Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Identifikation, isolation og karakterisering af fibro-adipogenic stamfaderer (FAPs) og myogene forfædre (parlamentsmedlemmer) i skeletmuskulatur i rotten

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/61750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol skitserer en metode til at isolere Fibro-adipogenic forfædre (FAPs) og myogene forfædre (parlamentsmedlemmer) fra rotte skeletmuskulatur. Udnyttelse af rotten i muskelskade modeller giver øget væv tilgængelighed fra atrofisk muskel til analysen og et større repertoire af validerede metoder til at vurdere muskelstyrke og gangart i frit bevægende dyr.

Abstract

Fibro-adipogenic Forfædre (FAPs) er hjemmehørende interstitielle celler i skeletmuskulatur, der sammen med myogene forfædre (parlamentsmedlemmer), spiller en central rolle i muskel homeostase, skade, og reparation. De nuværende protokoller for FAPs-identifikation og isolationsbrugsstrømcytometri/fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og undersøgelser, der evaluerer deres funktion in vivo til dato, er udelukkende blevet udført hos mus. Den større iboende størrelse af rotten giver mulighed for en mere omfattende analyse af FAPs i skeletmuskulatur skade modeller, især i alvorligt atrofisk muskel, eller når efterforskere kræver betydelig vævsmasse til at foretage flere downstream assays. Rotten giver desuden et større udvalg af muskelfunktionelle analyser, der ikke kræver dyresedation eller -offer, hvilket minimerer sygelighed og dyrebrug ved at muliggøre serielle vurderinger. Flowcytometri/FACS-protokollerne, der er optimeret til mus, er artsspecifikke, navnlig begrænset af egenskaberne ved kommercielt tilgængelige antistoffer. De er ikke blevet optimeret til at adskille FAPs fra rotte eller meget fibrotisk muskel. En flowcytometri / FACS protokol til identifikation og isolering af FAPs og parlamentsmedlemmer fra både sunde og denervated rotte skeletmuskulatur blev udviklet, bygger på differentieret udtryk for overflade markører CD31, CD45, Sca-1, og VCAM-1. Da rottespecifikke, flowcytometri validerede primære antistoffer er stærkt begrænsede, blev der udført intern bøjning af antistoffet rettet mod Sca-1. Ved hjælp af denne protokol blev vellykket Sca-1-bøjning bekræftet, og flowcytometrisk identifikation af FAPs og parlamentsmedlemmer blev valideret af cellekultur og immunstainning af FACS-isolerede FAPs og parlamentsmedlemmer. Endelig rapporterer vi en ny FAPs-tidsforløb i en langvarig (14 uger) rottebenenemodel. Denne metode giver efterforskerne mulighed for at studere FAPs i en ny dyremodel.

Introduction

Fibro-adipogenic stamfader celler (FAPs) er en population af hjemmehørende multipotent stamfader celler i skeletmuskulatur, der spiller en afgørende rolle i muskel homøostase, reparation, og regenerering, og omvendt også mægle patologiske reaktioner på muskelskade. Som navnet antyder, blev FAPs oprindeligt identificeret som en stamfader befolkning med potentiale til at differentiere sig til fibroblaster og adipocytter1 og blev foregav at være de vigtigste mæglere af fibro-fedt infiltration af skeletmuskulatur i kronisk skade og sygdom. Yderligere undersøgelse viste, at FAPs desuden er i stand til osteogenese og chondrogenesis2,3,4. Således er de mere bredt noteret i litteraturen som mesenkymale eller stromale forfædre3,5,6,7,8. I akut skeletmuskulaturskade hjælper FAPs indirekte med regenerativ myogenese ved forbigående at sprede sig for at give et gunstigt miljø for aktiverede muskelsatellitceller og deres downstream myogene stamfader (parlamentsmedlemmer) modstykker1,9,10. Parallelt med vellykket regenerering gennemgår FAP'er apoptose og returnerer deres tal til basisniveau1,9,10,11. I modsætning hertil tilsidesætter FAPs proapptotiske signaler i kronisk muskelskade, hvilket resulterer i deres persistens9,10,11 og unormal muskelreparation.

In vivo-undersøgelser , der evaluerer de cellulære og molekylære mekanismer , hvormed FAPs formidler muskelreaktioner, har udnyttet skumle dyremodeller til dato1,7,9,10,11,12,13,14. Mens genetisk manipulerede mus er kraftfulde værktøjer til brug i disse analyser, begrænser dyrets lille størrelse vævstilgængeligheden til undersøgelse i langsigtede lokaliserede skadesmodeller, hvor muskelatrofi kan være dyb, såsom traumatisk denervation. Desuden kræver måling af muskelstyrke og fysisk funktion ex vivo- eller in situ-målinger, der nødvendiggør afslutning af musen eller in vivo-metoder, der kræver operation og/eller en generel bedøvelse for at muliggøre evaluering af muskelkontraktile præstationer15,16,17,18,19,20 . Hos rotter findes godt validerede og globalt anvendte muskelfunktionelle analyser, ud over analyser for mere komplekse motoriske adfærd som ganganalyse (f.eks. Iskiasfunktionsindeks, CatWalk-analyse) og udføres hos vågne og spontant bevægende dyr21,22,23,24 . Dette optimerer desuden principperne om minimal sygelighed i dyreforsøg og antallet af anvendte forskningsdyr. Rotten giver dermed FAPs investigator den ekstra fleksibilitet af større skadet muskelvolumen til protein- og cellulære analyser og evnen til at foretage serievurderinger af muskelkompleks statisk og dynamisk funktionel aktivitet og adfærd i det opmærksomme dyr.

FAPs er primært blevet identificeret og isoleret fra hele muskelprøver ved hjælp af flowcytometri og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Disse er laserbaserede analyser, der er i stand til at identificere flere specifikke cellepopulationer baseret på karakteristiske træk som størrelse, granularitet og en bestemt kombination af celleoverflade eller intracellulære markører25. Dette er meget fordelagtigt i studiet af et organsystem som skeletmuskulatur, da homøostase og regenerering er komplekse, multifaktorielle processer koordineret af en overflod af celletyper. En skelsættende undersøgelse identificeret FAPs, samt parlamentsmedlemmer, ved hjælp af flow cytometriske metoder i musen skeletmuskulatur1. De viste, at FAPs er mesenkymal karakter, da de manglede overfladeantigener, der er specifikke for celler fra endotel (CD31), hæmatopoietisk (CD45) eller myogen (Integrin-α7 [ITGA7]) oprindelse, men udtrykte den mesenkymale stamcellemarkør Sca-1 (Stamcelleantigen 1)1 og differentierede sig til fibrogene og adipogenic celler i kultur. Andre undersøgelser viste vellykket isolering af mesenchymale forfædre i muskler baseret på udtrykket af en alternativ stamcellemarkør, blodplade-afledt vækstfaktor receptor alpha (PDGFRα)2,7,8 og yderligere analyse viste disse sandsynligvis vil være den samme celle befolkning som FAPs3. FAPs er nu almindeligt identificeret i flowcytometri ved hjælp af enten Sca-1 eller PDGFRα som et positivt valgmærke1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Brugen af PDGFRα er præference for humant væv dog, som en direkte menneskelig homolog af murine Sca-1 er endnu ikke identificeret32. Derudover er andre celleoverfladeproteiner blevet rapporteret som markører for parlamentsmedlemmer (f.eks. VCAM-1), hvilket giver et potentielt alternativ til ITGA7 som indikator for celler af myogen afstamning under FAPs isolation33.

Mens flowcytometri/FACS er en kraftfuld metode til at studere FAPs rolle og patogene potentiale i skeletmuskulatur1,9,10,11,13,29, er den teknisk begrænset af specificiteten og optimeringen af de krævede reagenser. Da flowcytometrisk identifikation og isolering af FAPs er blevet udviklet og udført i musedyrmodeller1,9,10,11,29, giver det udfordringer for forskere, der ønsker at studere FAPs i andre modelorganismer. Mange faktorer - såsom optimal vævsstørrelse, der skal behandles, samt reagens og / eller antistof specificitet og tilgængelighed - varierer afhængigt af de anvendte arter.

Ud over de tekniske hindringer for at studere FAPs i en ny dyremodel er de stort set blevet undersøgt i akutte, giftige omgivelser - normalt via intramuskulær kemisk injektion eller kardiotoksin. Evaluering af den langsigtede dynamik i FAPs er begrænset primært til vurdering i Duchenne's muskelsvind, ved hjælp af mdx mus model9,10,11, og modeller af kombination muskel skade såsom massive rotator cuff tåre, hvor samtidig sene transection og denervation udføres på skulder muskulatur26,27,28 . Reaktionen af FAPs til den eneste fornærmelse af kronisk traumatisk denervation, en almindelig forekomst i arbejdsulykker i tung industri, landbrug og i fødselstraumer (brachial plexus skade)34,35,36,37 med betydelig sygelighed, har ikke været så godt karakteriseret, ofte begrænset til en kortsigtet tidsramme11,38.

Vi beskriver en metode til at identificere og isolere FAPs og parlamentsmedlemmer fra sunde såvel som alvorligt attrofiske og fibrotiske skeletmuskulatur i rotten. For det første demonstreres identifikation af CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs og CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ parlamentsmedlemmer ved hjælp af en væv fordøjelse og flow cytometri farvning protokol og efterfølgende validering af vores resultater udføres gennem kultur og immunocytokemisk farvning af FACS-isolerede celler. Ved hjælp af denne metode rapporterer vi også et nyt FAPs-forløb i en langsigtet isoleret denervationsskademodel i rotten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Efterforskere, der gennemfører denne protokol, skal have tilladelse fra deres lokale dyreetiske råd /plejeudvalg. Alt dyrearbejde blev godkendt af St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC # 918) og blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af det canadiske råd for dyrepleje (CCAC). Der vises et skema over flowcytometriprotokollen i figur 1. Hvis downstream-applikationen er FACS og efterfølgende cellekultur, skal alle trin udføres med korrekt aseptisk teknik.

1. Muskelhøst

  1. Bedøve rotter ved hjælp af en passende bedøvelse og offer i henhold til lokale vivarium og dyr etiske bestyrelse retningslinjer. Denne protokol høster gastrocnemius muskel fra voksne kvindelige Lewis rotter (200-250 g), som et eksempel. Rotter blev bedøvet ved hjælp af 2-3% Isoflurane og blev ofret ved intracardiac injektion af T61.
  2. Når dyret er blevet ofret, barber hele hindlimb for at lette placeringen af musklen og minimere pelsforurening af det høstede væv.
  3. Ved hjælp af en steril skalpel, lav to snit i huden: den første omkring omkredsen af ankelleddet og den anden op midterlinjen af det mediale aspekt af baglimb fra anklen til hoften.
  4. Skræl tilbage huden og overfladiske muskellag til at afsløre den underliggende gastrocnemius, som stammer fra mediale og laterale condyles af lårbenet og indsætter på akillessene.
  5. Brug stump dissektion til at adskille gastrocnemius fra det omgivende væv, håndtering af musklen kun ved senen for at undgå knuse skade.
  6. Adskil gastrocnemius fra dens indsættelse ved at transecting akillessene så distally som muligt med skarp saks. Når den er skåret, skal du gribe akillessenen med sammentrækninger og forsigtigt skrælle gastrocnemiusen af underlagsknolen. Stadig holder musklen med sammentværninger i den ene hånd, lokalisere gastrocnemius 'to oprindelse og skære på mediale og laterale lårben kondyles.
  7. Blot den udskårne gastrocnemius forsigtigt mod et sterilt stykke gaze for at fjerne så meget blod som muligt. Trim musklen på en steril overflade og fjern overskydende bindevæv samt akillessene.
  8. Placer muskler i en vejebåd og veje ved hjælp af en præcision skala. Denne protokol er optimeret til at fordøje muskler med en våd vægt fra 200-600 mg. Operatørerne kan opdele overskydende høstet væv til andre downstream-analyser, hvis det ønskes.
  9. Del forsigtigt de høstede muskler yderligere, der skal anvendes til flowcytometri, i 3-4 mindre stykker (ca. 1-2 cm3) og nedsænkes i iskold 1x PBS. Hold koldt på is, indtil alle prøver er høstet.

2. Muskel fordøjelse

  1. Fjern muskler fra PBS og sted i en steril 10 cm cellekultur skål. Riv forsigtigt og hakkevæv med sammenkrerne, indtil stykkerne er ca. 3-4 mm3, og fjern så meget bindevæv som muligt. Når det er grundigt hakket, overføres til et sterilt 50 mL konisk rør, der indeholder 6 mL DMEM + 1% penicillin/streptomycin (P/S).
  2. Der tilsættes 10 μL 300 mM CaCl2-opløsning til 365 μL collagenase II-opløsning (lagerkoncentration 4800 U/mL) for at aktivere kollagenaseenzymet. Den aktiverede kollagen II-opløsning til det 50 mL koniske rør, der indeholder vævsslammet. Den endelige Collagenase II koncentration er 250 U/mL.
  3. Inkuber rør i en shaker i 1 time ved 37 °C, 240 x g, sørg for manuelt at hvirvle hvert 15. minut for at løsne væv, der har klæbet til siden af røret.
  4. Efter 1 time fjernes rørene fra shakeren, og følgende pr. prøve tilsættes: 100 μL collagenase II (4.800 U/mL) og 50 μL Dispase (4,8 U/mL).
  5. Pipetteprøver ved hjælp af en serologisk pipette 15-20 gange, indtil opløsningen er homogen. Hvis du behandler flere prøver, skal du bruge en separat steril pipette til hver prøve for at undgå krydskontaminering af prøver.
  6. Inkuberes igen i en shaker i 30 min ved 37 °C og 240 x g. Efter 15 min, ryste prøver i hånden for at løsne klæbende væv fra siden af røret.

3. Generering af enkeltcelleophæng

  1. Skær langsomt prøver gennem en 10 mL sprøjte med en 20 G nål i 10 cyklusser.
    BEMÆRK: En cyklus indebærer at optage muskelopløsning i sprøjten og injicere den tilbage i røret. Sørg for at minimere eventuelle bobler ved at fuldføre klipning langsomt, da overdreven skumning kan forårsage yderligere celledød39.
  2. Placer en 40 μm celle si på en steril 50 mL koniske rør og våd det ved pipettering 5 mL DMEM + 10% FBS &1% P / S.
  3. Pipette 1 mL af prøven ad gangen gennem cellesien.
  4. Vask cellesienden ved at pipettere DMEM med 10% FBS og 1% P/S gennem sien for at bringe det samlede volumen i røret op på 25 mL.
  5. Prøvens 25 mL deles ligeligt i to 15 mL koniske rør og centrifuge ved 15 °C, 400 x g i 15 min.
    BEMÆRK: Opdeling af muskelopløsningen i to 15 ML koniske rør sikrer bedre cellegendannelse efter centrifugering sammenlignet med et enkelt rør.
  6. Aspirer supernatanten og suspenderer pelleten igen i 1 mL 1x RBC Lysis buffer (se supplerende fil)ved stuetemperatur i 7 min for at eliminere erythrocytter.
  7. Opbring volumen til 10 mL med 9 mL vaskebuffer (se supplerende fil) og spinrør ved 400 x g, 15 °C i 15 min.
  8. Aspirere supernatant og rekombin pellets ved re-suspendere i 1 mL vask buffer.
  9. Overfør et passende volumen af celler til et separat 1,5 mL mikrocentrifugerør og blandes med trypanblå farvestof. Tæl levende celler på et let mikroskop ved hjælp af et hæmocytometer.

4. Antistoffarvning for flowcytometri

BEMÆRK: Sca-1-antistoffet skal konjugeres til APC før flowcytometri/FACS-eksperimenter i henhold til fabrikantens anvisninger. Ydeevnen skal valideres for hvert parti konjugates (figur 2). Endelige bøjninger kan opbevares i 20 μL aliquots ved -20 °C og er stabile i tre uger. Der henvises til den supplerende fil for fuld bøjning protokol.

  1. For flowcytometri overføres 1-2 x 106 celler pr. forsøgsprøve til et sterilt 1,5 mL mikrocentrifugerør. Bring volumen op til 1 mL med vask buffer og sted på is.
  2. For hvert forsøg skal du oprette følgende påkrævede kontrolelementer: i) ikke-farvede og ii) levedygtighedskontrol for nøjagtigt at vælge for den levende cellepopulation; iii) fluorescens minus en (FMO) kontrol af enkeltcelleaffjedring for at fastsætte nøjagtige porte til CD31-/CD45-fraktioner, FAPs og parlamentsmedlemmer og iv) enkelt-farvede kompensation perler til at korrigere for fluorescens spillover mellem kanalerne.
    1. For alle celle kontrol, aliquot 5 x 105 - 1 x 106 celler i 1 mL vask buffer i en 1,5 mL mikrocentrifuge rør og sted på is.
    2. For perle kontrol, tilføje 1 dråbe positiv kompensation perler (~ 1,5 x 105 perler per dråbe) til hver mærket 1,5 mL mikrocentrifuge rør. Det fulde supplement af kontrolelementerne er angivet i tabel 1.
      BEMÆRK: Hvis eksperimentet udføres for første gang, skal du køre enkeltfarvede kontroller for hvert konjugeret antistof på enkeltcelleophæng (ud over ubesmittede, levedygtighed, enkeltplettede kompensationsperler og FMO-kontroller) for at vurdere den positive farvede befolkning i celler og validere farvning observeret på kompensationsperler. Valider hver frisk-konjugeret Sca-1::APC forberedelse ved at udføre enkelt-farvning på kompensation perler og enkelt celle suspensioner. Se tabel 1 for at få en komplet liste over farvningskontrolelementer.
  3. For at forberede levedygtighedskontrollen overføres halvdelen af mængden af celler fra "levedygtighedsrøret" til et nyt 1,5 mL mikrocentrifugerør. Mærk dette rør "Dødt".
  4. Inkuber "Dead" rør ved 65 °C i 2-3 min for at dræbe cellerne og derefter placeres på is. Efter 2-3 min, re-kombinere døde celler med levende celler tilbage i levedygtighed kontrol rør. Denne population af celler vil blive brugt til at fastsætte kompensationsværdier (hvis det er nødvendigt) og korrekt indstille porte til levedygtighed farvestof.
  5. Centrifugere enkeltcelleaffjedringerne (forsøgsprøver og -kontroller) ved 500 x g, 4 °C i 5 min.
  6. Aspirer supernatanten og suspenderer cellepillerne igen i 100 μL vaskebuffer.
  7. Tilsæt antistoffer, afhængigt af forsøgsprøven eller kontrollen. Der henvises til farvningsmatrixen (tabel 2) for at få oplysninger om antistofkombinationer og -mængder.
  8. Svirp forsigtigt hver prøve for at sikre fuldstændig blanding og inkubation på is i mørke i 15 minutter. For kompensation perler, inkubere ved stuetemperatur i mørke i 15 min.
  9. For enkeltcelleophængseksempler og kontrolprøver skal lydstyrken op til 1 mL ved at tilsætte 900 μL vaskebuffer. For at få kontrol med kompensationsperle skal volumenet bringes op til 1 mL med 900 μL på 1x PBS.
  10. Centrifuge enkeltcelledeophængsprøver ved 500 x g, 4 °C i 5 min. Centrifugekompensationsperlekontrol ved 300 x g, 4 °C i 5 min.
  11. For alle enkeltcellede affjedringsprøver skal supernatanten aspirere og kasseres igen og suspendere cellepillen igen i 300 μL-vaskebuffer. For kompensation perle kontrol, aspirere og kassere supernatant, re-suspendere pellet i 300 μL af 1x PBS, derefter tilføje 1 dråbe (~ 1,5 x 105) af negativ kompensation perler.
  12. Hold alle enkelt celle suspension prøver på is under aluminiumsfolie og fortsætte med at flyde cytometrisk erhvervelse. Kompensation perle kontrol bør også beskyttes mod lys, men kan holdes ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Hvis eksperimentelle endepunkt er FAPs-identifikation efter flowcytometri, skal du følge trin 5.1.1-5.1.11. Hvis slutpunktet er celleisolation via FACS for kultur og farvning, skal du følge trin 5.2.1-5.2.9 og afsnit 6-7.

5. Flowcytometri og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)

  1. Flowcytometri
    BEMÆRK: Denne protokol anvender en bordplade flow cytometer udstyret med 405 nm, 488 nm, og 640 nm lasere, der er i stand til samtidig at skelne 10 forskellige farver. Bandpass filtre og deres tilhørende fluorochromes anvendes i denne protokol er som følger: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE), og 670/30 (APC). Spændinger for hver detektor er som følger: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Blå 360; APC 570. Sørg for, at du er trænet i, at flowcyometeret eller cellesorteringstælleren fungerer korrekt før brug.
    1. Sørg for, at cytometeret har været tændt i 10-20 min før brug og er blevet primet ved at rengøre sekventielt med rene, skyl og kappevæskeopløsninger i 30-45 s hver. Afslut med en skylning med dH2O. Sørg for, at der er tilsat en tilstrækkelig mængde kappevæske til opbevaringsbeholderen for at opretholde korrekt prøvestrøm under hele erhvervelsen.
    2. Konfigurer gatingstrategien for at identificere IMP'er og parlamentsmedlemmer som afgrænset i figur 3.
      BEMÆRK: FAPs og parlamentsmedlemmer identificeres ved følgende hierarkiske gating strategi: i) SSC-A vs FSC-A (side celle scatter område versus fremad celle scatter område til at adskille celler vs vragrester), ii) FSC-W vs FSC-H (fremad celle scatter bredde versus fremad celle scatter højde for at diskriminere singlets fra doublets i FSC-parameteren), iii) SSC-W vs SSC-H (side celle scatter bredde versus side celle scatter højde til diskriminerende singlets fra doublets i SSC parameter), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (for at skelne levende versus døde singlets), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (for at udelukke CD31+ og CD45+-celler fra yderligere analyse) og vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E fra CD31-/CD45- (Lineage; Lin-) befolkning (identifikation af FAPs og parlamentsmedlemmer). FAPs er identificeret som CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- hændelser, og parlamentsmedlemmer identificeres som CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+-hændelser.
    3. Kør først hver enkeltplettet kompensationsperlekontrol gennem cytometeret ved lav hastighed for at generere kompensationsværdier, der bruges til at korrigere for fluorescensafsmitning mellem kanalerne. Vurder kompensation ved at sammenligne fluorescerende signal af hver kontrol i sin egen detektor (f.eks SSC-A vs APC for Sca-1::APC enkelt-farvede perler) samt alle andre detektorer. Der bør være to forskellige populationer (en med negativ og en med positivt signal) i den relevante detektor og kun en negativ population i alle andre detektorer. Indstil stopporten til 10.000 kompensationsperlehændelser, og registrer dataene.
      BEMÆRK: Mellem erhvervelsen af hver prøve skal du sørge for at køre dH2O gennem cytometeret i 10-20 sek for at undgå kontaminering fra stikprøve til prøve.
    4. Næste proces unstained og levedygtighed kontrol prøver til korrekt gate på levende enkeltceller. Indstil stopporten til 10.000 singlet-hændelser, og registrer data.
      BEMÆRK: Ca. 5 min før erhvervelse af hver enkelt celleaffjedringsprøve med undtagelse af den ikke-farvede prøve tilsættes 1 μL SYTOX Blue levedygtighedsfarvestof (300 μM arbejdskoncentration fortyndet fra 1 mM lageropløsning) til hver prøve og svirp forsigtigt for at blande (endelig koncentration 1 μM).
    5. Derefter erhverve de resterende enkelt celle suspension kontrol prøver. Vurdere hver FMO-kontrol med dens relevante plot i gatingstrategien (figur 3). Vurder f.eks. FITC-signalet fra CD31+CD45 FMO for at sikre en nøjagtig CD31-/CD45-gate. Et optimalt eksempel er vist i figur 3G. Hvis protokollen udføres for første gang, skal der køres enkeltfarvede kontroller af celler før erhvervelsen af FMO-kontroller.
    6. Vurder fluorescerende signal for hver enkelt-farvede celleprøve i sin passende detektor samt i alle andre detektorer til at validere korrekt kompensation. Indstil stopporten til 10.000 live singlet-begivenheder, og optag på softwaren.
    7. Når alle kontroller (enkeltcelleaffjedring og perler) er blevet behandlet, skal du forberede alle eksperimentelle prøver ved først at måle og registrere mængden af hver prøve. Disse målinger vil blive anvendt til præcist at kvantificere FAPs og parlamentsmedlemmer, som beskrevet i trin 5.1.11. Derefter tilsættes 50 μL præcision tælle perler og forsigtigt blandes ved pipetter op og ned 2-3 gange.
    8. Kør kortvarigt den første forsøgsprøve for at validere identifikationen af tælleperlepopulationen. Denne population vises som en lille særskilt klynge adskilt fra den generelle cellepopulation på FSC-A vs SSC-A-plottet(Figur 3A, rød boks). Opret en port omkring tælle perlepopulationen. Derefter erhverve data for hver eksperimentel prøve ved behandling gennem cytometeret på lav hastighed. Indstil stopporten til 10.000 tælleper begivenheder og rekord.
      BEMÆRK: Efterforskere kan alternativt identificere tælle perler ved at oprette en ekstra plot vurdere SSC-A versus nogen af de detektorer, som tælle perler er fluorescerende i alle detektorer.
    9. Når alle prøver er blevet behandlet, skal cytometeret rengøres ved hjælp af de relevante protokoller. Eksporter alle data til analyse.
    10. Åbn alle datafiler på en passende flowcytometrianalysesoftware. Angiv gatingstrategien som anvendt til dataindsamling som beskrevet i trin 5.1.2. Undersøg kontroller i samme rækkefølge som i dataindsamling (f.eks. ikke-farvede, levedygtighed, enkelt plet, derefter FMO-kontroller) for at validere gatingstrategien igen. Når nøjagtige porte er blevet indstillet ved hjælp af FMO kontrol, anvende portene til alle eksperimentelle prøver. Eksporter rådata som et regneark til kvantificering.
    11. Beregn antallet af FAPs og parlamentsmedlemmer i hver eksperimentel prøve ved hjælp af tælle perler:
      Equation 1
      hvor acquired cell count er antallet af registrerede hændelser af relevant cellepopulation (f.eks. Erhvervet Perle Count er antallet af registrerede begivenheder med at tælle perler på erhvervelsessoftwaren; Optælling Perler Volumen er mængden af tælle perle løsning tilføjet i trin 5.1.7; Prøvevolumen er mængden af hver plettet forsøgsprøve forud for tilsætning af tælleperler.; PerleKoncentration er antallet af perler pr. μL-opløsning; Denne værdi findes i produktdataarket.
  2. FACS - sortering for cellekultur
    BEMÆRK: Denne protokol udfører FACS på en cellesortering udstyret med 4 lasere (UV, Violet, Blå, Rød), der er i stand til samtidig at skelne mellem 11-14 farver. Følg den eksperimentelle prøvefarvning (afsnit 4) og flowcytometriprotokollen med undtagelse af trin 1 til 3, der er afgrænset nedenfor, for at optimere FACS-arbejdsprocessen:
    1. Øge koncentrationen af celler i de eksperimentelle prøver, der skal sorteres til 7 x 106 celler / mL til at generere robuste udbytter af FAPs og parlamentsmedlemmer.
    2. For at tage højde for denne betydelige stigning i cellekoncentrationen skal der sorteres dobbelt alle antistofkoncentrationer i de eksperimentelle prøver.
    3. Behandl de endelige farvede celleprøver gennem en 40 μM cellestapsagehætte fastgjort til et 5 mL polystyrenrør umiddelbart før sortering for at reducere celleklumpning og øge sorteringsudbyttet.
    4. Saml enkelt, levende rotteAFGafsorke og parlamentsmedlemmer direkte fra cellesorteringsglasset i et 5 mL polypropylenopsamlingsrør, der indeholder 1 mL sterilt, 100% fosterkvægsserum (FBS). Hold cellerne på is, indtil sorteringen er færdig.
      BEMÆRK: Hvis du udfører FACS på et sted uden for stedet, skal du overføre alle sorterede celler på is og i en sikret, overdækket beholder.
    5. Arbejde i et sterilt biosikkerhedskab (BSC) skal du bringe mængden af sorterede celler op til 7 mL med passende vækstmedier (f.eks. FAP-vækstmedier (FAP GM) til sorterede FAPs og MP-vækstmedier (MP GM) til sorterede parlamentsmedlemmer, se supplerende fil til opskrifter) og centrifuge ved 500 x g, 4 °C i 7 minutter for at fjerne så meget restvaskebuffer som muligt.
    6. Resuspend pellets i 1 mL af passende vækstmedier og plade i en 12-brønd plade indeholdende en steril, kollagen-belagt 12 mm glas coverlip/brønd til efterfølgende immunstaining (se afsnit 6).
      BEMÆRK: Hvis immunocytokemi farvning til kollagen, plade sorteret celler i en 12 brønd plade, der indeholder en steril, laminin-belagt 12 mm glas coverlip / godt, i stedet for kollagen-belagt. Hvis immuncytokemi eksperimenter af umiddelbart isolerede forfædre er påkrævet, frø FAPs og parlamentsmedlemmer ved en tæthed på 15.000 celler pr cm2 og gå direkte til trin 6.1. For langsigtede kulturer til at fremkalde stamfader differentiering, frø FAPs ved en tæthed på 5.000 celler pr cm2, og parlamentsmedlemmer ved en tæthed på 7.500 celler pr cm2.
    7. Inkuber celler ved 37 °C og 5% CO2 i en cellekulturinkubator. Efter 72 timer i kultur, ændre halvdelen af medierne. Skift medier fuldt ud hver 2-4 d efter.
    8. For at fremkalde myocyt udvikling, skifte parlamentsmedlemmer kulturer til MP differentiering (MD) medium på dag 9 af kultur. For at fremkalde adipocytter skal du skifte FAPs-kulturer til FAP-adipogenic differentieringsmedium (AD) på kulturdag 10.
    9. For at fremkalde fibrogenese kan FAP'er skiftes til fibrogen differentiering (FD) medier på variable tidspunkter under kultur, eller alternativt, kan sås direkte i FD medier efter isolation (trin 5.2.6) (Se supplerende fil for alle medier opskrifter).

6. Immunocytochemistry af kultiverede FAPs og parlamentsmedlemmer

  1. For at validere cellesortering og demonstrere renheden af FAPs og parlamentsmedlemmer kulturer, immunostain med celle-type specifikke markører, herunder PDGFRα (FAPs markør), Pax-7 (muskel stilk [satellit] celle markør), Fibroblast-specifikke protein (FSP-1, fibroblast markør), Perilipin-1 (Plin-1, adipocyt markør), Kollagen type 1 (Col1a1, indikator for fibrose), Myosin Heavy Chain (MHC, moden myocyt markør).
    1. Til immunstainning af frisksorterede celler centrifugere 12-brøndspladen ved 200 x g i 3 min ved stuetemperatur for at lette cellernes klæbeevne til dækslet/brønden. Dette skridt er ikke nødvendigt for langsigtede kulturer. Fjern kulturmedier.
    2. Til immunstaining med FSP-1 skal celler fastgøres med 1 mL 100% methanol (MeOH) i 2 min ved 4 °C. Hvis immunstaining for PDGFRα, Plin-1, Pax7 eller Col1a1, fastsætte cellekulturer med 1 mL 4% PFA i 1x PBS i 15 min ved stuetemperatur. MHC immunstaining tåler enten fiksativ.
      BEMÆRK: For methanolfaste celler skal du springe trin 6.2 over og fortsætte til trin 6.3.
  2. Aspirere 4% PFA og hurtigt vaske cellekulturer 3-4 gange med 1x PBS. Tilsæt 1 mL på 100 mM Glycin i 1x PBS og inkuber i 10 min ved stuetemperatur for at inaktivere resterende PFA. Aspirere og vask 1-2 gange med 1x PBS.
    BEMÆRK: Celler kan efterlades på dette stadium i 2 mL af 1x PBS, indpakket i husholdningsfilm og opbevares ved 4 °C i højst 7-10 dage.
  3. Efter vask tilsættes 1 mL på 0,1% Triton-X i 1x PBS og inkuberes i 20 minutter for at permeabilisere cellemembraner.
  4. Vask brønde 2-3 gange med 1-2 mL 1x PBS og bloker derefter celler med 1 mL 1x PBS + 3% BSA pr. brønd i 1 time ved stuetemperatur.
  5. Pipette 80 μL af primær antistof fortyndet i 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 pæn, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) på et stykke parafilm tapede til en mobil beholder. Ved hjælp af sterile fine sammentrak løftes dækslerne forsigtigt ud af brønden og vend den på dråben af antistofopløsning. Inkuber coverlip med to våde stykker papirhåndklæde og dækbeholder i plastfolie for at undgå fordampning af antistofopløsningen. Inkuberes natten over ved 4 °C.
    BEMÆRK: Farvningsdæksler ud af brønden bruger mindre antistof (~ 80 μL) end farvning inde i brønden (500 μL minimum).
  6. På dag 2 skal der efterlades coverslips ved stuetemperatur i 30 minutter for at varme. Brug sammenkøjninger omhyggeligt højre og overførsel coverslips tilbage til deres respektive brønde (celler vender op) og vask 2-3 gange med 1-2 mL af 1x PBS i 2 min hver for at fjerne så meget primært antistof som muligt.
  7. Ved hjælp af den samme farvningsteknik som med primær antistoffarvning, pletceller med gede anti-kanin Alexa Fluor 488 sekundært antistof (1:400) til at opdage FSP-1, Plin-1, Col1a1 eller PDGFRα og gede anti-mus Alexa Fluor 555 sekundært antistof (1:300) for at opdage MHC eller Pax-7. Inkuber celler i 1 time ved stuetemperatur og hold cellerne beskyttet mod lys.
  8. Returner celler til brønden og inkuber celler med Hønst (1:10.000) i 2-4 min ved stuetemperatur. Vask celler yderligere 2-3 gange med 1x PBS i 2 min hver for at fjerne overskydende Hoechst.
  9. Mount coverslips på glas dias ved hjælp af en anti-fade fluorescerende montering medium og lad dias til tørre natten over i mørke ved stuetemperatur. Opbevar monterede dæksler ved 4 °C i mørke.

7. OlieRød O (ORO) farvning af kultiverede FAPs og parlamentsmedlemmer

  1. Udfør ORO farvning på ikke-permeabiliserede celler, da permeabilisering af cellemembranen kan resultere i ikke-specifik / uønsket farvning af ikke-adipogenic celletyper. Før farvningen påbegyndes, skal du forberede en ORO-arbejdsmasse (se supplerende fil til opskriften) og inkubere ved stuetemperatur i 20 min.
  2. Efter 20 min filtreres opløsningen ved hjælp af et 0,2 μm filter for at fjerne uopløste aggregater.
  3. Aspirere medier fra godt og tilføje 1 mL af 10% Neutral Buffered Formalin (10% NBF). Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Cellekonfluens kan resultere i løft fra brønden/dækslen. Vær forsigtig, når du aspirer/tilføjer løsninger.
  4. Aspirere og tilsæt 1 mL frisk 10% NBF og inkuberes i mindst 1 time ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Protokollen kan stoppes på dette tidspunkt, da celler kan efterlades i 10% NBF natten over.
  5. Vask hurtigt brøndene en gang med 1 mL 60% isopropanol, og aspirer derefter og lad brøndene tørre helt (ca. 2 min).
  6. Tilsæt 400 μL Olie Red O arbejdsmasse pr. brønd og inkuber i 10 min ved stuetemperatur, og sørg for at undgå at pipettere oro på pladens vægge.
  7. Fjern al olierød O og vask hurtigt brønden 4 gange med dH2O.
    BEMÆRK: Hvis farvede brønde indeholder coverslips, monteres ved hjælp af den samme teknik som beskrevet i trin 6.9.
  8. Billede enten monteret coverlips eller farvede godt ved hjælp af en brightfield mikroskop.

8. Vævsfarvning af kontralaterale og denervated rotte gastrocnemius sektioner

  1. Picrosirius Rød (PSR)
    1. Udfør PSR farvning på 5 μm-tyk, formalin-fast paraffin indlejret (FFPE) rotte gastrocnemius histologiske sektioner som tidligere beskrevet40.
  2. Olierød O (ORO)
    1. Fix 5 μm-tyk isopentane-frosne rotte gastrocnemius histologiske sektioner i 4% PFA i 10 min, inkubere i 60% isopropylalkohol i 1 min.
    2. Plet med ORO arbejdslager i 12 min. Inkuberes i 60% isopropylalkohol i 1 min, vask i 10 min i dH2O. Mount på coverlips ved hjælp af et vandopløseligt monteringsmedie.
  3. Sca-1 og laminin væv fluorescerende immunohistochemistry (IHC)
    1. Udfør fluorescerende IHC på 5 μm-tykke isopentane-frosne rotte gastrocnemius histologiske sektioner.
    2. Hydratprøver i 1x PBS i 5 min, fastgør i 4% PFA i 10 min og inkuberer derefter prøver i vævs hvis-blokeringsopløsning (se supplerende fil) i 90 min.
    3. Inkuberes med anti-Sca-1 primære antistof (1:500) fortyndet i 1x PBS + 0,05% Tween ved 4 °C natten over.
    4. På dag 2 skal du vaske tre gange i 1x PBS + 0,05% Tween i 5 min hver, og inkuberer derefter i gede anti-kanin Alexa Fluor 555 (1:500) i 1 time.
    5. Vask igen (som før), inkuber med blokeringsopløsning i 1 time, og tilsæt derefter anti-laminin primært antistof (1:500) fortyndet i 1x PBS + 0,05% Tween i 1 time.
    6. Vask igen (som før), derefter inkubere i ged anti-kanin Alexa Fluor 488 (1:500) for 1 time (for laminin).
    7. Vask igen (som før) inkuber derefter i DAPI (1:10,000) i 4 min. Vask og monter på dæksler ved hjælp af anti-fade montering medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifikation af FAPs og parlamentsmedlemmer via flowcytometri ved hjælp af et nyt antistofpanel, herunder Sca-1 og VCAM-1
Gating-strategien til identifikation af FAPs i rottemuskel er baseret på flowcytometriprotokoller i mus29, som gate på CD31 (endotel) og CD45 (hæmatopoietiske) positive celler (kaldes slægten [Lin]) og undersøger den fluorescerende profil af FAPs-markør Sca-1 og parlamentsmedlemmer markør ITGA7 fra linage-negative (Lin-) befolkning. I mangel af kommercielt tilgængelige, fluorophore-konjugeret, og flow cytometri-validerede antistoffer for rotte Sca-1 og ITGA7, vi selv konjugeret en rotte Sca-1::APC antistof, og påtog sig en alternativ strategi for at identificere parlamentsmedlemmer. Da VCAM-1 for nylig viste sig at være en effektiv enkelt positiv udvælgelsesmarkør for isolering af rotte parlamentsmedlemmer33 og en rotte-specifikke, konjugeret, flow cytometri-valideret antistof rettet mod VCAM-1 er til rådighed, vi udnyttede VCAM-1 til at identificere parlamentsmedlemmer, i modsætning til ITGA7.

Vi bekræftede vellykket bøjning og ydeevne af Sca-1:APC antistof med enkelt farvning af kompensation perler og celle suspensioner genereret fra sunde rotte gastrocnemius(Figur 2A,B). Der blev udført en fempunkts titrering af Sca-1::APC (Figur 2C) ud over alle andre antistoffer (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE), der anvendes i protokollen (supplerende figur 1), for at identificere de optimale koncentrationer. Ved hjælp af dette nye paneldesign blev putative FAPs og parlamentsmedlemmer samtidig identificeret ud fra sund gastrocnemius (figur 3), hvorved celler, der var enpositive for Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) blev udpeget som FAPs (rød boks) og celler, der var ensepositive for VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) blev udpeget som parlamentsmedlemmer (blå boks). Vi identificerede også en population af celler dobbelt positiv for Sca-1 og VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) (Figur 3F; øvre højre kvadrant).

Validering af IDENTIFIKATION AF FAPs og parlamentsmedlemmer efter FACS og cellekultur
For at validere den protokol, der præsenteres for flowcytometrisk identifikation af FAPs og parlamentsmedlemmer i rottemuskulaturmuskulatur, forsøgte vi at isolere levende celler til kultur in vitro. Ved hjælp af FACS blev levedygtige FAPs og parlamentsmedlemmer isoleret ved hjælp af den samme gating strategi som i flowcytometrisk analyse. Omkring 20.000-40.000 FAPs og 30.000-50.000 parlamentsmedlemmer blev indsamlet til cellekultur fra en enkelt gastrocnemius muskel fra en 230 g rotte.

For at bekræfte renheden af hver befolkning, vi co-immun farves frisk sorteret FAPs og parlamentsmedlemmer for PDGFRα og Pax7. PDGFRα er den anden mesenchymal stamfader markør, foruden Sca-1, almindeligt anvendt til at identificere FAPs2,7,8. Pax-7 er en velkendt og meget udbredt markør for muskel satellit (stamceller) celler41. Den sorterede population af FAPs udviste positiv farvning for PDGFRα uden forurening med Pax7 positive celler(Figur 4A; øverste række). Omvendt farvede den sorterede population af parlamentsmedlemmer positivt for Pax7 med fravær af PDGFRα positive celler (Figur 4A; nederste række), der validerer Lin-/Sca-1+/VCAM-1- og Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ celleoverfladeantigenprofilers evne til at isolere rene populationer af henholdsvis GIPS'er og parlamentsmedlemmer.

Vi næste kultiveret sorteret FAPs og parlamentsmedlemmer over en tid på 10-12 dage i betingelser for at fremkalde adipogenic, fibrogenic, og myogen differentiering. Ved dag 12 indeholdt FAPs-kulturer, der blev udsat for adipogenic-tilstande, celler med enten en fibroblastlignende morfologi eller en multilokulær morfologi svarende til hvide præ-adipocytter med fedtdråber (data, der ikke er vist). Immunstainning for fibroblast specifikt protein-1 (FSP-1) bekræftet fibroblast differentiering, mens farvning for Plin-1 (Perilipin-1; en adipocyt markør)42 og Olierød O bekræftet differentiering af adipocytter og tilstedeværelsen af neutrale triglycerider og lipider, henholdsvis (Figur 4B). Fraværet af forurenende celler fra en myogen afstamning i FAPs kulturer blev bekræftet af co-immunstaining for myosin tung kæde (MHC), en markør for differentierede myocytter. FAPs kulturer udsat for fibrogen differentiering (FD) blev vurderet for kollagen type 1 (Col1a1) udtryk, en af de vigtigste FAPs-afledt kollagen8. Co-immunstaining for Col1a1 og MHC på dag 11 afslørede robust kollagen type 1 udtryk uden forurenende MHC positive celler (Figur 4B). Endelig bekræftelse af renheden af FAPs befolkning blev foretaget ved dyrkning af FAPs i myogene medier, for at tilskynde til udvækst af eventuelle forurenende parlamentsmedlemmer. Der blev ikke observeret nogen MHC-positive celler (supplerende figur 2A).

MP kulturer udsat for myogene tilstande demonstreret MHC-udtrykke modne myocytter og multi-nukleated myotubes 12 dage efter plating (Figur 4C). Co-immunstaining af MP kulturer med FSP-1, og Plin-1 viste fraværet af forurenende fibroblaster eller adipocytter, henholdsvis. På samme måde påviste ORO-farvning ikke lipidforurening (fig. 4C). Col1a1, som er stærkt udtrykt af fibroblaster, er også blevet rapporteret at være produceret i mindre grad af myogene prækursorer og myoblaster, selv om der er modstridende data i litteraturen i denne henseende8,43,44. Mens co-immunstaining af parlamentsmedlemmer med Col1a1 og MHC afslørede myocyt differentiering af vores MP kultur, ingen tegn på Col1a1 immunopositivity blev fundet (Figur 4C). For yderligere at bekræfte renheden af befolkningen blev MP-kulturer udsat for adipogenic eller fibrogene tilstande for at fremme væksten af adipocytter og fibroblaster (supplerende figur 2B). Der blev ikke observeret kontaminerende celler fra FAPs-slægten.

Mens vi havde demonstreret evnen til at identificere og sortere rene populationer af FAPs og parlamentsmedlemmer fra rottemuskel, vi næste forsøgt at bestemme identiteten af Lin-/Sca-1 +/VCAM-1 + (dobbelt positiv) celler. Da Sca-1 udtryk er blevet rapporteret om en meget lille andel af parlamentsmedlemmer (ca. 3%) i sunde muskler45 og tilsvarende få FAPs (ca. 4%) er blevet rapporteret til at udtrykke VCAM-1 i sunde muskler10, immunstaining af frisk sorteret Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler blev udført for PDGFRα og Pax7 sammen med dyrkning dem i myogene, adipogenic, fibrogene tilstande til at fremkalde myogenese, adipogenese og fibrogenese henholdsvis. Det blev konstateret, at de dobbeltpositive celler var en blandet population af parlamentsmedlemmer og FAPs, med frisksorterede celler, der immunstænger positive for enten PDGFRα eller Pax7 (supplerende figur 3A) og dyrkede celler, der differentierede i modne myocytter, adipocytter eller fibroblaster (supplerende figur 3B, C).

ITGA7 vs VCAM-1 til at identificere parlamentsmedlemmer under flow cytometrisk FAPs identifikation
Mens en vellykket protokol for flowcytometrisk identifikation af rotte-FAPs og parlamentsmedlemmer ved hjælp af henholdsvis Sca-1 og VCAM-1 blev etableret, forsøgte vi at afgøre, om et selvkonjugeret ITGA7-antistof ligeledes kunne bruges til at identificere parlamentsmedlemmer i stedet for VCAM-1, som det er standard i musen. Et rottespecifikt ITGA7-antistof blev konjugeret til PE-Cy7 (se supplerende fil), og antistoffets ydeevne blev valideret på kommercielle kompensationsperler og enkeltcelleaffjedringer fra rotte gastrocnemius (supplerende figur 4A-C). Itga7::P E-Cy7-antistoffet klarede sig tilstrækkeligt på enkeltfarvnings- og FMO-forsøg (supplerende figur 4D). Men når fuld farvning gastrocnemius celle suspensioner med CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC, og ITGA7::P E-Cy7, en interaktion blev tydelig mellem Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy-7 antistoffer. Efterfølgende kultur af både FACS sorterede Lin-/Sca-1+/ITGA7-celler (påståede FAPs) og Lin-/Sca-1-/IGTA7+-celler (påståede parlamentsmedlemmer) (supplerende figur 4E)gav overvejende FAPs og med få parlamentsmedlemmer (supplerende figur 4F),der angiver samspillet mellem Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy-7 antistoffer negativt påvirket specificiteten af identifikationscelleidentifikation.

En ny FAPs tid-kursus i langsigtede denervated skeletmuskulatur
Da FAPs dynamikken er blevet vurderet i forbindelse med kortsigtet traumatisk denervation, forsøgte vi i murinemodeller11,38at validere ydeevnen af vores metode til FAPs-isolering fra både sund og alvorligt attrofisk, fibrotisk muskel. Rotter blev udsat for traumatisk langvarig denervationsskade ved hjælp af den vel validerede ensidige tibial nervetranssektionsmodel46 med gastrocnemius muskel høstet på fire serielle tidspunkter over 14 uger efter denervation fra den denervated lem og kontralaterale innerverede lemmer (for at tjene som en intern kontrol). Som tidligere rapporteret demonstrerede denervaterede muskel progressiv atrofi (Figur 5A, B), med stigende fibrose og fedtaflejring ( Figur5C-F) over tid47.

Vores protokol genererede et tilstrækkeligt antal celler til flowcytometrianalyse, selvom 12 og 14 ugers denervated gastrocnemius vejede ca. 0,2-0,3 g (15-20% af de respektive kontralaterale kontrolmuskler) (Figur 5B). Vi observerede up-regulering af FAPs i denervated gastrocnemius muskel i forhold til den innervated kontralateral kontrol muskel, opretholdes for 14 uger varighed af eksperimentet (Figur 6A, B), konkordans med den progressive muskel fibrose og fedt deposition. Sca-1 immunstaining af muskel histologiske tværsnit bekræftet lokalisering af Sca-1 udtrykke celler til områder af fibro-fedtholdige ændringer i 14 uger-denervated muskel (Figur 5G), ud over baseline udtryk i interstitium mellem myofibre i sunde muskler. En tydelig delmængde af celler opstod i FAPs befolkning over tid efter denervation karakteriseret ved en robust stigning i Sca-1 signal (Sca-1 høj; Figur 6A, rød boks) ved flowcytometrisk analyse sammenlignet med FAPs basal Sca-1-udtrykket (Sca-1 Med/Low; Figur 6A, grøn boks). Kvantificeringen af disse delpopulationer afslørede differentierede dynamikker over tid; Sca-1 Høje FAPs steg betydeligt med 12- og 14 ugers efterbening (figur 6B),der omfattede ca. halvdelen af den samlede FSP-befolkning (figur 6C). I modsætning hertil var Sca-1 Med/Low FAPs den dominerende delpopulation ved 2- og 5 uger efter denervation (figur 6C) og udviste kun en forbigående stigning i niveauet tidlig efter denervation (figur 6B).

I modsætning til den vedvarende tilstedeværelse af FAPs i langsigtede denervated muskel, parlamentsmedlemmer demonstreret en forventet bifasisk reaktion på denervation. Oprindeligt parlamentsmedlemmer steg i denervated muskel over, der ses i kontrol lemmer, men på 5 uger efter denervation befolkningen begyndte at falde (Figur 6D). I overensstemmelse med den velkendte udmattelse af muskel satellit celle befolkning i langsigtede denervated muskel47, ved 12 uger parlamentsmedlemmer var enten på eller under baseline niveauer efter tibial nerve transsektion.

Vi har også analyseret dynamikken i Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ populationen (supplerende figur 3D-E). Mens hyppigheden af dobbelt positive celler i forhold til Lin-populationen gradvist faldt i denervated muskel over tid, når den absolutte celle tæller blev bestemt pr gram muskler en midlertidig stigning i den dobbelte positive befolkning blev observeret, før de falder til eller under baseline niveauer med 14 uger efter denervation.

Figure 1
Figur 1: Grafisk skema for IDENTIFIKATION, isolation og kultur af FPS og parlamentsmedlemmer: Grafisk skema, der skildrer FAPs og parlamentsmedlemmer identifikation fra rotte gastrocnemius. Prøver høstes og hakkes mekanisk, før de gennemgår to sekventielle enzymatiske fordøjelser. Vævspræparater behandles derefter og filtreres for at generere en enkelt celleaffjedring. En cocktail af fluorescerende konjugerede antistoffer føjes til hver prøve, som derefter køres gennem et flowcytometer eller cellesortering for henholdsvis at identificere eller isolere FAPs og parlamentsmedlemmer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Sca-1::APC selvkonjugeret antistofvalidering og titrering. Validering af Sca-1::APC antistofbøjning ved enkeltfarvning på kommercielle kompensationsperler (A) og enkeltcelleophæng genereret fra sunde rotte gastrocnemiusmuskel (B). Forskellige populationer af både Sca-1 mærkede perler og celler er tydelige (sorte bokse). Antistoftriturationen blev udført ved at teste fem forskellige koncentrationer af Sca-1::APC på enkeltcelleophæng (C); den optimale koncentration blev valgt baseret på den største fluorescensintensitet med minimal baggrundsfarvning og viste sig at være batchafhængig. En repræsentativ titrering vises med partiets specifikke optimale koncentration angivet af den røde boks. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Flowcytometriidentifikation af FAPs og parlamentsmedlemmer i rottesne gastrocnemius. (A-F) Gating strategi for flow cytometrisk analyse af FAPs og parlamentsmedlemmer. (A) Prøver er først gated at udelukke vragrester (sort boks) samt til gate til optælling perler (rød boks). Celler er derefter gated at udelukke doublets både ved front scatter (FSC) (B) og side scatter (SSC) egenskaber (C). Levedygtigheden af resulterende enkeltceller vurderes ved farvning med SYTOX Blue (D). SYTOX Blue negative (levende) singlets vurderes derefter for FITC-signal, der identificerer CD31 og CD45 (Lineage; Lin) for at udelukke Lin+ brøker fra yderligere analyse (sort boks Lin-celler) (E). Lin-populationen vurderes derefter for Sca-1::APC versus VCAM-1::P E signal (F). FAPs er identificeret som Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; rød boks), mens parlamentsmedlemmer er identificeret som Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ hændelser (F; blå boks). En Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ dobbelt positiv population er også tydelig (øverste højre kvadrant). (G) FMO -kontrolelementer (Fluorescens minus 1) til CD31::FITC og CD45::FITC demonstrerer korrekt kompensation og gating for Lin-celler. (H-I) Sca-1::APC versus VCAM-1::P E parceller af FMO kontrol demonstrere ordentlig kompensation og gating for FAPs (Sca-1 FMO) og parlamentsmedlemmer (VCAM-1 FMO). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Sorterede EF'er og parlamentsmedlemmer cellekultur og immunstaining. (A) Co-immunstaining for PDGFRα (grøn) og Pax7 (rød) på frisk sorterede FAPs (øverste række) og parlamentsmedlemmer (nederste række). Kerner plet blå med DAPI. FAPs udelukkende udtrykke PDGFRα og ingen Pax7 positive celler er indlysende, mens parlamentsmedlemmer udelukkende udtrykke Pax7 uden PDGFRα positiv celle forurening, der viser renheden af begge sorterede populationer. (B) FAPs på dag 12 i adipogenic differentiering medier (AD) plet positiv for fibroblast-specifikke Protein 1 (FSP-1; grøn) og Perilipin-1 (Plin-1; grøn), der viser differentierede fibroblaster og adipocytter, henholdsvis. Kerner er plettet med DAPI (blå). OlieRød O (ORO) farvning (rød) angiver tilstedeværelsen af neutrale triglycerider og lipider som følge af modne adipocytter inden dag 12. FAPs, der udsættes for fibrogene differentieringsmedier (FD), demonstrerer udtryk for FAPs-afledt kollagentype 1 (Col1a1; grøn). FAPs, der dyrkes i enten adipogenic eller fibrogene medier, er ikke co-immunostain for myosin tung kæde (MHC, rød), hvilket indikerer fravær af forurenende myocytter. (C) Parlamentsmedlemmer dyrket i myogen differentiering medier (MD) på dag 12 display MHC positiv (rød) farvning viser tilstedeværelsen af modne myocytter og smeltet multinukleated myotubes. Kerner er plettet med DAPI (blå). MP kulturer var fri for fibroblast og adipocyt forurening som angivet ved fraværet af co-immunstaining for FSP-1 (grøn), Plin-1 (grøn) og ORO farvning. Parlamentsmedlemmer dyrket på laminin for at imødekomme Co1a1 immunstaining viser ikke den samme grad af myotube fusion af dag 12 som opstår på kollagen. Col1a1 (grøn) er fraværende fra MP kulturer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Atrofi, fibrose, og fedt infiltration af langsigtede denervated muskel. (A) Repræsentativ høstet gastrocnemius muskler på fire serielle timepoints post-denervation. Gastrocnemius, der er angivet CONTRA, er en repræsentativ kontralateral limb-prøve fra et to ugers denervated dyr. (B) Kvantificering af muskelatrofi efter denervation udtrykt som forholdet mellem denervated (DEN) gastrocnemius våd vægt til den kontralaterale (CONTRA) lemmer. (C) Picrosirius Rød (PSR) plettet histologiske tværsnit af gastrocnemius høstet 2 eller 14 uger efter denervation demonstrere progressiv fibrose. Muskel pletter gul, kollagen pletter rød. (D) Fibrose kvantificeret ved bestemmelse af området af PSR positivt væv i forhold til det samlede vævsområde. (E) Olierød O (ORO) farvede tværsnit af gastrocnemius høstet 2- eller 14 uger efter denervation, modsfarvet med hæmatoxylin. Lipider pletter rødt. (F) Fedtinfiltration kvantificeret ved bestemmelse af oro-farvet væv i forhold til det samlede vævsområde. (G) Gastrocnemius histologiske tværsnit høstet 2- eller 14-ugers post-denervation, immun farves for laminin (grøn) og Sca-1 (rød). Laminin pletter positivt den basale lamina, der omgiver individuelle myofibre. Sca-1 identificerer flere stamcelletyper. Kerner er plettet med DAPI (blå). Indsat viser lokalisering af Sca-1 + celler uden for basal lamina i sunde muskler; gule pile betegner tilstedeværelsen af Sca-1+ celler inden for fibrotiske områder. (Data er gennemsnitlige +/- S.D; n=3 for 2 og 14 ugers tidsintervaller. Data i panel B analyseret af envejs ANOVA, data i paneler D og F analyseret af tovejs ANOVA. Sidaks test blev udført efter hoc-testen for at korrigere for flere sammenligninger. * = P<0,05 mellem CONTRA og DEN; # = P<0,05 mellem prøver) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: FAPs og parlamentsmedlemmer dynamik i langsigtede denervated rotte gastrocnemius. (A) Repræsentativ Sca-1::APC versus VCAM-1::P E paneler af Lin- (CD31-/CD45-) populationen fra muskelprøver høstet 2-, 5-, 12-, eller 14-ugers post-denervation. Øverste række viser plots fra den denervated (DEN) gastrocnemius, mens den nederste række viser dem fra den kontralaterale, uoperaterede (CONTRA) gastrocnemius. Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs (Total) er opdelt i Sca-1 High (rød boks) og Sca-1 Med/Low (grøn boks) brøker, mens Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ parlamentsmedlemmer vises i den blå boks. (B) Kvantificering af FAPs (Total, Sca-1 High, Sca-1 Med/Low) ved hvert tidspunkt post-denervation, rapporteret som hyppigheden (%) af Lin-celler (øverste række) og antallet af celler pr gram muskel (nederste række) normaliseret til den kontralaterale kontrol gastrocnemius. (C) Relative andele af Sca-1 High og Sca-1 Med/Low delpopulationer af den samlede FSP-population. (D) Kvantificering af parlamentsmedlemmer på hvert tidspunkt post-denervation rapporteret som hyppigheden (%) af Lin-celler (venstre graf) og som antallet af celler pr gram muskel (højre graf) normaliseret til kontralateral kontrol. (Data er gennemsnitlige +/- S.D; n=4 for 2 og 12 ugers tidsintervaller; n=5 for 5 ugers tidpunkt; n=2 for 14 ugers tidsinterval. Data analyseret af envejs ANOVA; Sidaks test efter hoc-testen for at rette op på flere sammenligninger. # = P<0,05.) Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Validering og titrering af antistofstoffer. Validering af CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) og VCAM-1::P E (G-I) kommercielt konjugeret antistoffer på kompensation perler (A, D, G) og encellede suspensioner fra sunde rotte gastrocnemius muskel (B, E, H). Hvert antistof blev titreret ved 5 forskellige koncentrationer (C,F,I). Den optimale koncentration blev valgt baseret på den største fluorescensintensitet med minimal baggrundsfarvning (røde bokse). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Sorterede OP'er og parlamentsmedlemmer under omvendte differentieringskulturbetingelser. (A) FAPs dyrkes i myogen differentiering medier (MD) på dag 12 co-immun farves for FSP-1 (grøn), Plin-1 (grøn) eller Col1a1 (grøn) og MHC (rød) ikke påvise myocyt forurening. Positiv FSP-1, og Col1a1 farvning afslører FAPs differentiering til fibroblaster. ORO farvning (rød) afslører lipid produktion, selv om Plin-1 positive adipocytter ikke er let synlige. Kerner farves med DAPI (blå). (B) Parlamentsmedlemmer, der blev udsat for adipogenic differentieringsmedier, døde. Parlamentsmedlemmer kulturret i FAP Growth Media (FAP GM) i 12 dage og co-immun farves til FSP-1 (grøn) eller Plin-1 (grøn) og MHC (rød) demonstrere differentierede myocytter og myotubes med fravær af FSP-1 eller Plin-1 positive celler. Fraværet af ORO farvning bekræfter yderligere manglen på adipogenic celler i kultur. Parlamentsmedlemmer dyrket i fibrogene differentiering medier (FD) og co-immun farves for Col1a1 og MHC viser modne myocytter og fravær af Col1a1 positive celler. Parlamentsmedlemmer dyrket på laminin for at imødekomme Col1a1 immunstaining viser ikke den samme grad af fusion til myotubes på 12 dage i kultur som forekommer på kollagen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler er en blandet population afFAPs og parlamentsmedlemmer. (A) PDGFRα og Pax7 co-immunstaining af frisk isolerede Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler viser en blandet population af PDGFRα enkelt positive (hvide pile) og Pax7 enkelt positive (gul pil) celler identificere FAPs og parlamentsmedlemmer, henholdsvis. (B) Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ kulturer på dag 12 dyrket i myogene differentieringsmedier (MD) indeholder både FSP-1 enkelte positive (grønne) og MHC enkelte positive (røde) celler, der identificerer henholdsvis fibroblaster og myocytter / rør. Fraværet af Plin-1 (grøn) og ORO (rød) farvning indikerer fraværet af modne adipocytter. Co-immunstaining for Col1a1 (grøn) og MHC (rød) viser modne myocytter og fibroblaster. (C) Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ celler på dag 12 dyrket i adipogenic differentiering medier (AD) ligeledes viser en blanding af FSP-1 (grøn) enkelt positive og MHC (rød) enkelt positive celler, men også med soklin-1 (grøn) enkelt positive celler og ORO farvning til stede, bekræfter differentiering af fibroblaster, myocytter og adipocytter. Kulturer dyrket i fibrogene differentiering medier (FD) viser modne myocytter og Col1a1 enkelt positive celler (fibroblaster). (D) Repræsentativ Sca-1::APC versus VCAM-1::P E paneler af Lin- (CD31-/CD45-) populationen fra denervated muskelprøver høstet 2-, 5-, 12-eller 14-ugers post-denervation; Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ population er angivet i den lilla boks. (E) Kvantificering af Lin-/Sca-1+/VCAM-1+-celler på tværs af fire serielle tidspunkter efter denervation, rapporteret som hyppigheden af Lin-celler (venstre graf) og celler pr. gram muskel (højre graf) normaliseret til den kontralaterale gastrocnemius. (Data er gennemsnitlige +/- S.D; n=4 for 2 og 12 ugers tidsintervaller; n=5 for 5 ugers tidpunkt; n=2 for 14 ugers tidsinterval. Data blev analyseret af envejs ANOVA; sidaks test efter hoc-testen for at korrigere for flere sammenligninger; # = P<0,05.) Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: ITGA7 som en markør for myogene celler i flowcytometri af rottemuskulatur. Validering af ITGA7::P E-Cy7 antistofbøjning ved enkeltfarvning på kommercielle kompensationsperler (A) og enkeltcelleophæng genereret af sunde rotte gastrocnemius muskel (B). Populationer af både ITGA7-mærkede perler og celler er tydelige (sorte bokse) (C) Antistoftiterration blev udført ved at teste fem forskellige koncentrationer på enkeltcelleophæng. Rød boks indikerer ideel koncentration. (D) Plots of Fluorescens Minus One (FMO) kontrol viser fraværet af fluorescens spillover på tværs af antistof konjugates, men fuld plet af celle suspensioner afslører en ikke-specifik interaktion mellem Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy7 (grøn boks). Gating (E) for at adskille Lin-/Sca-1+/ITGA7-celler (påståede "FAPs") og Lin-/Sca-1-/IGTA7+-celler (påståede "parlamentsmedlemmer"). (F) Co-immunstaining af FACS-sorterede cellekulturer på 12 dage efter plating med Perilipin-1 (grøn) og MHC (rød) viser begge grupper af sorterede celler modnes overvejende til adipocytter med få myocytter til stede. Klik her for at downloade denne fil.

1. Unstained
2. Levedygtighedskontrol
3. CD31 + CD45 FMO
4. Sca-1 FMO
5. VCAM-1 FMO
6. CD31 + CD45 Enkelt plet (perler)
7. CD31 + CD45 Enkelt plet (celler)
8. Sca-1 enkelt plet (perler)
9. Sca-1 Enkelt plet (celler)
10. VCAM-1 enkelt plet (perler)
11. VCAM-1 enkelt plet (celler)

Tabel 1: Kontrol med farvning af antistofstoffer, der flyder cytometri. Fuldt komplement af antistof farvning kontrol. Hvis eksperimentet udføres for første gang, skal der køres enkelt farvede kontroller på både kompensationsperler og enkeltcelleaffjedring. For alle efterfølgende eksperimenter behøver enkelt farvede kontroller kun at blive kørt på kompensationsperler.

CD31::FITC (μg) CD45::FITC (μg) Sca-1::APC (μg)* VCAM-1::P E (μg) SYTOX Blå
(μM; Endelig koncentration)
Ikke-farvet kontrol
-- -- -- -- --
Enkelt-farvede kontroller
SYTOX blå (levedygtighedskontrol) -- -- -- -- 1
CD31 &CD45 0.5 0.25 -- -- 1
Sca-1 -- -- 0.25 -- 1
VCAM-1 -- -- -- 0.25 1
Fluorescens Minus One (FMO)
CD31 &CD45 -- -- 0.25 0.25 1
Sca-1 0.5 0.25 -- 0.25 1
VCAM-1 0.5 0.25 0.25 -- 1
Eksperimentelle prøver
Fuld plet 0.5 0.25 0.25 0.25 1

Tabel 2: Flow cytometri antistof farvning matrix. Antistofmængden til farvning af eksperimentelle og kontrolprøver for flowcytometri er vist. Al farvning udføres i et samlet volumen på 100 μL vaskebuffer. *Den optimale mængde selvkonjugeret Sca-1::APC antistof kan variere afhængigt af det anvendte parti. Alle friskkonjugerede Sca-1::APC-partier skal først valideres ved enkeltfarvning af både kompensationsperler og enkeltcelleaffjedring.

Supplerende fil: Reagens opskrifter. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En optimeret, valideret FAPs isolation protokol for rottemuskel er afgørende for forskere, der ønsker at studere skade modeller, der ikke er muligt i musen af biologiske eller tekniske årsager. For eksempel er mus ikke en optimal dyremodel til at studere kroniske lokale eller neurodegenerative skader som langvarig denervation. Biologisk, den korte levetid og hurtig aldring af mus gør det vanskeligt præcist at afgrænse muskel sequalae på grund af denervation fra den forvirrende faktor aldring. Fra et teknisk synspunkt, den drastisk reducerede muskelmasse på grund af svær atrofi ville være utilstrækkelig til effektiv flow cytometrisk analyse. Faktisk foreslår mus FAPs isolation protokoller gruppering sunde muskler sammen for bedre at øge udbyttet af sorterede FAPs29. Mens dette løser den tekniske barriere for at opnå tilstrækkelig muskelvæv til analyse, det samtidig begrænser forskerne fra at vurdere FAPs på et muskel-specifikt niveau. Da specifikke muskelgrupper varierer i sagens natur i deres fibertype sammensætning, graden af vascularization, og mitokondrie numre47 for eksempel, kombinere flere forskellige muskler til flow cytometrisk analyse forhindrer muskel-specifikke FAPs karakterisering. I modsætning hertil viser vi, at både sund og langsigtet denervated, atrofisk og fibrotisk rotte gastrocnemius giver en tilstrækkelig mængde udgangsmateriale til effektiv flowcytometri. Desuden, i raske prøver, overskuddet af muskler kan yderligere opdeles for flere downstream assays, så forskerne til samtidig analysere cellulære, molekylære, og histologiske træk af samme væv. Endelig, for forsøg manipulere FAPs i skade modeller med terapeutiske, godt valideret analyser af fysisk funktion og gangart i alarm og aktive rotter er tilgængelige21,22,23,24, muliggør seriel vurdering af muskelfunktion uden behov for ophør af dyret.

En vigtig hindring for at skabe en optimeret FAPs isolation protokol for rotten var antistof tilgængelighed. Vores oprindelige tilgang søgte at kopiere antistofpanelet og gating strategi protokoller udbredt i musen1,7,8,9,10,11,12,13,14. Mens kommercielt tilgængelige, konjugeret, flow cytometri-testet, og validerede antistoffer, der genkender rotte var tilgængelige for afstamning markører CD31 og CD45, ingen eksisterede for positive FAPs identificere markører Sca-1 eller PDGFRα, samt for den negative udvælgelse markør ITGA7. Ikkejugatede, primære antistoffer, der er specifikke for disse markører og foregav at være effektive i flowcytometri, var tilgængelige, men af FAPs-markørerne Sca-1 og PDGFRα var kun Sca-1-antistoffet blevet valideret i den offentliggjorte litteratur i flowcytometrianalyse af rotteceller48. Vi valgte derfor Sca-1 som den positive udvælgelsesmarkør for FAPs. Udsigten til at anvende sekundære antistoffer til at afgrænse Sca-1- og ITGA7-markører var ikke mulig af flere årsager, men primært fordi de eneste rottespecifikke antistoffer mod Sca-1 og ITGA7, der var valideret for flowcytometri, blev genereret hos de samme værtsarter. Derfor var den resterende mulighed selvbøjning af begge antistoffer ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits.

Processen med at vælge et optimalt sæt til antistofbøjning var omfattende, da mange kits er helt eller delvist intolerante over for forskellige buffer fortyndingsstoffer (f.eks. glycin, glycerol, BSA, natrium azid) til stede i primære antistoffer. Desuden skal den angivne fluorophore være kompatibel med de lasere, der er udstyret i det flowcytometer/cellesortering, som investigator har til rådighed, og ikke udsendes ved en bølgelængde på samme bølgelængde til andre fluorophorer, der anvendes til at identificere andre celletyper i prøven. Tilstedeværelsen af fortyndingskomponenter i de rottespecifikke PDGFRα primære antistoffer, der var dårligt kompatible med bøjningssæt, var en yderligere overvejelse i valget af Sca-1 som den positive FAPs udvælgelsesmarkør i denne protokol. Mens disse resultater viser, at både Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy7 bøjninger resulterede i identifikation af forskellige positive-farvede populationer på både kompensation perler og celler, førstnævnte viste sig at udvise forfald i fluorescens hurtigere end blev annonceret af producenten. Det anbefales stærkt, at forskere konjugerer Sca-1::APC i henhold til producentens anvisninger, umiddelbart før første gang brug (f.eks dagen før eksperimentet) for at sikre robust signal, planlægge eksperimenter i overensstemmelse hermed, således at et enkelt parti konjugeret antistof kan anvendes inden for antistoffets effektivitetsvindue og validere hvert parti ved enkeltfarvningskompensationsperler og titrere på enkeltcelleophæng. Endnu vigtigere er det imidlertid, at det kritiske samspil mellem Sca-1::APC og ITGA7::P E-Cy7 forhindrede en nøjagtig afgrænsning af populationer af FAPs vs. parlamentsmedlemmer, hvilket nødvendiggjorde, at der blev anvendt en alternativ strategi.

Boscolo Sesillo et al. demonstrerede for nylig den vellykkede flowcytometriske isolering af rottemuskelstamceller ved hjælp af VCAM-1 som en enkelt positiv udvælgelsesmarkør33 i CD31,CD45 og CD11b negative celler. Med VCAM-1 som MP udvælgelse markør, brugte vi en ny antistof panel til at identificere FAPs (Lin-/Sca-1 +/VCAM-1-) og parlamentsmedlemmer (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) og valideret tilgang med in vitro kultur FACS sorteret celler fra sunde gastrocnemius muskel. Frisk isolerede FAPs og parlamentsmedlemmer immun farves udelukkende for deres respektive alternative markører PDGFRα og Pax7. Kultiverede FAPs differentieret i populationer af modne fibroblaster og adipocytter, og parlamentsmedlemmer i modne myocytter / myotubes. Der skete ingen krydskontaminering af faps og parlamentsmedlemmer inden for kulturerne. Immunstaining af histologiske tværsnit bekræftet infiltration af områder af fibro-fedt nedbrydning i denervated muskel med Sca-1 positive celler.

Mens vi påtog flow cytometrisk analyse af langsigtede denervated muskel til at validere vores protokol i alvorligt attrofisk, fibrotisk og fedt-infiltreret muskel, vi i øvrigt observeret fremkomsten af en FAPs subpopulation med øget Sca-1 signal (betegnet Sca-1 High) i forhold til baseline Sca-1 udtryk (betegnet Sca-1 Med / Low) over tid. Sca-1 High FAPs steg betydeligt sent efter denervation (12 uger plus), mens Sca-1 Med / Low FAPs toppede tidligt på 5 uger før faldende tilbage til baseline niveauer. Heterogenitet i FAPs-fænotypen er blevet rapporteret10,30. FAPs med højere Sca-1 udtryk viste sig at differentiere lettere i adipocytter, og når de udsættes for fibrogen stimulation øget udtryk for Col1a130,49. Dynamikken i FAPs sub-populationer observeret her synes at være i overensstemmelse med den tid-løbet af denervation-induceret sequelae og musklens regenerative kapacitet47 og dermed kan karakterisere FAPs sub-populationer med forskellige cellulære programmer. Sca-1 High FAPs bliver up-reguleret på sent tidspunkt-punkter samtidig med fibro / fedt infiltration og et fald i regenerativt potentiale, mens Sca-1 Med / Lav FAPs bliver opreguleret under muskel regenerative vindue og kan støtte i effektiv regenerativ myogenese. FAPs isolation protokol præsenteret her giver efterforskere mulighed for at identificere og isolere disse forskellige befolkninger til fremtidig undersøgelse.

Vi identificerede en population af celler farvning positivt for både Sca-1 og VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) og konstaterede denne dobbelte positive population at være en blanding af FAPs og parlamentsmedlemmer. Adskillelse af denne befolkning ved hjælp af en tredje markør - ITGA7 - var ikke mulig på grund af samspillet mellem Sca-1 og ITGA7 primære antistoffer. Malecova og kolleger rapporterede en underpopulation af VCAM-1 udtrykker FAPs, der er næsten fraværende i sunde muskler, forbigående øget med akut betændelse, og deres vedholdenhed i MDX mus (model af muskelsvind) var forbundet med kronisk muskelbetændelse og fibrose10. I modsætning hertil, og selv om det ikke er en ren FAPs befolkning, fandt vi, at Lin-/Sca-1 +/VCAM-1 + befolkning faldt til eller under baseline niveauer med kronisk muskelfibrose på 12- og 14-ugers post-denervation. Denervation fremkalder ikke de samme inflammatoriske reaktions- og cykelregenereringsforsøg, som mdxmus oplever, hvilket kan forklare forskellene i vores resultater. Vores identifikation af parlamentsmedlemmer i Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+-cellepopulationen er i overensstemmelse med rapporten fra Sca-1-udtrykket om en meget lille andel af parlamentsmedlemmer i sunde muskler med en forbigående stigning efter skade under myoblast-spredning og efterfølgende tilbagetrækning fracellecyklussen 45. Så mens vores antistofmærknings- og FACS-gatingstrategi med succes isolerer rene populationer af FAPs og parlamentsmedlemmer til undersøgelse, kan eksperimenter, der kræver flowcytometribaseret kvantificering af disse populationer, lidt undervurdere deres antal på grund af den lille procentdel af celler i begge stamlinjer, der co-express Sca-1 og VCAM-1. Uanset hvad, den nuværende protokol klart viser den klassiske bifasiske reaktion parlamentsmedlemmer til denervation skade, med kortsigtede upregulation og efterfølgende udtømning af befolkningen i langsigtede denervated muskel. Tilsvarende, stigningen i FAPs rapporteret i isolerede kortere sigt denervation skade er rekapituleret her, og vist sig at være yderligere vedvarende ved hjælp af den langsigtede tibial nerve transection model.

Sammenfattende giver denne protokol forskere et tidligere uudforsket dyr, rotten, hvor man kan bruge flowcytometriske metoder til samtidig at studere FAPs og parlamentsmedlemmer. Eksperimenter med mus begrænset af mængden af skeletmuskulatur og det hyppige behov for at udføre terminale eksperimenter for at vurdere muskelstyrke og funktion, kan let udføres i den større rotte og med et mere omfattende udvalg af ikke-dødelige styrke og funktionelle vurderingsmetoder. Samlet set kan FAPs undersøgelser i rotten afdække nye roller af denne centrale stamfader befolkning i akut og kronisk muskel og perifere nerve traumer og sygdom, efterfølgende øge potentialet for at udvikle celle-specifikke behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Flow cytometri Core Facilities på University of Ottawa og Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto for deres ekspertise og vejledning i optimering af flow cytometri / FACS protokol præsenteret i dette manuskript. Dette arbejde blev finansieret af Medicine af Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) til JB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson --
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson --
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson --
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter --
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Tags

Biologi Udgave 172 mesenkymal stamfader fibro-adipogenic stamfaderer myogene forfædre flowcytometri fluorescens-aktiveret cellesortering FACS skeletmuskulatur kronisk traumatisk denervation rotte muskelatrofi fibrose
Identifikation, isolation og karakterisering af fibro-adipogenic stamfaderer (FAPs) og myogene forfædre (parlamentsmedlemmer) i skeletmuskulatur i rotten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa,… More

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter