et ORO-arbeidslager (se Tilleggsfil for oppskriften) og inkuberer ved romtemperatur i 20 minutter.
  2. Etter 20 min, filtrer løsningen ved hjelp av et 0,2 μm filter for å fjerne uløste aggregater.
  3. Aspirere medier fra brønn og tilsett 1 ml 10% nøytral bufret formalin (10% NBF). Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
    MERK: Cellesamtid kan føre til løfting fra brønnen/dekslene. Vær forsiktig når du aspirerer / legger til løsninger.
  4. Aspirer og tilsett 1 ml frisk 10% NBF og inkuber i minst 1 time ved romtemperatur.
    MERK: Protokollen kan stoppes på dette tidspunktet, da celler kan bli liggende i 10% NBF over natten.
  5. Vask brønnene raskt en gang med 1 ml 60% isopropanol, deretter aspirer og la brønnene tørke helt (ca. 2 min).
  6. Tilsett 400 μL olje rød O arbeidslager per brønn og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur, og sørg for å unngå pipettering av ORO på platens vegger.
  7. Fjern all oljerød O og vask brønnen raskt 4 ganger med dH2O.
    MERK: Hvis fargede brønner inneholder deksler, monteres det med samme teknikk som beskrevet i trinn 6.9.
  8. Bildet enten monterte deksler eller den fargede brønnen ved hjelp av et brightfield-mikroskop.

8. Vevsfarging av kontralaterale og denerverte rotte gastrocnemius seksjoner

  1. Picrosirius Rød (PSR)
    1. Utfør PSR-farging på 5 μm-tykke, formalin-faste paraffin innebygd (FFPE) rotte gastrocnemius histologiske seksjoner som tidligere beskrevet40.
  2. Olje rød O (ORO)
    1. Fix 5 μm tykk isopentan-frossen rotte gastrocnemius histologiske seksjoner i 4% PFA i 10 min, inkuber i 60% isopropylalkohol i 1 min.
    2. Flekk med ORO arbeidslager i 12 min. Inkuber i 60% isopropylalkohol i 1 min, vask i 10 min i dH2O. Monter på deksler ved hjelp av et vannløselig monteringsmiddel.
  3. Sca-1 og lamininvev fluorescerende immunhiistokjemi (IHC)
    1. Utfør fluorescerende IHC på 5 μm tykke isopentanfrossen rotte gastrocnemius histologiske seksjoner.
    2. Hydrater prøver i 1x PBS i 5 min, fikse i 4% PFA i 10 min og inkuber deretter prøver i vev IF blokkeringsløsning (se Tilleggsfil) i 90 min.
    3. Inkuber med anti-Sca-1 primær antistoff (1:500) fortynnet i 1x PBS + 0,05% Tween ved 4 °C over natten.
    4. På dag 2, vask tre ganger i 1x PBS + 0,05% Tween i 5 min hver, og inkuber deretter i geit anti-kanin Alexa Fluor 555 (1:500) i 1 time.
    5. Vask igjen (som før), inkuber med blokkeringsløsning i 1 time, tilsett deretter anti-laminin primær antistoff (1:500) fortynnet i 1x PBS + 0,05% Tween i 1 time.
    6. Vask igjen (som før), og inkuber deretter i geit anti-kanin Alexa Fluor 488 (1:500) i 1 time (for laminin).
    7. Vask igjen (som før) og inkuber deretter i DAPI (1:10,000) i 4 min. Vask og monter på deksler med anti-fade monteringsmedium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifisere FAPer og MPs via flowcytometri ved hjelp av et nytt antistoffpanel, inkludert Sca-1 og VCAM-1
Gating strategien for å identifisere FAPs i rottemuskelen er basert på strømning cytometri protokoller i musen29, hvilken port på CD31 (endotelial) og CD45 (hematopoietiske) positive celler (kalt avstamning [Lin]) og undersøker fluorescerende profilen til FAPs markør Sca-1 og MPs markør ITGA7 fra linage-negativ (Lin-) populasjon. I mangel av kommersielt tilgjengelige, fluoroforkonjugerte og strømningscytometri-validerte antistoffer for rotte Sca-1 og ITGA7, konjugerte vi selv en rotte Sca-1::APC antistoff, og foretok en alternativ strategi for å identifisere parlamentsmedlemmene. Siden VCAM-1 nylig ble vist å være en effektiv enkelt positiv seleksjonsmarkør for isolering av rotte MPs33 og en rottespesifikk, konjugert, strømningscytometri-validert antistoff rettet mot VCAM-1 er tilgjengelig, brukte vi VCAM-1 for å identifisere MPs, i motsetning til ITGA7.

Vi bekreftet vellykket konjugering og ytelse av Sca-1: APC antistoff med enkel farging av kompensasjon perler og celle suspensjoner generert fra sunn rotte gastrocnemius (Figur 2A, B). En fempunkts titrering av Sca-1::APC (figur 2C) ble utført i tillegg til alle andre antistoffer (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) som brukes i protokollen (Tilleggs figur 1), for å identifisere de optimale konsentrasjonene. Ved hjelp av denne nye paneldesignen ble putative FAPer og MPs samtidig identifisert fra sunn gastrocnemius (figur 3), hvorved celler enkeltpositive for Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) ble utpekt faps (rød boks) og celler enkeltpositive for VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) ble utpekt som MPs (blå boks). Vi identifiserte også en populasjon av celler som var dobbelt positive for Sca-1 og VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) (Figur 3F; kvadrant øverst til høyre).

Validering av identifikasjon av FAPer og MPs etter FACS og cellekultur
For å validere protokollen presentert for strømning cytometrisk identifikasjon av FAPs og MPs i rotte skjelettmuskulatur, forsøkte vi å isolere levende celler for kultur in vitro. Ved hjelp av FACS ble levedyktige FAPer og MPs isolert ved hjelp av samme gatingstrategi som i strømningscytometrisk analyse. Omtrent 20.000-40.000 FAPs og 30.000-50.000 MPs ble samlet inn for cellekultur fra en enkelt gastrocnemius muskel fra en 230 g rotte.

For å bekrefte renheten til hver befolkning, var vi medimmuniserte nysorterte FAPer og parlamentsmedlemmer for PDGFRα og Pax7. PDGFRα er den andre mesenchymale stamcellemarkøren, foruten Sca-1, som vanligvis brukes til å identifisere FAPer2,7,8. Pax-7 er en anerkjent og mye brukt markør for muskelsatellittceller (stamme)41. Den sorterte populasjonen av FAPer viste positiv farging for PDGFRα uten forurensning av Pax7 positive celler (Figur 4A; øverste rad). Motsatt farget den sorterte populasjonen av MPs positivt for Pax7 med fravær av PDGFRα positive celler (Figur 4A; nederste rad), validerer evnen til Lin-/Sca-1+/VCAM-1- og Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ celleoverflateantigenprofiler for å isolere rene populasjoner av henholdsvis FAPs og MPs.

Vi dyrket deretter sorterte FAPs og MPs over et tidsforløp på 10-12 dager under forhold for å indusere adipogene, fibrogene og myogen differensiering. Ved dag 12 inneholdt FAPs kulturer utsatt for fettstoffer celler med enten en fibroblastlignende morfologi eller en flerlokulær morfologi som ligner på hvite pre-adipocytter med fettdråper (data ikke vist). Immunostaining for fibroblastspesifikt protein-1 (FSP-1) bekreftet fibroblastdifferensiering, mens farging for Plin-1 (Perilipin-1; en adipocyttmarkør)42 og Oljerød O bekreftet differensiering av adipocytter og tilstedeværelsen av nøytrale triglyserider og lipider , henholdsvis (Figur 4B). Fraværet av forurensende celler fra en myogen avstamning i FAPs kulturer ble bekreftet ved samtidig immunisering for myosin tung kjede (MHC), en markør for differensierte myocytter. FAPs kulturer utsatt for fibrogene differensiering (FD) ble vurdert for Kollagen type 1 (Col1a1) uttrykk, en av de viktigste FAPs-avledede kollagener8. Samtidig immunisering for Col1a1 og MHC på dag 11 avslørte robust kollagentype 1-uttrykk uten forurensende MHC-positive celler (figur 4B). Endelig bekreftelse på renheten til FAPs befolkning ble gjennomført ved å dyrke FAPs i myogene medier, for å oppmuntre til utvekst av eventuelle forurensende parlamentsmedlemmer. Ingen MHC-positive celler ble observert (Supplerende figur 2A).

MP-kulturer utsatt for myogene forhold demonstrerte MHC-uttrykkende modne myocytter og multi-nukleerte myotuber 12 dager etter plating (Figur 4C). Samtidig immunisering av MP-kulturene med FSP-1, og Plin-1 viste fraværet av henholdsvis forurensende fibroblaster eller adipocytter. Oro-farging viste heller ikke lipidforurensning (fig. 4C). Col1a1, som er sterkt uttrykt av fibroblaster, har også blitt rapportert å bli produsert i mindre grad av myogene forløpere og myoblaster, selv om det er motstridende data i litteraturen i denne forbindelse8,43,44. Mens co-immunisering av MPs med Col1a1 og MHC avslørte myocyttdifferensiering av vår MP-kultur, ble det ikke funnet bevis for Col1a1 immunopositivitet (Figur 4C). For ytterligere å bekrefte befolkningens renhet ble MP-kulturer utsatt for adipogene eller fibrogene forhold for å oppmuntre veksten av adipocytter og fibroblaster (Supplerende figur 2B). Ingen forurensende celler fra FAPs avstamning ble observert.

Mens vi hadde demonstrert evnen til å identifisere og sortere rene populasjoner av FAPs og MPs fra rottemuskelen, forsøkte vi deretter å bestemme identiteten til Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (dobbelt positive) celler. Siden Sca-1 uttrykk har blitt rapportert på en svært liten andel av MPs (ca. 3%) i sunn muskel45 og tilsvarende få FAPs (ca. 4%) har blitt rapportert å uttrykke VCAM-1 i sunn muskel10, immunostaining av ferskt sortert Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler ble utført for PDGFRα og Pax7 sammen med kultivering av dem i myogene, adipogene, og fibrogene tilstander for å indusere henholdsvis myogenese, adipogenese og fibrogenese. Det ble funnet at de dobbeltpositive cellene var en blandet populasjon av MPs og FAPs, med nysorterte celler immunostaining positivt for enten PDGFRα eller Pax7 (Supplementary Figure 3A) og kultivert celler som differensierer i modne myocytter, adipocytter eller fibroblaster (Supplementary Figure 3B,C).

ITGA7 vs VCAM-1 for å identifisere MPs under strømning cytometrisk FAPs identifikasjon
Mens en vellykket protokoll for flytcytometrisk identifisering av rotte-FAPer og MPs ved hjelp av henholdsvis Sca-1 og VCAM-1 ble etablert, forsøkte vi å avgjøre om et selvkonjugert ITGA7-antistoff på samme måte kunne brukes til å identifisere MPs i stedet for VCAM-1, som er standard i musen. Et rottespesifikk ITGA7-antistoff ble konjugert til PE-Cy7 (se Tilleggsfil) og antistoffets ytelse ble validert på kommersielle kompensasjonsperler og enkeltcelle suspensjoner generert fra rotte gastrocnemius (Supplementary Figure 4A-C). ITGA7::P E-Cy7-antistoffet ble utført tilstrekkelig på enkeltfargings- og FMO-eksperimenter (Tilleggs figur 4D). Men når full farging gastrocnemius celle suspensjoner med CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC, og ITGA7::P E-Cy7, en interaksjon ble tydelig mellom Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy-7 antistoffer. Etterfølgende kultur for både FACS-sorterte Lin-/Sca-1+/ITGA7-celler (påståtte FAPer) og Lin-/Sca-1-/IGTA7+-celler (påståtte MPs) (Tilleggsfigur 4E) hovedsakelig FAPer og med få MPs (Supplementary Figure 4F), noe som indikerer samspillet mellom Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy-7 antistoffer negativt påvirket spesifisiteten til celleidentifikasjon.

Et nytt FAPs-tidskurs i langvarig denervated skjelettmuskulatur
Som FAPs dynamikk har blitt vurdert i sammenheng med kortsiktig traumatisk denervasjon, i murine modeller11,38, forsøkte vi å validere ytelsen til vår metode for FAPs isolasjon fra både sunn og alvorlig atrofisk, fibrotisk muskel. Rotter ble utsatt for traumatisk langvarig denervasjonsskade ved hjelp av den godt validerte ensidige tibiale nervetranseksjonsmodellen46 med gastrocnemius muskel høstet på fire serielle tidspunkter over 14 uker etter denervasjon fra den denerverte lemmen og kontralateral innervated lem (for å tjene som en intern kontroll). Som tidligere rapportert, denervated muskel demonstrert progressiv atrofi (Figur 5A, B), med økende fibrose og fettavsetning ( Figur5C-F) over tid47.

Vår protokoll genererte et tilstrekkelig antall celler for strømningscytometrisk analyse, selv om 12 og 14 ukers denervated gastrocnemius veide ca. 0,2-0,3 g (15-20% av respektive kontralaterale kontrollmuskulatur) (Figur 5B). Vi observerte up-regulering av FAPs i denervated gastrocnemius muskel sammenlignet med den innervated kontralateral kontroll muskel, opprettholdt for 14 uker varigheten av eksperimentet (Figur 6A,B), konkordans med progressiv muskel fibrose og fett avsetning. Sca-1 immunostaining av muskel histologiske tverrsnitt bekreftet lokalisering av Sca-1 uttrykke celler til områder av fibro-fett endring i 14 ukers-denervated muskel (Figur 5G), i tillegg til baseline uttrykk i interstitium mellom myofibers i sunn muskel. En distinkt undergruppe av celler dukket opp i FAPs befolkning over tid etter denervasjon preget av en robust økning i Sca-1-signalet (Sca-1 høy; Figur 6A, rød boks) om strømningscytometrisk analyse, sammenlignet med FAPs basale Sca-1-uttrykk (Sca-1 Med/Low; Figur 6A, grønn boks). Kvantifisering av disse subpopulasjonene avslørte differensialdynamikk over tid; Sca-1 High FAPs økte betydelig ved 12- og 14-ukers post-denervation (Figur 6B), som består av omtrent halvparten av den totale FAPs befolkning (Figur 6C). Sca-1 Med/Low FAPs var derimot den dominerende subpopulasjonen ved 2- og 5-ukers post-denervasjon (figur 6C) og viste bare en forbigående økning i nivåer tidlig etter denervasjon (figur 6B).

I motsetning til vedvarende tilstedeværelse av FAPs i langsiktig denervated muskel, MPs demonstrerte en forventet bifasisk respons på denervation. I utgangspunktet økte parlamentsmedlemmene i denervated muskel over det som er sett i kontrolllemmen, men ved 5 uker etter denervasjon begynte befolkningen å avta (Figur 6D). I tråd med den velkjente utmattelse av muskel satellittcellepopulasjonen i langsiktig denervated muskel47, med 12 uker MPs var enten på eller under baseline nivåer post tibial nerve transeksjon.

Vi analyserte også dynamikken i Lin-/Sca-1+/VCAM-1+-populasjonen (Tilleggs figur 3D-E). Mens frekvensen av doble positive celler i forhold til Lin-populasjonen gradvis redusert i denervated muskel over tid, da absolutt celletallet ble bestemt per gram muskler, ble det observert en midlertidig økning i den doble positive befolkningen, før den falt til eller under baseline nivåer med 14 uker etter denervasjon.

Figure 1
Figur 1: Grafisk skjematisk for FAPer og MPs identifikasjon, isolasjon og kultur: Grafisk skjematisk som viser FAPer og MPs identifikasjon fra rotte gastrocnemius. Prøver høstes og mekanisk hakkes før de gjennomgår to sekvensielle enzymatiske fordøyelser. Vevspreparater behandles deretter og filtreres for å generere en enkelt celle suspensjon. En cocktail av fluorescerende konjugede antistoffer legges til hver prøve som deretter kjøres gjennom et strømningscytometer eller cellesortering for å identifisere eller isolere FAPer og MPs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sca-1::APC selvkonjugert antistoffvalidering og titrering. Validering av Sca-1::APC antistoff konjugering ved enkeltfarging på kommersielle kompensasjon perler (A) og encellede suspensjoner generert fra sunn rotte gastrocnemius muskel (B). Distinkte populasjoner av både Sca-1 merkede perler og celler er tydelige (svarte bokser). Antistofftitrering ble utført ved å teste fem forskjellige konsentrasjoner av Sca-1::APC på enkeltcelle suspensjoner (C); den optimale konsentrasjonen ble valgt basert på størst fluorescensintensitet med minimal bakgrunnsfarging og funnet å være partiavhengig. En representativ titrering vises med den batchspesifikke optimale konsentrasjonen angitt av den røde boksen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Strømningscytometriidentifikasjon av FAPer og parlamentsmedlemmer i rotte gastrocnemius. (A-F) Gating strategi for flow cytometrisk analyse av FAPs og MPs. (A) Prøver er først inngjerdet for å utelukke rusk (svart boks) samt å gate for å telle perler (rød boks). Celler blir deretter inngjerdet for å utelate dobler både etter frontspredning (FSC) (B) og sidespredningskarakteristikker (SSC) (C). Levedyktigheten til resulterende enkeltceller vurderes ved farging med SYTOX Blue (D). SYTOX Blå negative (levende) singler vurderes deretter for FITC-signal som identifiserer CD31 og CD45 (Avansering; Lin) for å utelukke Lin + brøker fra videre analyse (black box Lin-celler) (E). Lin-populasjonen vurderes deretter for Sca-1::APC versus VCAM-1::P E-signal (F). FAPer identifiseres som Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; rød boks) mens MPs identifiseres som Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ hendelser (F; blå boks). En Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ dobbeltpositiv populasjon er også tydelig (øvre høyre kvadrant). (G) FMO-kontroller (Fluorescence Minus One) for CD31::FITC og CD45::FITC viser riktig kompensasjon og gating for Lin-celler. (H-I) Sca-1::APC versus VCAM-1::P E-plott av FMO-kontroller viser riktig kompensasjon og gating for FAPer (Sca-1 FMO) og MPs (VCAM-1 FMO). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Sorterte FAPer og MPs cellekultur og immunstaining. (A) Samtidig immunisering for PDGFRα (grønn) og Pax7 (rød) på nysorterte FAPer (øverste rad) og MPs (nederste rad). Nuclei flekker blått med DAPI. FAPer uttrykker utelukkende PDGFRα og ingen Pax7 positive celler er tydelige, mens MPs utelukkende uttrykker Pax7 uten PDGFRα positiv celleforurensning, som demonstrerer renheten til begge sorterte populasjoner. (B) FAPer på dag 12 i adipogene differensieringsmedier (AD) flekker positivt for Fibroblast-spesifikke Protein 1 (FSP-1; grønn) og Perilipin-1 (Plin-1; grønn), som demonstrerer differensierte fibroblaster og adipocytter, henholdsvis. Nuclei er farget med DAPI (blå). Oljerød O (ORO) farging (rød) indikerer tilstedeværelsen av nøytrale triglyserider og lipider som oppstår fra modne adipocytter innen dag 12. FAPer utsatt for fibrogene differensieringsmedier (FD) demonstrerer uttrykk for FAPs-avledede Kollagentype 1 (Kol1a1; grønn). FAPs dyrket i enten adipogene eller fibrogene medier ikke co-immunostain for myosin tung kjede (MHC, rød), noe som indikerer fravær av forurensende myocytter. (C) MPs vokst i myogen differensiering media (MD) på dag 12 vise MHC positiv (rød) farging demonstrere tilstedeværelsen av modne myocytter og smeltet multinucleated myotubes. Nuclei er farget med DAPI (blå). MP-kulturer var fri for fibroblast- og adipocyttforurensning som indikert ved fravær av samtidig immunisering for FSP-1 (grønn), Plin-1 (grønn) og ORO-farging. MPs vokst på laminin for å imøtekomme Co1a1 immunostaining viser ikke samme grad av myotube fusjon ved dag 12 som oppstår på kollagen. Col1a1 (grønn) er fraværende fra MP-kulturer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Atrofi, fibrose og fettinfiltrasjon av langvarig denervated muskel. (A) Representant høstet gastrocnemius muskler på fire serielle tidspunkter etter denervasjon. Gastrocnemius betegnet CONTRA er en representativ kontralateral lemprøve fra et to ukers denervated dyr. (B) Kvantifisering av muskelatrofi etter denervasjon uttrykt som forholdet mellom denervated (DEN) gastrocnemius våtvekt til den kontralaterale (CONTRA) lemmen. (C) Picrosirius Red (PSR) farget histologiske tverrsnitt av gastrocnemius høstet 2 eller 14 uker etter denervasjon demonstrere progressiv fibrose. Muskel flekker gul, kollagen flekker rød. (D) Fibrose kvantifisert ved å bestemme området av PSR positivt vev i forhold til totalt vevsområde. (E) Oljerød O (ORO) farget tverrsnitt av gastrocnemius høstet 2- eller 14-ukers post-denervasjon, motfarget med hematoksylin. Lipider flekker rødt. (F) Fettinfiltrasjon kvantifisert ved å bestemme arealet av ORO farget vev i forhold til totalt vevsområde. (G) Gastrocnemius histologiske tverrsnitt høstet 2- eller 14-ukers post-denervation, immunostained for laminin (grønn) og Sca-1 (rød). Laminin flekker positivt basal lamina som omgir individuelle myofibers. Sca-1 identifiserer flere stamcelletyper. Nuclei er farget med DAPI (blå). Inset viser lokalisering av Sca-1+ celler utenfor basal lamina i sunn muskel; Gule piler angir tilstedeværelsen av Sca-1+ celler i fibrotiske områder. (Data er gjennomsnittlige +/- S.D; n=3 for 2 og 14 ukers tidspunkter. Data i panel B analysert av enveis ANOVA, data i paneler D og F analysert av toveis ANOVA. Post-hoc Sidaks test utført for å korrigere for flere sammenligninger. * = P<0,05 mellom CONTRA og DEN; # = P<0,05 mellom prøver) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: FAPs og MPs dynamikk i langsiktig denervated rotte gastrocnemius. (A) Representant Sca-1::APC versus VCAM-1::P E paneler av Lin- (CD31-/CD45-) populasjonen fra muskelprøver høstet 2-, 5-, 12- eller 14-ukers post-denervation. Øverste rad viser plott fra denervated (DEN) gastrocnemius, mens den nederste raden viser de fra den kontralaterale, uopererte (CONTRA) gastrocnemius. Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs (Total) er delt inn i Sca-1 High (red box) og Sca-1 Med/Low (green box) brøker, mens Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs vises i den blå boksen. (B) Kvantifisering av FAPs (Total, Sca-1 High, Sca-1 Med/Low) ved hvert tidspunkt etter denervasjon, rapportert som frekvensen (%) av Lin-celler (øverste rad) og antall celler per gram muskel (nederste rad) normalisert til kontralateral kontroll gastrocnemius. (C) Relative proporsjoner av Sca-1 High og Sca-1 Med/Low subpopulations av den totale FAPs befolkning. (D) Kvantifisering av MPs ved hvert tidspunkt post-denervation rapportert som frekvensen (%) av Lin-celler (venstre graf) og som antall celler per gram muskel (høyre graf) normalisert til kontralateral kontroll. (Data er gjennomsnittlige +/- S.D; n=4 for 2 og 12 ukers tidspunkter; n=5 for 5 ukers tidspunkt; n=2 for 14 ukers tidspunkt. Data analysert av enveis ANOVA; Post-hoc Sidaks test for å korrigere for flere sammenligninger. # = P<0,05.) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Antistoffvalidering og titrering. Validering av CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) og VCAM-1::P E (G-I) kommersielt konjugede antistoffer på kompensasjonsperler (A,D,G) og encellede suspensjoner fra sunn rotte gastrocnemius muskel (B, E, H). Hvert antistoff ble titrert ved 5 forskjellige konsentrasjoner (C, F, I). Den optimale konsentrasjonen ble valgt basert på størst fluorescensintensitet med minimal bakgrunnsfarging (røde bokser). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Sorterte FAPer og parlamentsmedlemmer i omvendte differensieringskulturforhold. (A) FAPer dyrket i myogene differensieringsmedier (MD) på dag 12 co-immunostained for FSP-1 (grønn), Plin-1 (grønn) eller Col1a1 (grønn) og MHC (rød) viser ikke myocyttforurensning. Positiv FSP-1, og Col1a1 farging avslører FAPs differensiering til fibroblaster. ORO farging (rød) avslører lipidproduksjon selv om Plin-1 positive adipocytter ikke er lett synlige. Nuclei farget med DAPI (blå). (B) MPs utsatt for adipogene differensieringsmedier døde. MPs dyrket i FAP Growth Media (FAP GM) i 12 dager og co-immunostained for FSP-1 (grønn) eller Plin-1 (grønn) og MHC (rød) demonstrere differensierte myocytter og myotuber med fravær av FSP-1 eller Plin-1 positive celler. Fraværet av ORO-farging bekrefter videre mangelen på adipogene celler i kulturen. MPs vokst i fibrogene differensieringsmedier (FD) og co-immunostained for Col1a1 og MHC viser modne myocytter og fravær av Col1a1 positive celler. MPs vokst på laminin for å imøtekomme Col1a1 immunostaining viser ikke samme grad av fusjon til myotubes på 12 dager i kultur som oppstår på kollagen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler er en blandetpopulasjon av FAPs og MPs. (A) PDGFRα og Pax7 co-immunostaining av nyisolerte Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler viser en blandet populasjon av PDGFRα single positive (hvite piler) og Pax7 single positive (gul pil) celler som identifiserer FAPs og MPs, henholdsvis. (B) Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ kulturer på dag 12 dyrket i myogene differensieringsmedier (MD) inneholder henholdsvis FSP-1 enkeltpositive (grønne) og MHC-enkeltpositive (røde) celler som identifiserer fibroblaster og myocytter/rør. Fravær av Plin-1 (grønn) og ORO (rød) farging indikerer fraværet av modne adipocytter. Co-immunostaining for Col1a1 (grønn) og MHC (rød) viser modne myocytter og fibroblaster. (C) Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler på dag 12 dyrket i adipogene differensieringsmedier (AD) viser på samme måte en blanding av FSP-1 (grønn) enkeltpositiv og MHC (rød) enkeltpositive celler, men også med Plin-1 (grønn) enkeltpositive celler og ORO farging til stede, som bekrefter differensiering av fibroblaster, myocytter og adipocytter. Kulturer dyrket i fibrogene differensieringsmedier (FD) viser modne myocytter og Col1a1 enkeltpositive celler (fibroblaster). (D) Representative Sca-1::APC versus VCAM-1::P E paneler av Lin- (CD31-/CD45-) populasjonen fra denerverte muskelprøver høstet 2-, 5-, 12- eller 14-ukers post-denervasjon; Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ populasjon er angitt i den lilla boksen. (E) Kvantifisering av Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler over fire serielle tidspunkter etter denervasjon, rapportert som frekvensen av Lin-celler (venstre graf) og celler per gram muskel (høyre graf) normalisert til den kontralaterale gastrocnemius. (Data er gjennomsnittlige +/- S.D; n=4 for 2 og 12 ukers tidspunkter; n=5 for 5 ukers tidspunkt; n=2 for 14 ukers tidspunkt. Data ble analysert av enveis ANOVA; post-hoc Sidaks test for å korrigere for flere sammenligninger; # = P<0,05.) Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4: ITGA7 som markør for myogene celler i strømningscytometri av rotte skjelettmuskulatur. Validering av ITGA7::P E-Cy7 antistoffkonjugering ved enkeltfarging på kommersielle kompensasjonsperler (A) og enkeltcelle suspensjoner generert fra sunn rotte gastrocnemius muskel (B). Populasjoner av både ITGA7-merkede perler og celler er tydelige (svarte bokser) (C) Antistofftitrering ble utført ved å teste fem forskjellige konsentrasjoner på enkeltcelle suspensjoner. Rød boks indikerer ideell konsentrasjon. (D) Plott av fluorescens Minus En (FMO) kontroller demonstrerer fraværet av fluorescens spillover over antistoff konjugater, men full flekk av celle suspensjoner avslører en ikke-spesifikk interaksjon mellom Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy7 (grønn boks). Gating (E) for å skille Lin-/Sca-1+/ITGA7-celler (påståtte "FAPer") og Lin-/Sca-1-/IGTA7+-celler (påståtte "MPs"). (F) Samtidig immunisering av FACS-sorterte cellekulturer etter 12 dager etter plating med Perilipin-1 (grønn) og MHC (rød) demonstrerer begge gruppene av sorterte celler modnet overveiende til adipocytter med få myocytter til stede. Klikk her for å laste ned denne filen.

1. Ikke arrestert
2. Levedyktighetskontroll
3. CD31 + CD45 FMO
4. Sca-1 FMO
5. VCAM-1 FMO
6. CD31 + CD45 enkel flekk (perler)
7. CD31 + CD45 enkel flekk (celler)
8. Sca-1 enkel flekk (perler)
9. Sca-1 Enkel flekk (celler)
10. VCAM-1 Enkel flekk (perler)
11. VCAM-1 Enkel flekk (celler)

Tabell 1: Strømningssytometri antistofffargingskontroller. Fullt komplement av antistofffargingskontroller. Hvis eksperimentet utføres for første gang, bør enkeltfargede kontroller kjøres på både kompensasjonsperler og enkeltcelle suspensjoner. For alle påfølgende eksperimenter trenger enkeltfargede kontroller bare å kjøres på kompensasjonsperler.

CD31::FITC (μg) CD45::FITC (μg) Sca-1::APC (μg)* VCAM-1::P E (μg) SYTOX Blå
(μM; Endelig konsentrasjon)
Ubegrunnet kontroll
-- -- -- -- --
Kontroller med én farge
SYTOX blå (levedyktighetskontroll) -- -- -- -- 1
CD31 OG CD45 0.5 0.25 -- -- 1
Sca-1 -- -- 0.25 -- 1
VCAM-1 -- -- -- 0.25 1
Fluorescens minus én (FMO)
CD31 OG CD45 -- -- 0.25 0.25 1
Sca-1 0.5 0.25 -- 0.25 1
VCAM-1 0.5 0.25 0.25 -- 1
Eksperimentelle prøver
Full flekk 0.5 0.25 0.25 0.25 1

Tabell 2: Flow cytometri antistoff farging matrise. Antistoffmengden for farging av eksperimentelle og kontrollprøver for strømningscytometri er vist. All farging utføres i et totalt volum på 100 μL vaskebuffer. *Den optimale mengden selvkonjugert Sca-1::APC-antistoff kan variere avhengig av batch som brukes. Alle nykonjugerte Sca-1::APC-partier bør først valideres ved å enkeltflekke både kompensasjonsperler og enkeltcellefjæringer.

Tilleggsfil: Reagensoppskrifter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En optimalisert, validert FAPs isolasjonsprotokoll for rottemuskel er avgjørende for forskere som ønsker å studere skademodeller som ikke er gjennomførbare i musen av biologiske eller tekniske årsaker. For eksempel er mus ikke en optimal dyremodell for å studere kroniske lokale eller nevrodegenerative skader som langvarig denervasjon. Biologisk sett gjør den korte levetiden og rask aldring av mus det vanskelig å nøyaktig avgrense muskelsequalaen på grunn av denervasjon fra den forvirrende faktoren for aldring. Fra et teknisk synspunkt vil den drastisk reduserte muskelmassen på grunn av alvorlig atrofi være utilstrekkelig for effektiv strømningscytometrisk analyse. Faktisk foreslår mus FAPs isolasjonsprotokoller gruppering av sunne muskler sammen for bedre å øke utbyttet av sorterte FAPer29. Selv om dette løser den tekniske barrieren for å oppnå tilstrekkelig muskelvev for analyse, begrenser det samtidig forskere fra å vurdere FAPer på et muskelspeifikt nivå. Siden spesifikke muskelgrupper varierer iboende i deres fibertypesammensetning, forhindrer grad av vaskularisering og mitokondrietall47 for eksempel, kombinere flere forskjellige muskler for strømningscytometrisk analyse muskelspesifikk FAPs karakterisering. I motsetning viser vi at både sunn og langsiktig denervated, atrofisk og fibrotisk rotte gastrocnemius gir en tilstrekkelig mengde startmateriale for effektiv strømningscytometri. Videre, i sunne prøver, kan overskuddet av muskler videre deles inn for flere nedstrømsanalyser, slik at forskere samtidig kan analysere de cellulære, molekylære og histologiske egenskapene til samme vev. Til slutt, for eksperimenter som manipulerer FAPs i skademodeller med terapeutiske, er godt validerte analyser av fysisk funksjon og gang i beredskap og aktive rotter tilgjengelig21,22,23,24, noe som muliggjør seriell vurdering av muskelfunksjon uten behov for avslutning av dyret.

Et viktig hinder for å lage en optimalisert FAPs isolasjonsprotokoll for rotten var antistofftilgjengelighet. Vår første tilnærming forsøkte å kopiere antistoffpanelet og gating strategiprotokoller som er mye brukt i musen1,7,8,9,10,11,12,13,14. Mens kommersielt tilgjengelige, konjugerte, strømningscytometritestede og validerte antistoffer som gjenkjenner rotte var tilgjengelige for avstamningsmarkørene CD31 og CD45, eksisterte ingen for positive FAPer som identifiserte markører Sca-1 eller PDGFRα, samt for den negative utvalgsmarkøren ITGA7. Ukonjugert, primære antistoffer som er spesifikke for disse markørene og angivelig å være effektive i strømningscytometri var tilgjengelige, men av FAPs markører Sca-1 og PDGFRα var bare Sca-1-antistoffet validert i den publiserte litteraturen i strømningscytometrisk analyse av rotteceller48. Vi valgte derfor Sca-1 som den positive utvalgsmarkøren for FAPer. Utsiktene til å bruke sekundære antistoffer for å avgrense Sca-1- og ITGA7-markører var ikke mulig av flere grunner, men først og fremst fordi de eneste rottespesifikke antistoffene for Sca-1 og ITGA7 validert for strømningscytometri ble generert i samme vertsart. Derfor var det gjenværende alternativet selvkonjugering av begge antistoffene ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett.

Prosessen med å velge et optimalt sett for antistoffkonjugering var omfattende, da mange sett er helt eller delvis intolerante mot ulike bufferdluenter (f.eks. Glycin, Glycerol, BSA, Sodium Azide) tilstede i primære antistoffer. I tillegg må fluoroforen som følger med være kompatibel med laserne som er utstyrt innenfor strømningscytometeret / cellesorteringen som er tilgjengelig for undersøkeren, og ikke avgi ved en lignende bølgelengde som andre fluoroforer som brukes til å identifisere andre celletyper i prøven. Tilstedeværelsen av fortynningskomponenter i rottespesifikke PDGFRα primære antistoffer som var dårlig kompatible med konjugeringssettene, var en ekstra vurdering i valget av Sca-1 som den positive FAPs utvalgsmarkøren i denne protokollen. Mens disse resultatene viser at både Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy7 konjugering resulterte i identifisering av distinkte positive fargede populasjoner på både kompensasjonsperler og celler, ble førstnevnte funnet å vise forfall i fluorescens tidligere enn det som ble annonsert av produsenten. Det anbefales på det sterkeste at forskere maner frem Sca-1::APC i henhold til produsentens instruksjoner, umiddelbart før første gangs bruk (f.eks. dagen før eksperimentet) for å sikre robust signal, planlegge eksperimenter tilsvarende slik at en enkelt batch av konjugert antistoff kan brukes i antistoffets effektivitetsvindu, og validere hver batch ved enkeltflekkende kompensasjonsperler og titrering på enkeltcelles suspensjoner. Enda viktigere er det at den kritiske interaksjonen mellom Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy7 forhindret den nøyaktige avgrensningen av populasjoner av FAPer vs. MPs, noe som krevde en alternativ strategi.

Boscolo Sesillo et al. viste nylig vellykket strømning cytometrisk isolasjon av rottemuskel stamceller ved hjelp av VCAM-1 som en enkelt positiv utvalgsmarkør33 i CD31, CD45 og CD11b negative celler. Med VCAM-1 som MP-utvalgsmarkør brukte vi et nytt antistoffpanel for å identifisere FAPer (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) og MPs (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) og validerte tilnærmingen med in vitrokultur av FACS-sorterte celler fra sunn gastrocnemiusmuskel. Nyisolerte FAPs og MPs immunostained utelukkende for sine respektive alternative markører PDGFRα og Pax7. Kultiverte FAP-er differensiert i populasjoner av modne fibroblaster og adipocytter, og parlamentsmedlemmer i modne myocytter/myotuber. Ingen krysskontaminering av FAPs og parlamentsmedlemmer i kulturene skjedde. Immunstaining av histologiske tverrsnitt bekreftet infiltrasjon av områder med fibro-fett nedbrytning i denervated muskel med Sca-1 positive celler.

Mens vi foretok strømningscytometrisk analyse av langsiktig denervated muskel for å validere vår protokoll i alvorlig atrofisk, fibrotisk og fett-infiltrert muskel, observerte vi tilfeldigvis fremveksten av en FAPs sub-befolkning med økt Sca-1-signal (betegnet Sca-1 High) sammenlignet med baseline Sca-1-uttrykket (betegnet Sca-1 Med / Low) over tid. Sca-1 High FAPs økte betydelig sen post-denervation (12 uker pluss), mens Sca-1 Med / Low FAPs nådde tidlig på 5 uker før de falt tilbake til baseline nivåer. Heterogenitet i FAPs fenotype er rapportert10,30. FAPer med høyere Sca-1-uttrykk ble vist å skille lettere inn i adipocytter, og når de ble utsatt for fibrogene stimulering økte uttrykket av Col1a130,49. Dynamikken i FAPs underpopulasjoner observert her synes å være i tråd med tidsforløpet for denervasjonsindusert oppfølger og muskelens regenerative kapasitet47 og kan dermed karakterisere FAPs underpopulasjoner med forskjellige cellulære programmer. Sca-1 High FAPs blir oppregulert på sen tid-punkter samtidig med fibro / fett infiltrasjon og en nedgang i regenerativ potensial, mens Sca-1 Med / Low FAPs blir up-regulert under muskelens regenerative vindu og kan hjelpe til med effektiv regenerativ myogenese. FAPs isolasjonsprotokoll presentert her gir undersøkere muligheten til å identifisere og isolere disse ulike populasjonene for fremtidig studie.

Vi identifiserte en populasjon av celler som farget positivt for både Sca-1 og VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) og konstaterte at denne doble positive befolkningen var en blanding av FAPs og MPs. Separasjon av denne populasjonen ved hjelp av en tredje markør - ITGA7 - var ikke mulig på grunn av samspillet mellom Sca-1 og ITGA7 primære antistoffer. Malecova og kolleger rapporterte en underpopulasjon av VCAM-1 som uttrykte FAPs som er nesten fraværende i sunn muskel, midlertidig økt med akutt betennelse, og deres utholdenhet hos mdx mus (modell av muskeldystrofi) var forbundet med kronisk muskelbetennelse og fibrose10. Derimot, og selv om det ikke var en ren FAPs befolkning, fant vi at Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ populasjonen gikk ned til eller under baseline nivåer med kronisk muskelfibrose ved 12- og 14-ukers post-denervation. Denervation induserer ikke den samme inflammatoriske reaksjonen og sykling regenereringsforsøk opplevd av mdx mus, noe som kan forklare forskjellene i våre resultater. Vår identifikasjon av MPs i Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+ cellepopulasjonen er i tråd med rapporten om Sca-1-uttrykk om en svært liten andel MPs i sunn muskel, med en forbigående økning etter skade under myoblastproliferasjon og påfølgende tilbaketrekking fra cellesyklusen45. Således, mens vår antistoffmerking og FACS gating strategi vellykket isolerer rene populasjoner av FAPs og MPs for studier, eksperimenter som krever strømning cytometri-basert kvantifisering av disse populasjonene kan litt undervurdere sine tall på grunn av den lille prosentandelen av celler i begge forfedre linjer som co-express Sca-1 og VCAM-1. Uansett viser den nåværende protokollen tydelig den klassiske bifasiske responsen til MPs til denervasjonsskade, med kortsiktig oppregulering og påfølgende uttømming av befolkningen i langvarig denervated muskel. Tilsvarende er økningen i FAPer rapportert i isolert kortsiktig fortettingsskade rekapitulert her, og vist seg å bli ytterligere opprettholdt ved hjelp av den langsiktige tibial nervetranseksjonsmodellen.

Oppsummert gir denne protokollen forskere et tidligere uutforsket dyr, rotten, der man kan bruke strømningscytometriske metoder for samtidig å studere FAPs og MPs. Eksperimenter i mus begrenset av mengde skjelettmuskulatur, og det hyppige behovet for å gjennomføre terminale eksperimenter for å vurdere muskelstyrke og funksjon, kan lett utføres i større rotte og med et mer omfattende utvalg av ikke-dødelige styrke- og funksjonsvurderingsmetoder. Samlet sett kan FAPs studier på rotten avdekke nye roller i denne viktige stamcellepopulasjonen i akutte og kroniske muskel- og perifere nervetraumer og sykdom, og dermed øke potensialet for å utvikle cellespesifikke terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil takke Flow cytometry Core Facilities ved University of Ottawa og Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto for deres ekspertise og veiledning i optimalisering av flow cytometri / FACS-protokollen presentert i dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) til JB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson --
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson --
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson --
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter --
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Tags

Biologi Utgave 172 mesenchymale forfedre fibro-adipogene forfedre myogene forfedre strømningscytometri fluorescensaktivert cellesortering FACS skjelettmuskulatur kronisk traumatisk denervasjon rotte muskelatrofi fibrose
Identifisering, isolasjon og karakterisering av Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) og Myogenic Progenitors (MPs) i skjelettmuskulaturen i rotten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa,… More

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter