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Biology

चूहे में कंकाल मांसपेशी में फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर्स (एफएपी) और मायोजेनिक प्रोजेनिटर्स (सांसदों) की पहचान, अलगाव और लक्षण वर्णन

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/61750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल रैट कंकाल की मांसपेशियों से फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर्स (एफएपी) और मायोजेनिक प्रोजेनिटर्स (एमपीएस) को अलग करने की विधि को रेखांकित करता है। मांसपेशियों की चोट मॉडल में चूहे का उपयोग विश्लेषण के लिए एट्रोफिक मांसपेशी से ऊतक की उपलब्धता में वृद्धि प्रदान करता है और मुक्त चलती जानवरों में मांसपेशियों की ताकत और चाल का आकलन करने के लिए मान्य तरीकों का एक बड़ा प्रदर्शनों की सूची प्रदान करता है।

Abstract

फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर (एफएपी) कंकाल की मांसपेशी में निवासी मध्यवर्ती कोशिकाएं हैं, जो मायोजेनिक प्रोजेनिटर्स (एमपीएस) के साथ मिलकर मांसपेशियों के होमोस्टेसिस, चोट और मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एफएपी की पहचान और अलगाव उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री/फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल और वीवो में आज तक उनके कार्य का मूल्यांकन करने वाले अध्ययन विशेष रूप से चूहों में किए गए हैं । चूहे का बड़ा अंतर्निहित आकार कंकाल मांसपेशियों की चोट मॉडल में FAPs के अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, विशेष रूप से गंभीर रूप से एट्रोफिक मांसपेशियों में या जब जांचकर्ताओं को कई डाउनस्ट्रीम परख का संचालन करने के लिए पर्याप्त ऊतक द्रव्यमान की आवश्यकता होती है। चूहा इसके अतिरिक्त मांसपेशियों के कार्यात्मक परख का एक बड़ा चयन प्रदान करता है जिसमें पशु आँख लेने या बलिदान की आवश्यकता नहीं होती है, इस प्रकार सीरियल आकलन को सक्षम करके रुग्णता और पशु उपयोग को कम किया जाता है। चूहों के लिए अनुकूलित प्रवाह साइटोमेट्री/एफएस प्रोटोकॉल विशिष्ट प्रजातियां हैं, विशेष रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी की विशेषताओं द्वारा प्रतिबंधित हैं । उन्हें चूहे या अत्यधिक फाइब्रोटिक मांसपेशियों से FAPs को अलग करने के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। स्वस्थ और विकृत चूहा कंकाल मांसपेशी दोनों से FAPs और सांसदों की पहचान और अलगाव के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री/FACS प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, सतह मार्कर CD31, सीडी 45, एससीए-1, और VCAM-1 की अंतर अभिव्यक्ति पर निर्भर है । चूहे-विशिष्ट के रूप में, प्रवाह साइटोमेट्री-मान्य प्राथमिक एंटीबॉडी गंभीर रूप से सीमित हैं, एससीए-1 को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी के इन-हाउस संविलियन किए गए थे। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, सफल एससीए-1 संयोजिका की पुष्टि की गई थी, और एफएपी और सांसदों की प्रवाह साइटोमेट्रिक पहचान को कोशिका संस्कृति और FACS-पृथक एफएपी और सांसदों के इम्यूनोस्टेटिंग द्वारा मान्य किया गया था। अंत में, हम लंबे समय तक (14 सप्ताह) चूहा डिनेर्वेशन मॉडल में एक उपन्यास एफएपीएस टाइम-कोर्स की रिपोर्ट करते हैं। यह विधि जांचकर्ताओं को एक उपन्यास पशु मॉडल में FAPs का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करती है।

Introduction

फाइब्रो-एडिपोजेनिक जनक कोशिकाएं (एफएपी) कंकाल की मांसपेशी में निवासी बहुपेंट जनक कोशिकाओं की आबादी है जो मांसपेशियों के होमोस्टेसिस, मरम्मत और पुनर्जनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, और इसके विपरीत, मांसपेशियों की चोट के लिए पैथोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता भी करती हैं। जैसा कि नाम से पता चलता है, FAPs मूल रूप से फाइब्रोब्लास्ट और adipocytes 1 में अंतर करने की क्षमता के साथ एक जनकआबादी के रूप में पहचाने गए थे और पुरानी चोट और रोग में कंकाल की मांसपेशी के फाइब्रो-फैटी घुसपैठ के प्रमुख मध्यस्थों होने के लिए कथित थे । आगे के अध्ययन से पता चला है कि ̈पस ऑस्टियोजेनेसिस और कोंड्रोजेनेसिस 2,3,4में अतिरिक्त रूप से सक्षम हैं . इस प्रकार , वे साहित्य में अधिक मोटे तौर पर मेसेंचिमल या स्ट्रोमल जनक 3, 5 ,6,7,8के रूप में नतमकीतित हैं । तीव्र कंकाल मांसपेशियों की चोट में, FAPs अप्रत्यक्ष रूप से पुनर्योजी मायोजेनेसिस में सक्रिय मांसपेशियों की उपग्रह कोशिकाओं और उनके डाउनस्ट्रीम मायोजेनिक प्रोजेनिटर (सांसदों) समकक्षों के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करने के लिए क्षणिक रूप से प्रसारित करके1,9,10में सहायता करता है। सफल उत्थान के समानांतर, एफएपी को एपोप्टोसिस से गुजरना पड़ता है, जो उनकी संख्या कोबेसलाइन स्तर1, 9,10, 11तकलौटाताहै। इसके विपरीत, पुरानी मांसपेशियों की चोट में, एफएपी प्रो-एपोटोटिक संकेतों को ओवरराइड करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उनके हठ9,10,11 और असामान्य मांसपेशियों की मरम्मत होती है।

वीवो अध्ययनों में सेलुलर और आणविक तंत्रों का मूल्यांकन किया गया है जिसके द्वारा एफएपी ने मांसपेशियों की प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता की है , आज तक 1 ,7,9, 10,11,12,13,14तक मुरीन पशु मॉडलकाउपयोग किया है । जबकि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों इन विश्लेषणों में उपयोग के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं, जानवर के छोटे आकार लंबी अवधि के स्थानीयकृत चोट मॉडल में अध्ययन के लिए ऊतक उपलब्धता सीमा जहां मांसपेशियों शोष गहरा हो सकता है, जैसे दर्दनाक denervation । इसके अलावा, मांसपेशियों की ताकत और शारीरिक कार्य के माप के लिएपूर्व वीवो या सीटू माप की आवश्यकता होती है जो माउस की समाप्ति की आवश्यकता होती है, या वीवो विधियों में, जिन्हें मांसपेशियों के संकुचन प्रदर्शन15, 16,17, 18,19,20 के मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए सर्जरी और/या एक सामान्य संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है । . चूहों में, अच्छी तरह से मान्य और विश्व स्तर पर उपयोग किए जाने वाले मांसपेशी कार्यात्मक विश्लेषण, चाल विश्लेषण (जैसे, सियाटिक फंक्शन इंडेक्स, कैटवॉक विश्लेषण) जैसे अधिक जटिल मोटर व्यवहारों के विश्लेषण के अलावा मौजूद हैं और जागने और अनायास चल रहे जानवरों में किए जाते हैं21,22,23, 24 . यह इसके अतिरिक्त पशु प्रयोग में न्यूनतम रुग्णता के सिद्धांतों और उपयोग किए जाने वाले अनुसंधान जानवरों की संख्या को अनुकूलित करता है। चूहा इस प्रकार FAPs अन्वेषक प्रोटीन और सेलुलर विश्लेषण के लिए अधिक से अधिक घायल मांसपेशियों की मात्रा का जोड़ा लचीलापन और चेतावनी जानवर में मांसपेशियों जटिल स्थिर और गतिशील कार्यात्मक गतिविधि और व्यवहार के धारावाहिक आकलन शुरू करने की क्षमता प्रदान करता है ।

एफएपी को मुख्य रूप से क्रमशः प्रवाह साइटोमेट्री और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) का उपयोग करके पूरे मांसपेशियों के नमूनों से पहचाना गया है और अलग किया गया है। ये लेजर-आधारित परख हैं जो आकार, दानेदारता, और सेल सतह या इंट्रासेलुलर मार्कर25के विशिष्ट संयोजन जैसे विशिष्ट विशेषताओं के आधार पर कई विशिष्ट कोशिका आबादी की पहचान करने में सक्षम हैं। यह कंकाल की मांसपेशी जैसे अंग प्रणाली के अध्ययन में अत्यधिक लाभप्रद है, क्योंकि होमोस्टेसिस और पुनर्जनन जटिल, बहुकारक प्रक्रियाएं हैं जो कोशिका प्रकारों की अधिकता से समन्वित होती हैं। एक मौलिक अध्ययन ने माउस कंकाल की मांसपेशी1में प्रवाह साइटोमेट्रिक विधियों का उपयोग करके FAPs, साथ ही सांसदों की पहचान की। उन्होंने दिखा दिया कि एफएपी प्रकृति में मेसेंचिमल हैं, क्योंकि उनके पास एंडोथेलियल (सीडी 31), हेमेटोपोइटिक (सीडी 45), या मायोजेनिक (इंतेग्रिन-α7 [ITGA7]) मूल से कोशिकाओं के लिए विशिष्ट सतह एंटीजन का अभाव था, लेकिन उन्होंने मेसेंचिमल स्टेम सेल मार्कर एससीए-1 (स्टेम सेल एंटीजन 1)1 को व्यक्त किया और संस्कृति में फाइब्रोजेनिक और एडीपोजनिक में अंतर किया। अन्य अध्ययनों में एक वैकल्पिक स्टेम सेल मार्कर, प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारकरिसेप्टर अल्फा (PDGFRα)2,7,8 और आगे के विश्लेषण की अभिव्यक्ति के आधार पर मांसपेशियों में मेसेंचिमल जनकों के सफल अलगाव का प्रदर्शन किया गया, जिससे पता चला कि ये एफएपी 3 के समान सेलआबादीहोने की संभावना है। एफएपी को अब सामान्य रूप सेप्रवाह साइटोमेट्री में पहचाना जाता है, जिसमें स्का-1 या पीडीजीएफआरवाई को सकारात्मक चयन मार्कर1,9,10, 11,12,13,14,26,27,28,29,30, 31के रूप में कियाजाता है। . पीडीजीएफआरα का उपयोग मानव ऊतक के लिए तरजीही है, हालांकि, मुरीन एससीए-1 के प्रत्यक्ष मानव होमोलॉग के रूप में अभी तक32की पहचान की जानी है। इसके अलावा, अन्य सेल सतह प्रोटीन सांसदों के मार्कर के रूप में सूचित किया गया है (जैसे, VCAM-1), FAPs अलगाव३३के दौरान मायोजेनिक वंश की कोशिकाओं के एक संकेतक के रूप में ITGA7 के लिए एक संभावित विकल्प प्रदान करते हैं ।

जबकि फ्लो साइटोमेट्री/एफएएसएस कंकाल की मांसपेशी1, 9, 10, 11, 13,29में एफएपी की भूमिका और रोगजनक क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली कार्यप्रणाली है, यह तकनीकी रूप से अपने आवश्यक अभिकर्मकों की विशिष्टता और अनुकूलन द्वारा सीमित है। चूंकि फौहों की प्रवाह साइटोमेट्रिक पहचान और एफएपी के अलगाव को विकसित किया गया है और माउसपशु मॉडल1,9,10, 11,29में आयोजित किया गया है, यह उन शोधकर्ताओं के लिए चुनौतियां बन गया है जो अन्य मॉडल जीवों में एफएपी का अध्ययन करना चाहते हैं। कई कारक-जैसे इष्टतम ऊतक आकार को संसाधित किया जाना है, साथ ही अभिकर् ता और/या एंटीबॉडी विशिष्टता और उपलब्धता-इस्तेमाल की गई प्रजातियों के आधार पर अलग है ।

एक उपन्यास पशु मॉडल में FAPs का अध्ययन करने के लिए तकनीकी बाधाओं के अलावा, वे काफी हद तक एक तीव्र, विषाक्त सेटिंग में अध्ययन किया गया है-आमतौर पर इंट्रामस्क्युलर रासायनिक इंजेक्शन या कार्डियोटॉक्सिन के माध्यम से । FAPs की दीर्घकालिक गतिशीलता का मूल्यांकन मुख्य रूप से ड्यूचेर्न की मस्कुलर डिस्ट्रॉफी में मूल्यांकन तक सीमित है, एमडीएक्स माउस मॉडल9,10, 11,और संयोजन मांसपेशियों की चोट के मॉडल जैसे बड़े पैमाने पर रोटेटर कफ आंसू जहां समवर्ती टेंडन ट्रांसेक्शन और डिनेर्वेशन कंधे पर किया जाता है26,27,28 . क्रोनिक ट्रॉमेटिक डिनेर्वेशन के एकमात्र अपमान के लिए एफओपी की प्रतिक्रिया, भारी उद्योग, कृषि में काम-स्थान दुर्घटनाओं में एक आम घटना, और जन्म के आघात (ब्रैचियल प्लेक्सस चोट)34,35,36,37 महत्वपूर्ण रुग्णता के साथ, के रूप में अच्छी तरह से विशेषता नहीं है, अक्सर एक अल्पकालिक समय सीमा11,38तक सीमित है।

हम चूहे में संभावित और फाइब्रोटिक कंकाल की मांसपेशी को स्वस्थ होने के साथ-साथ गंभीर रूप से एट्रोफिक और फाइब्रोटिक कंकाल मांसपेशी से एफएपी और सांसदों की पहचान करने और अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, CD31-/CD45-/Sca-1 +/VCAM-1-FAPs और CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1 + सांसदों की पहचान एक ऊतक पाचन और प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाता है और हमारे निष्कर्षों के बाद सत्यापन संस्कृति और facs-अलग सेल के लक्षण के माध्यम से किया जाता है । इस विधि का उपयोग करके, हम चूहे में दीर्घकालिक पृथक डिनेर्वेशन इंजरी मॉडल में एक उपन्यास एफएपी टाइम-कोर्स की भी रिपोर्ट करते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल का संचालन करने वाले जांचकर्ताओं को अपने स्थानीय पशु नैतिकता बोर्ड/देखभाल समिति से अनुमति प्राप्त करनी चाहिए । सभी पशु काम सेंट माइकल अस्पताल एकता स्वास्थ्य टोरंटो पशु देखभाल समिति (एसीसी #918) द्वारा अनुमोदित किया गया था और पशु देखभाल पर कनाडा के परिषद (CCAC) द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था । दृष्टि साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है । यदि डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन FACS और बाद की सेल संस्कृति है, तो सभी चरणों को उचित एसेप्टिक तकनीक के साथ पूरा किया जाना चाहिए।

1. मांसपेशियों की कटाई

  1. स्थानीय विवारियम और पशु नैतिकता बोर्ड के दिशा-निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त संवेदनाहारी और बलिदान का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें। यह प्रोटोकॉल वयस्क मादा लुईस चूहों (200-250 ग्राम) से गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी को एक उदाहरण के रूप में काटता है। चूहों को 2-3% आइसोफलुरेन का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड किया गया था और T61 के इंट्राकार्डिएक इंजेक्शन द्वारा बलिदान किया गया था।
  2. एक बार जब जानवर की बलि दे दी गई है, तो मांसपेशियों के स्थान को सुविधाजनक बनाने के लिए पूरे हिंडलिम्ब को शेव करें और काटे गए ऊतकों के संकुचन को कम करें।
  3. बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, त्वचा में दो चीरे बनाएं: पहला टखने के जोड़ की परिधि के आसपास और दूसरा टखने से कूल्हे तक हिंडलिब के मध्यभाग की मिडलाइन।
  4. अंतर्निहित गैस्ट्रोकनेमियस को प्रकट करने के लिए त्वचा और सतही मांसपेशियों की परतों को वापस छीलें, जो फीमर के मध्याख्वात्मक और पार्श्व condyles में निकलती है और दुखती कण्डरा पर आवेषण करती है।
  5. आसपास के ऊतकों से गैस्ट्रोकनेमियस को अलग करने के लिए कुंद विच्छेदन का उपयोग करें, मांसपेशियों को केवल टेंपर द्वारा संभालें ताकि क्रश चोट से बचा जा सके।
  6. तीखी कैंची के साथ संभव के रूप में दुखती कण्डरा को पार करके गैस्ट्रोकनेमियस को इसके सम्मिलन से अलग करें। एक बार कटौती करने के बाद, दुखती कण्डरा को संदंश के साथ समझें और गैस्ट्रोकनेमियस को अंडरलेइंग हड्डी से धीरे-धीरे छील लें। अभी भी एक हाथ में संदंश के साथ मांसपेशियों को पकड़े हुए, गैस्ट्रोस्नेमियस के दो मूल का पता लगाएं और मध्य और पार्श्व फीमेल कॉन्डील में कटौती करें।
  7. जितना संभव हो उतना रक्त हटाने के लिए धुंध के बाँझ टुकड़े के खिलाफ धीरे से उत्पादित गैस्ट्रोकनेमियस दाग। एक बाँझ सतह पर मांसपेशियों को ट्रिम करें और किसी भी अतिरिक्त संयोजी ऊतक के साथ-साथ दुखती कण्डरा को हटा दें।
  8. एक वजन नाव में मांसपेशियों प्लेस और एक सटीक पैमाने का उपयोग कर वजन। यह प्रोटोकॉल 200-600 मिलीग्राम से लेकर गीले वजन के साथ मांसपेशियों को पचाने के लिए अनुकूलित है। ऑपरेटरों अन्य डाउनस्ट्रीम परख के लिए अतिरिक्त काटा ऊतक उपविभाजित कर सकते हैं, यदि वांछित।
  9. धीरे-धीरे काटा हुआ मांसपेशी को प्रवाह साइटोमेट्री के लिए 3-4 छोटे टुकड़ों (लगभग 1-2 सेमी3)में उपयोग किया जाता है और बर्फ-ठंड 1x पीबीएस में डूब जाता है। बर्फ पर ठंडा रखें जब तक कि सभी नमूने काटे न जा लें।

2. मांसपेशियों का पाचन

  1. पीबीएस से मांसपेशी निकालें और एक बाँझ 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान में जगह है। धीरे-धीरे आंसू और संदंश के साथ कीमा ऊतक जब तक टुकड़े लगभग 3-4 मिमी3हैं, जितना संभव हो उतना संयोजी ऊतक को हटाने। एक बार अच्छी तरह से कीमा बनाया हुआ, एक बाँझ 50 एमएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 6 एमएल डीएमईएम + 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) होता है।
  2. कोलेजन एंजाइम को सक्रिय करने के लिए कोलेजन II समाधान (स्टॉक एकाग्रता 4800 यू/एमएल) के 365 माइक्रोन के 300 एमसीएम सीएसीएल2 समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें। ऊतक घोल युक्त 50 एमएल शंकु नली में सक्रिय कोलेजन II समाधान जोड़ें। अंतिम कोलेजनै द्वितीय एकाग्रता २५० यू/एमएल है ।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, 240 x ग्रामपर 1 घंटे के लिए एक शेकर में ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, जिससे ट्यूब के किनारे का पालन करने वाले किसी भी ऊतक को उखाड़ फेंकने के लिए हर 15 मिनट में मैन्युअल रूप से चक्कर लगाना सुनिश्चित हो।
  4. 1 घंटे के बाद, शेखर से ट्यूबों को हटा दें और प्रति नमूना निम्नलिखित जोड़ें: कोलेजनस II (4,800 यू/एमएल) के 100 माइक्रोन और 50 माइक्रोन डिस्पास (4.8 यू/एमएल)।
  5. जब तक समाधान समरूप न हो, तब तक 15-20 बार सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पिपेट नमूने। यदि कई नमूनों को संसाधित करते हैं, तो नमूना क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक अलग बाँझ पिपेट का उपयोग करें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस और 240 x ग्रामपर 30 मिनट के लिए एक शेखर में फिर से इनक्यूबेट। 15 मिनट के बाद, ट्यूब के किनारे से अनुयायी ऊतक को उखाड़ फेंकने के लिए हाथ से नमूने हिलाएं।

3. एकल सेल निलंबन की पीढ़ी

  1. धीरे-धीरे 10 चक्रों के लिए 20 जी सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज के माध्यम से नमूने कतरनी।
    नोट: एक चक्र सिरिंज में मांसपेशियों के समाधान लेने शामिल है, और यह ट्यूब में वापस इंजेक्शन । धीरे-धीरे कतरनी को पूरा करके किसी भी बुलबुले को कम करना सुनिश्चित करें, क्योंकि अत्यधिक झाग अतिरिक्त सेल डेथ39का कारण बन सकता है।
  2. एक बाँझ 50 एमएल शंकु नली पर 40 माइक्रोन सेल छन्नी रखें और इसे 5 एमएल डीएमईएम + 10% एफबीएस और 1% पी/एस द्वारा गीला करें।
  3. सेल छन्नी के माध्यम से एक बार में नमूने का पिपेट 1 एमसीए।
  4. ट्यूब में कुल मात्रा को 25 एमएल तक लाने के लिए छलनी के माध्यम से 10% एफबीएस और 1% पी/एस के साथ डीएमईएम को पाइपिंग करके सेल छन्नी को धोएं ।
  5. नमूने के 25 एमएल को समान रूप से दो 15 एमएल शंकु नलियों और सेंट्रलाइज में 15 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 400 एक्स ग्राम में विभाजित करें।
    नोट: मांसपेशियों के समाधान को दो 15 एमएल शंकु नलियों में विभाजित करना एक ट्यूब की तुलना में अपकेंद्रित्र के बाद बेहतर सेल रिकवरी सुनिश्चित करता है।
  6. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और एरिथ्रोसाइट्स को खत्म करने के लिए 7 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1 एमसीएल 1x आरबीसी लाइसिस बफर (पूरक फ़ाइलदेखें) में गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. 9 एमएल वॉश बफर (सप्लीमेंट्री फाइलदेखें) और स्पिन ट्यूब्स के साथ 10 एमएल तक वॉल्यूम को 400 एक्स जी,15 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए लाएं।
  8. 1 एमएल वॉश बफर में फिर से निलंबित करके सुपरनेट और रिकॉम्बाइन छर्रों को एस्पिरेट करें।
  9. कोशिकाओं की एक उपयुक्त मात्रा को एक अलग 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्राइपैन ब्लू डाई के साथ मिलाएं। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके हल्के माइक्रोस्कोप पर लाइव कोशिकाओं को गिनें।

4. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एंटीबॉडी धुंधला

नोट: Sca-1 एंटीबॉडी निर्माता के निर्देशों के अनुसार, साइटोमेट्री/FACS प्रयोगों प्रवाह से पहले एपीसी को संयोजित किया जाना चाहिए । प्रत्येक बैच के संघ(चित्रा 2)के लिए प्रदर्शन को मान्य किया जाना चाहिए। अंतिम conjugations -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 μL aliquots में संग्रहीत किया जा सकता है और तीन सप्ताह के लिए स्थिर हैं। पूर्ण संवितरण प्रोटोकॉल के लिए अनुपूरक फाइल का उल्लेख करें।

  1. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए, 1-2 x 106 कोशिकाओं को प्रति प्रयोगात्मक नमूने को बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। वॉश बफर और बर्फ पर जगह के साथ 1 एमएल तक वॉल्यूम लाएं।
  2. प्रत्येक प्रयोग के लिए, लाइव सेल आबादी के लिए सही चयन करने के लिए निम्नलिखित आवश्यक नियंत्रण स्थापित करें: i) अन दागदार और ii) व्यवहार्यता नियंत्रण; iii) सीडी 31-/सीडी 45-अंशों, FAPs, और सांसदों के लिए सटीक द्वार स्थापित करने के लिए एकल सेल निलंबन पर फ्लोरेसेंस माइनस एक (एफएमओ) नियंत्रण; और iv) चैनलों के बीच फ्लोरेसेंस स्पिलओवर के लिए सही करने के लिए एकल-दाग मुआवजा मोती।
    1. सभी सेल नियंत्रण के लिए, एलिकोट 5 x 105 - 1 x 106 कोशिकाओं में वॉश बफर के 1 एमएल में 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में और बर्फ पर रखें।
    2. मनका नियंत्रण के लिए, प्रत्येक लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सकारात्मक क्षतिपूर्ति मोतियों (~ 1.5 x 105 5 मोतियों प्रति बूंद) की 1 बूंद जोड़ें। नियंत्रणों का पूर्ण पूरक तालिका 1में सूचीबद्ध है।
      नोट: यदि प्रयोग पहली बार किया जा रहा है, एकल सेल निलंबन पर प्रत्येक संयुक्त एंटीबॉडी के लिए एकल दाग नियंत्रण चलाने के लिए (अन दाग, व्यवहार्यता, एकल दाग मुआवजा मनका और एफएमओ नियंत्रण के अलावा) कोशिकाओं में सकारात्मक दाग आबादी का आकलन करने और मुआवजा मोतियों पर देख धुंधला मान्य । हर हौसले से संयुग्मित Sca-1:: मुआवजा मोती और एकल सेल निलंबन पर एकल धुंधला प्रदर्शन करके एपीसी तैयारी मान्य । धुंधला नियंत्रण की एक पूरी सूची के लिए तालिका 1 को देखें।
  3. व्यवहार्यता नियंत्रण तैयार करने के लिए, कोशिकाओं की मात्रा का आधा "व्यवहार्यता" ट्यूब से एक नई 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस ट्यूब को "डेड" लेबल करें।
  4. कोशिकाओं को मारने के लिए 2-3 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर "मृत" ट्यूब को इनक्यूबेट करें, फिर बर्फ पर रखें। 2-3 मिनट के बाद, मृत कोशिकाओं को फिर से वायबिलिटी कंट्रोल ट्यूब में शेष जीवित कोशिकाओं के साथ जोड़ दें। कोशिकाओं की इस आबादी को मुआवजा मूल्यों (यदि आवश्यक हो) और उचित रूप से व्यवहार्यता डाई के लिए फाटक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  5. 500 x ग्राम,5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एकल कोशिका निलंबन (प्रयोगात्मक नमूने और नियंत्रण) को सेंट्रलाइज करें।
  6. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और 100 माइक्रोन वॉश बफर में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  7. प्रयोगात्मक नमूने या नियंत्रण के आधार पर एंटीबॉडी जोड़ें। एंटीबॉडी संयोजन और मात्रा के बारे में जानकारी के लिए धुंधला मैट्रिक्स(तालिका 2)को देखें।
  8. 15 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर पूर्ण मिश्रण और इनक्यूबेट सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक नमूने को धीरे से झटका दें। मुआवजे के मोतियों के लिए, 15 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  9. एकल सेल निलंबन प्रायोगिक और नियंत्रण नमूनों के लिए, 900 माइक्रोन वॉश बफर जोड़कर वॉल्यूम को 1 एमसीएल तक लाएं। मुआवजा मनका नियंत्रण के लिए, 1x पीबीएस के 900 माइक्रोन के साथ 1 एमसीएल तक वॉल्यूम लाएं।
  10. 500 x ग्राम,5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज सिंगल सेल सस्पेंशन नमूने। सेंट्रलाइज मुआवजा मनका 300 x ग्राम,5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रण करता है।
  11. सभी एकल सेल निलंबन नमूनों के लिए, 300 माइक्रोन वॉश बफर में सुपरनेट और डिस्कनेंट को फिर से निलंबित करें और सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें। मुआवजे के लिए मनका नियंत्रण, एस्पिरेट और सुपरनैंट त्यागें, 1x पीबीएस के 300 माइक्रोल में गोली को फिर से निलंबित करें, फिर नकारात्मक क्षतिपूर्ति मोतियों की 1 बूंद (~ 1.5 x10 5)जोड़ें।
  12. एल्यूमीनियम पन्नी के तहत बर्फ पर सभी एकल सेल निलंबन नमूने रखें और साइटोमेट्रिक अधिग्रहण प्रवाह के लिए आगे बढ़ें। मुआवजा मनका नियंत्रण भी प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए, लेकिन कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है ।
    नोट: यदि प्रयोगात्मक एंडपॉइंट फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एफएपी पहचान है, तो कृपया चरण 5.1.1-5.1.11 का पालन करें। यदि एंडपॉइंट संस्कृति और धुंधला के लिए FACS के माध्यम से सेल अलगाव है, तो कृपया चरण 5.2.1-5.2.9 और वर्ग 6-7 का पालन करें।

5. फ्लो साइटोमेट्री और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS)

  1. फ्लो साइटोमेट्री
    नोट: यह प्रोटोकॉल 405 एनएम, 488 एनएम और 640 एनएम लेजर से लैस एक बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर को नियोजित करता है जो एक साथ 10 अलग-अलग रंगों को अलग करने में सक्षम हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बैंडपास फिल्टर और उनके संबद्ध फ्लोरोक्रोम इस प्रकार हैं- 450/50 (SYTOX ब्लू), 530/30 (फिटसी), 575/25 (पीई), और 670/30 (एपीसी)। प्रत्येक डिटेक्टर के लिए वोल्टेज इस प्रकार हैं: एफएससी 700; एसएससी 475; फिटसी 360; पीई 460; पीई-Cy7 600; SYTOX ब्लू 360; एपीसी 570। सुनिश्चित करें कि आप उपयोग करने से पहले प्रवाह साइटोमीटर या सेल सॉर्टर के उचित संचालन पर प्रशिक्षित हैं।
    1. सुनिश्चित करें कि साइटोमीटर को उपयोग से पहले 10-20 मिनट के लिए चालू किया गया है और 30-45 एस प्रत्येक के लिए साफ, कुल्ला और म्यान द्रव समाधानों के साथ क्रमिक रूप से सफाई करके प्रिंकेट किया गया है। डीएच2ओ के साथ कुल्ला के साथ समाप्त करें सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण के दौरान उचित नमूना प्रवाह बनाए रखने के लिए भंडारण कंटेनर में म्यान तरल पदार्थ की पर्याप्त मात्रा जोड़ी गई है।
    2. एफएप और सांसदों की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति तय करें , जो चित्र 3में चित्रित किया गया है ।
      नोट: एफएपी और सांसदों की पहचान निम्नलिखित पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति द्वारा की जाती है: i) एसएससी-ए बनाम एफएससी-ए (साइड सेल स्कैटर एरिया बनाम फॉरवर्ड सेल स्कैटर एरिया टू अलग सेल बनाम मलबा), ii) एफएससी-डब्ल्यू बनाम एफएससी-एच (फॉरवर्ड सेल स्कैटर चौड़ाई बनाम फॉरवर्ड सेल स्कैटर हाइट एफएससी पैरामीटर में डबल्स से सिंगल्स को भेदभाव करने के लिए, iii) एसएससी-डब्ल्यू बनाम एसएससी-एच (साइड सेल स्कैटर चौड़ाई बनाम साइड सेल स्कैटर हाइट एसएससी पैरामीटर में डबल्स से सिंगल्स को भेदभाव करने के लिए), iv) एसएससी-ए बनाम SYTOX ब्लू (लाइव बनाम डेड सिंगल्स को अलग करने के लिए), v) एसएससी-ए बनाम सीडी31/45::फिटसी (सीडी 31 + और सीडी 45 + कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण से बाहर करने के लिए), और vi) एससीए-1::: एपीसी बनाम वीसीएएम-1::P सीडी 31/CD45-(वंश से। लिन-) जनसंख्या (FAPs और सांसदों की पहचान) । FAPs की पहचान CD31-/CD45-/Sca-1 +/VCAM-1-घटनाओं के रूप में की जाती है और सांसदों की पहचान CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1 + घटनाओं के रूप में की जाती है ।
    3. पहले कम गति पर साइटोमीटर के माध्यम से प्रत्येक एकल दाग मुआवजा मनका नियंत्रण चलाने के लिए चैनलों के बीच किसी भी फ्लोरेसेंस स्पिलओवर के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल मुआवजा मूल्यों को उत्पन्न करने के लिए । अपने डिटेक्टर में प्रत्येक नियंत्रण के फ्लोरोसेंट सिग्नल की तुलना करके मुआवजे का आकलन करें (उदाहरण के लिए, एसएससी-ए बनाम एपीसी एससीए-1 के लिए:: एपीसी एकल-दाग मोती) के साथ-साथ अन्य सभी डिटेक्टरों। उपयुक्त डिटेक्टर में दो अलग-अलग आबादी (एक नकारात्मक और सकारात्मक संकेत के साथ एक) और अन्य सभी डिटेक्टरों में केवल एक नकारात्मक आबादी होनी चाहिए। 10,000 मुआवजा मनका घटनाओं के लिए रोक गेट सेट और डेटा रिकॉर्ड।
      नोट: प्रत्येक नमूने के अधिग्रहण के बीच में, नमूना-से-नमूना संदूषण से बचने के लिए10-20सेकंड के लिए साइटोमीटर के माध्यम से डीएच 2 ओ चलाना सुनिश्चित करें।
    4. अगली प्रक्रिया जीवित एकल कोशिकाओं पर ठीक से गेट करने के लिए अन दाग और व्यवहार्यता नियंत्रण नमूनों। 10,000 सिंगलेट इवेंट्स और रिकॉर्ड डेटा के लिए स्टॉपिंग गेट सेट करें।
      नोट: अन दाग नमूने के अपवाद के साथ प्रत्येक एकल कोशिका निलंबन नमूने के अधिग्रहण से लगभग 5 मिनट पहले, SYTOX ब्लू व्यवहार्यता डाई (300 माइक्रोन काम एकाग्रता 1 mm स्टॉक समाधान से पतला) प्रत्येक नमूना और मिश्रण करने के लिए धीरे झटका (अंतिम एकाग्रता 1 μM) के 1 μL जोड़ें।
    5. फिर शेष एकल सेल निलंबन नियंत्रण नमूनों का अधिग्रहण करें। गेटिंग रणनीति(चित्रा 3)में अपने उपयुक्त भूखंड के साथ प्रत्येक एफएमओ नियंत्रण का आकलन करें। उदाहरण के लिए, एक सटीक सीडी 31-/सीडी 45-गेट सुनिश्चित करने के लिए CD31+ CD45 FMO के FITC संकेत का आकलन करें । चित्रा 3जीमें एक इष्टतम उदाहरण दिखाया गया है । यदि प्रोटोकॉल पहली बार किया जा रहा है, कोशिकाओं पर एकल दाग नियंत्रण FMO नियंत्रण के अधिग्रहण से पहले चलाया जाना चाहिए ।
    6. उचित मुआवजे को मान्य करने के लिए अपने उपयुक्त डिटेक्टर के साथ-साथ अन्य सभी डिटेक्टरों में प्रत्येक एकल-दाग सेल नमूने के फ्लोरोसेंट सिग्नल का आकलन करें। 10,000 लाइव सिंगलेट इवेंट और सॉफ्टवेयर पर रिकॉर्ड करने के लिए स्टॉपिंग गेट सेट करें।
    7. एक बार सभी नियंत्रण (एकल सेल निलंबन और मोती) संसाधित किया गया है, पहले मापने और प्रत्येक नमूने की मात्रा रिकॉर्डिंग द्वारा सभी प्रयोगात्मक नमूनों को तैयार करते हैं । इन मापनों का उपयोग 5.111 चरण में वर्णित FAPs और सांसदों को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए किया जाएगा। फिर, 50 माइक्रोल सटीक गिनती मोतियों को जोड़ें और धीरे-धीरे 2-3 बार ऊपर और नीचे पिपिंग करके मिलाएं।
    8. संक्षेप में गिनती मनका आबादी की पहचान को मान्य करने के लिए पहला प्रयोगात्मक नमूना चलाते हैं। यह आबादी एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए प्लॉट(चित्रा 3 ए,रेड बॉक्स) पर सामान्य सेल आबादी से अलग एक छोटे से अलग क्लस्टर के रूप में दिखाई देती है। गिनती मनका आबादी के आसपास एक गेट बनाएं। फिर कम गति पर साइटोमीटर के माध्यम से प्रसंस्करण करके प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के लिए डेटा प्राप्त करें। 10,000 गिनती मनका घटनाओं और रिकॉर्ड करने के लिए रोक गेट सेट करें।
      नोट: जांचकर्ता वैकल्पिक रूप से एसएससी-ए बनाम किसी भी डिटेक्टर का आकलन करने वाले अतिरिक्त भूखंड की स्थापना करके मोतियों की गिनती की पहचान कर सकते हैं, क्योंकि गिनती के मोती सभी डिटेक्टरों में फ्लोरोसेंट हैं ।
    9. सभी नमूनों को संसाधित करने के बाद, उपयुक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके साइटोमीटर को साफ करें। विश्लेषण के लिए सभी डेटा निर्यात करें।
    10. एक उपयुक्त प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर सभी डेटा फ़ाइलों को खोलें। चरण 5.1.2 में वर्णित डेटा अधिग्रहण के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति निर्धारित करें। गेटिंग रणनीति को फिर से मान्य करने के लिए डेटा अधिग्रहण (उदाहरण के लिए, अन दाग, व्यवहार्यता, एकल दाग, फिर एफएमओ नियंत्रण) के समान क्रम में नियंत्रण की जांच करें। एक बार सटीक फाटक FMO नियंत्रण का उपयोग कर सेट किया गया है, सभी प्रयोगात्मक नमूनों के लिए फाटक लागू होते हैं । मात्राकरण के लिए स्प्रेडशीट के रूप में कच्चे डेटा का निर्यात करें।
    11. गिनती मोतियों का उपयोग कर प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने में FAPs और सांसदों की संख्या की गणना:
      Equation 1
      जहां, अधिग्रहीत सेल काउंट अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर प्रासंगिक सेल आबादी (जैसे एफएपी या सांसद) की रिकॉर्ड की गई घटनाओं की संख्या है; अधिग्रहीत मनका गिनती अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर मोतियों की गिनती की रिकॉर्ड की घटनाओं की संख्या है; मोतियों की मात्रा की गिनती मनका समाधान की गिनती की मात्रा है जो चरण 5.1.7 में जोड़ा गया है; नमूना मात्रा मोतियों की गिनती के अलावा से पहले प्रत्येक दाग प्रयोगात्मक नमूने की मात्रा है.; मनका एकाग्रता प्रति मोँहल समाधान मोतियों की संख्या है; यह मूल्य उत्पाद डेटाशीट पर पाया जाता है।
  2. FACS - सेल संस्कृति के लिए छंटाई
    नोट: यह प्रोटोकॉल 4 लेजर (यूवी, वायलेट, ब्लू, रेड) से लैस सेल सॉर्टर पर FACS करता है जो एक साथ 11-14 रंगों को अलग करने में सक्षम है। एफएएफएस वर्कफ़्लो को अनुकूलित करने के लिए नीचे दिए गए चरण 1 से 3 चित्रित चरणों के अपवादों के साथ प्रयोगात्मक नमूना धुंधला (धारा 4) और प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का पालन करें:
    1. प्रायोगिक नमूनों में कोशिकाओं की एकाग्रता को बढ़ाकर 7 x 106 कोशिकाओं/एमएल को हल किया जाए ताकि फासियों और सांसदों की मजबूत पैदावार पैदा की जा सके ।
    2. कोशिका एकाग्रता में इस महत्वपूर्ण वृद्धि के लिए खाते में, प्रायोगिक नमूनों में सभी एंटीबॉडी सांद्रता को हल करने के लिए दोगुना करें।
    3. सेल झुरमुट को कम करने और सॉर्ट पैदावार बढ़ाने के लिए छंटाई करने से तुरंत पहले 5 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब से चिपके 40 माइक्रोन सेल छन्नी टोपी के माध्यम से अंतिम दाग सेल नमूनों की प्रक्रिया करें।
    4. एकल, लाइव चूहा FAPs और सांसदों को सीधे सेल सॉर्टर से 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन संग्रह ट्यूब में ले जाएं जिसमें बाँझ, 100% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का 1 मिलियनल होता है। छंटाई पूरी होने तक कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
      नोट: यदि किसी ऑफ-साइट स्थान पर FACS का संचालन करते हैं, तो बर्फ पर और एक सुरक्षित, कवर कंटेनर में सभी सॉर्ट की गई कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    5. बाँझ जैवसेफ्टी कैबिनेट (बीएससी) में कार्य करना, उचित विकास मीडिया (उदाहरण के लिए, 7 एमएल तक सॉर्ट्ड कोशिकाओं की मात्रा लाता है, हल किए गए एफएपी के लिए एफएपी ग्रोथ मीडिया (एफएपी जीएम), और हल किए गए सांसदों के लिए एमपी ग्रोथ मीडिया (एमपी जीएम), व्यंजनों के लिए पूरक फाइल देखें) और 500 x g पर सेंट्रलाइज, 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस जितना संभव हो उतना अवशिष्ट वॉश बफर को हटाने के लिए।
    6. उचित विकास मीडिया और प्लेट के 1 एमसीएल में 1 मिलियन छर्रों को एक बाँझ, कोलेजन-लेपित 12 मिमी ग्लास कवरस्लिप/बाद में इम्यूनोस्टेटिंग के लिए अच्छी तरह से (धारा 6 देखें) में रेशपेंड छर्रों।
      नोट: यदि कोलेजन के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री धुंधला, प्लेट एक 12 अच्छी तरह से एक बाँझ, लेमिनिन लेपित 12 मिमी ग्लास कवरस्लिप/अच्छी तरह से युक्त थाली में कोशिकाओं को हल, के बजाय कोलेजन लेपित । यदि तुरंत अलग-थलग जनकों के इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रयोगों की आवश्यकता होती है, तो प्रति सेमी2 15,000 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज FAPs और सांसदों और सीधे 6.1 कदम पर आगे बढ़ें। दीर्घकालिक संस्कृतियों के लिए जनक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, प्रति सेमी25,000 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज FAPs, और सांसदों प्रति सेमी2प्रति 7,500 कोशिकाओं के घनत्व पर।
    7. एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट सेल। संस्कृति में ७२ घंटे के बाद, मीडिया के आधे बदल जाते हैं । मीडिया को पूरी तरह से हर 2-4 डी के बाद बदलें।
    8. मायोसाइट विकास को प्रेरित करने के लिए, संस्कृति के दिन 9 पर सांसद संस्कृतियों को एमपी विभेदन (एमडी) माध्यम में स्विच करें। एडिपोसाइट्स को प्रेरित करने के लिए, संस्कृति के दिन 10 पर एफएपी संस्कृतियों को एफएपी एडिपोजेनिक विभेदन (एडी) माध्यम में स्विच करें।
    9. फाइब्रोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, एफएपी को संस्कृति के दौरान चर समय पर फाइब्रोजेनिक विभेदन (एफडी) मीडिया में बंद किया जा सकता है, या वैकल्पिक रूप से, अलगाव (चरण 5.2.6) (सभी मीडिया व्यंजनों के लिए पूरक फ़ाइल देखें) के बाद सीधे एफडी मीडिया में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है।

6. सुसंस्कृत FAPs और सांसदों की इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

  1. सेल छंटाई को मान्य करने और FAPs और सांसदों संस्कृतियों की शुद्धता का प्रदर्शन करने के लिए, PDGFRα (FAPs मार्कर), पैक्स-7 (मांसपेशी स्टेम [उपग्रह] सेल मार्कर), फाइब्रोब्लास्ट-विशिष्ट प्रोटीन (FSP-1, फाइब्रोब्लास्ट मार्कर), पेरिमिलिपिन-1 (प्लिन-1, एडीपोसाइट मार्कर), कोलेजन टाइप 1 (Col1a1, फाइब्रोसिस के संकेतक), Myosin भारी चेन (MHC, परिपक्व, myocyte मार्कर) सहित सेल प्रकार विशिष्ट मार्कर के साथ इम्यूनोदाता
    1. हौसले से हल कोशिकाओं के इम्यूनोस्टेटिंग के लिए, कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए २०० x ग्राम पर 12 अच्छी तरह से थाली अपकेंद्रित्र को कवरस्लिप/अच्छी तरह से कोशिकाओं के पालन की सुविधा के लिए । यह कदम दीर्घकालिक संस्कृतियों के लिए आवश्यक नहीं है । संस्कृति मीडिया को हटा दें।
    2. एफएसपी-1 के साथ इम्यूनोस्टेटिंग के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1 मिलील 100% मेथनॉल (MeOH) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। यदि PDGFRα, Plin-1, Pax7 या Col1a1 के लिए इम्यूनोस्टेपिंग, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1x PBS में 1 एमसीएल 4% पीएफए के साथ सेल संस्कृतियों को ठीक करें । एमएचसी इम्यूनोस्टेपिंग या तो फिक्सेटिव बर्दाश्त करता है ।
      नोट: मेथनॉल-फिक्स्ड कोशिकाओं के लिए, चरण 6.2 को छोड़ दें और 6.3 चरण के लिए आगे बढ़ें।
  2. 4% पीएफए को एस्पिरेट करें और 1x पीबीएस के साथ 3-4 बार सेल संस्कृतियों को जल्दी से धोएं। 1x पीबीएस में 100 m M Glycine के 1 ml जोड़ें और अवशिष्ट पीएफए को निष्क्रिय करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। 1x पीबीएस के साथ 1-2 बार एस्पिरेट और धोएं।
    नोट: कोशिकाओं को इस स्तर पर 1x PBS के 2 एमएल में छोड़ा जा सकता है, जो चिपकने वाली फिल्म में लिपटा हुआ है और 7-10 दिनों के लिए अधिकतम 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
  3. धोने के बाद, 1x पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स का 1 मिलियन 1 मिलियन जोड़ें और कोशिका झिल्ली को पार करने के लिए 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 1x पीबीएस के 1-2 एमसीएल के साथ 2-3 बार कुओं को धोएं फिर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1x पीबीएस + 3% बीएसए प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें।
  5. 1x PBS + 3% बीएसए (PDGFRα 1:100, Pax7 साफ, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 g/mL) में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के μL पैराफिल्म के एक टुकड़े पर एक मोबाइल कंटेनर के लिए टैप किया । बाँझ ठीक संदंश का उपयोग करना, ध्यान से कवर्लिप को अच्छी तरह से उठाएं और एंटीबॉडी समाधान की बूंद पर उलटा करें। एंटीबॉडी समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए प्लास्टिक फिल्म में कागज तौलिया और कवर कंटेनर के दो गीले टुकड़ों के साथ इनक्यूबेट कवरलिप। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: अच्छी तरह से स्टेनिंग कवर्लिप कुएं के अंदर धुंधला होने की तुलना में कम एंटीबॉडी (~ 80 माइक्रोन) का उपयोग करता है (500 माइक्रोन न्यूनतम)।
  6. 2 दिन पर, गर्म करने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कवरस्लिप छोड़ दें । संदंश का उपयोग सावधानी से सही और हस्तांतरण कवर्लिप्स को अपने संबंधित कुओं (कोशिकाओं का सामना करना पड़ रहा है) वापस करें और 2-3 बार 1x पीबीएस के 1-2 एमएल के साथ 2 मिनट के लिए धोएं ताकि जितना संभव हो उतना प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाया जा सके।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला के साथ के रूप में एक ही धुंधला तकनीक का उपयोग करना, बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर ४८८ माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400) के साथ दाग कोशिकाओं FSP-1, प्लिन-1, Col1a1, या PDGFRα और बकरी विरोधी माउस एलेक्सा फ्लोर ५५५ माध्यमिक एंटीबॉडी (१:३००) का पता लगाने के लिए MHC या Pax-7 का पता लगाने के लिए । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और कोशिकाओं को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  8. कमरे के तापमान पर 2-4 मिनट के लिए Hoechst (1:10,000) के साथ अच्छी तरह से और इनक्यूबेट कोशिकाओं को वापसी कोशिकाओं । अतिरिक्त Hoechst को दूर करने के लिए 2 मिनट प्रत्येक के लिए 1x PBS के साथ एक और 2-3 बार कोशिकाओं को धोएं ।
  9. माउंट एक विरोधी फीका फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम का उपयोग कर ग्लास स्लाइड पर कवरलिप और कमरे के तापमान पर अंधेरे में रात भर सूखने के लिए स्लाइड छोड़ दें । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर घुड़सवार कवर्लिप स्टोर करें।

7. तेल लाल ओ (ORO) सुसंस्कृत FAPs और सांसदों के धुंधला

  1. गैर-परपीलिजित कोशिकाओं पर ओआरओ धुंधला प्रदर्शन करें, क्योंकि कोशिका झिल्ली के परिव्यय के परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट/अवांछित गैर-आदिपोजेनिक कोशिका प्रकारों का धुंधला हो सकता है। धुंधला शुरू करने से पहले, एक ORO काम कर शेयर तैयार (नुस्खा के लिए पूरक फ़ाइल देखें) और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट ।
  2. 20 मिनट के बाद, किसी भी अवि अनसुलझे समुच्चय को हटाने के लिए 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें।
  3. मीडिया को अच्छी तरह से एस्पिरेट करें और 10% न्यूट्रल बफर फॉर्मेलिन (10% एनबीएफ) के 1 एमसीएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: सेल मेंल्फ्यूलेंसी के परिणामस्वरूप अच्छी तरह से/कवरस्लिप से उठाने में परिणाम हो सकता है । समाधान जोड़ते समय ध्यान रखें।
  4. एस्पिरेट करें और 1 मिलीएल ताजा 10% एनबीएफ जोड़ें और कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है, के रूप में कोशिकाओं को 10% NBF रातोंरात में छोड़ दिया जा सकता है ।
  5. जल्दी से 60% आइसोप्रोपैनॉल के 1 मिलील के साथ एक बार कुओं को धोएं, फिर कुओं को पूरी तरह से सूखने (लगभग 2 मिनट) सूखने दें।
  6. अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 400 μL तेल लाल हे काम कर रहे स्टॉक जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट, थाली की दीवारों पर किसी भी ORO पाइपिंग से बचने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
  7. तेल लाल ओ के सभी निकालें और जल्दी से डीएच 2 ओ के साथ अच्छी तरह से4बार धो ।
    नोट: यदि दाग वाले कुओं में कवर्लिप्स होते हैं, तो चरण 6.9 में वर्णित समान तकनीक का उपयोग करके माउंट करें।
  8. छवि या तो घुड़सवार कवरस्लिप या एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अच्छी तरह से दाग।

8. कॉन्ट्रालेटरल और डीनेरवेटेड रैट गैस्ट्रोकनेमियस वर्गों के ऊतक धुंधला

  1. पिरोसिरियस रेड (पीएसआर)
    1. 5 माइक्रोन-मोटी, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफएपी) रैट गैस्ट्रोकनेमियस हिस्टोलॉजिक सेक्शन पर पीएसआर धुंधला करें जैसा कि पहले40वर्णित है।
  2. तेल लाल ओ (ORO)
    1. 10 मिनट के लिए 4% पीएफए में 5 माइक्रोन-मोटी आइसोपेनटेन-फ्रोजन रैट गैस्ट्रोकनेमियस हिस्टोलॉजिक सेक्शन को ठीक करें, 1 मिनट के लिए 60% आइसोप्रोपिल अल्कोहल में इनक्यूबेट करें।
    2. 12 मिनट के लिए ORO काम कर रहे शेयर के साथ दाग । 1 मिनट के लिए 60% आइसोप्रोपिल अल्कोहल में इनक्यूबेट, पानी में घुलनशील बढ़ते मीडिया का उपयोग करके कवरस्लिप पर डीएच2ओ माउंट में 10 मिनट के लिए धोएं।
  3. एससीए-1 और लेमिनिन ऊतक फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी)
    1. 5 माइक्रोन-मोटी आइसोपेन्टेन-फ्रोजन रैट गैस्ट्रोकनेमियस हिस्टोलॉजिक वर्गों पर फ्लोरोसेंट आईएचसी करें।
    2. 5 मिनट के लिए 1x PBS में हाइड्रेट नमूने, 10 मिनट के लिए 4% पीएफए में ठीक तो ऊतक में नमूने incubate अगर समाधान अवरुद्ध (अनुपूरक फ़ाइलदेखें) ९० मिनट के लिए ।
    3. एंटी-एससीए-1 प्राथमिक एंटीबॉडी (1:500) के साथ इनक्यूबेट 1x पीबीएस + 0.05% ट्वीन में रात 4 डिग्री सेल्सियस पर पतला होता है।
    4. दूसरे दिन, 1x पीबीएस + 0.05% ट्वीन में 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं, फिर बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 555 (1:500) में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 1 घंटे के लिए समाधान को अवरुद्ध करने के साथ फिर से धोएं, फिर 1x पीबीएस + 0.05% ट्वीन में 1x पीबीएस + 0.05% ट्वीन में 1x पीबीएस में पतला एंटी-लैमिनिन प्राथमिक एंटीबॉडी (1:500) जोड़ें।
    6. फिर से धोएं (पहले की तरह), फिर बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 488 (1:500) में 1 एच (लैमिनिन के लिए) के लिए।
    7. फिर से धोएं (पहले की तरह) फिर 4 मिनट के लिए DAPI (1:10,000) में इनक्यूबेट करें। एंटी-फीका बढ़ते माध्यम का उपयोग करके कवरस्लिप पर धोएं और माउंट करें।

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Representative Results

एससीए-1 और वीसीएएम-1 सहित एक उपन्यास एंटीबॉडी पैनल का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से एफएपी और सांसदों की पहचान करना
चूहे की मांसपेशी में FAPs की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति माउस29में प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल पर आधारित है, जो सीडी 31 (एंडोथेलियल) और सीडी 45 (हेमेटोपोइटिक) सकारात्मक कोशिकाओं पर गेट (वंश [लिन] कहा जाता है) और एलेज-निगेटिव (लिन-) आबादी से एफएपीएस मार्कर एससीए-1 और सांसदों मार्कर ITGA7 के फ्लोरोसेंट प्रोफाइल की जांच करता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, फ्लोरोफोर-संयुग्मित, और चूहे एससीए-1 और आईटीजीए7 के लिए साइटोमेट्री-मान्य एंटीबॉडी के अभाव में, हमने चूहे एससीए-1::: एपीसी एंटीबॉडी को स्वयं संयोजित किया, और सांसदों की पहचान करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति बनाई। जैसा कि वीसीएएम-1 को हाल ही में चूहे के सांसदों33 के अलगाव के लिए एक कुशल एकल सकारात्मक चयन मार्कर दिखाया गया था और वीसीएएम-1 को लक्षित करने वाले चूहे-विशिष्ट, संयुग्म, प्रवाह साइटोमेट्री-मान्य एंटीबॉडी उपलब्ध है, हमने ITGA7 के विपरीत सांसदों की पहचान करने के लिए वीसीएएम-1 का उपयोग किया।

हमने स्वस्थ चूहे गैस्ट्रोकनेमियस(चित्रा 2 ए,बी)से उत्पन्न क्षतिपूर्ति मोतियों और सेल निलंबन के एकल धुंधला के साथ एससी एंटीबॉडी के सफल संजीदशन और प्रदर्शन की पुष्टि की। SCA-1:: एपीसी(चित्रा 2C)का पांच सूत्री शीर्षक प्रोटोकॉल (अनुपूरक चित्रा 1) में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल(अनुपूरक चित्रा 1) में उपयोग किए जाने वाले अन्य सभी एंटीबॉडी (सीडी 31::फिटसी, सीडी 45::फिटसी, वीसीएएम-1:पीई) के अलावा किया गया था। इस उपन्यास पैनल डिजाइन का उपयोग करते हुए, ख्यात FAPs और सांसदों को एक साथ स्वस्थ गैस्ट्रोकनेमियस(चित्रा 3)से पहचाना गया था, जिसके तहत SCA-1 (लिन-/एससीए-1 +/VCAM-1-) के लिए एकल सकारात्मक कोशिकाओं को नामित किया गया था । हमने एससीए-1 और वीसीएएम-1 (लिन-/एससीए-1 +/वीसीएएम-1 +)(चित्रा 3F;अपर राइट क्वाड्रेंट) के लिए डबल पॉजिटिव कोशिकाओं की आबादी की भी पहचान की ।

FACS और सेल संस्कृति द्वारा FAPs और सांसदों की पहचान का सत्यापन
चूहे कंकाल की मांसपेशी में FAPs और सांसदों के प्रवाह साइटोमेट्रिक पहचान के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए, हमने विट्रो मेंसंस्कृति के लिए जीवित कोशिकाओं को अलग करने की मांग की। FACS का उपयोग करना, व्यवहार्य FAPs और सांसदों को प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के रूप में एक ही गेटिंग रणनीति का उपयोग करके अलग-थलग कर दिया गया था। लगभग 20,000-40,000 एफएपी और 30,000-50,000 सांसदों को 230 ग्राम चूहे से एक गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी से सेल संस्कृति के लिए एकत्र किया गया था।

प्रत्येक आबादी की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए, हमने पीडीजीएफआरα और पैक्स 7 के लिए नए सिरे से फ़ेस और सांसदों को सह-इम्यूनो दाग दिया। पीडीजीएफआरα स्का-1 के अलावा दूसरा मेसेन्चिमल प्रोजेनिटर मार्कर है, जो आमतौर परएफएपी2,7, 8की पहचान करने के लिए उपयोग कियाजाताहै। पैक्स-7 मांसपेशियों के उपग्रह (स्टेम) कोशिकाओं41का एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त और व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मार्कर है। फैक्स की छंटाई आबादी ने PAx7 सकारात्मक कोशिकाओं(चित्रा 4A,शीर्ष पंक्ति) द्वारा कोई संदूषण नहीं होने के साथ PDGFRα के लिए सकारात्मक धुंधला प्रदर्शन किया। इसके विपरीत, सांसदों की छंटाई PAX7 के लिए सकारात्मक दाग PDGFRα सकारात्मक कोशिकाओं(चित्रा 4A;नीचे पंक्ति) की अनुपस्थिति के साथ, लिन की क्षमता को मान्य-/Sca-1 +/VCAM-1-और लिन/Sca-1-/VCAM-1 + सेल सतह एंटीजन प्रोफाइल क्रमशः FAPs और सांसदों की शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए ।

हमने एडिपोजेनिक, फाइब्रोजेनिक और मायोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए शर्तों में 10-12 दिनों के समय पाठ्यक्रम में एफएपी और सांसदों को आगे जोड़ा। 12 दिन तक, एडिप्स संस्कृतियों में फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान या वसा बूंदों के साथ सफेद पूर्व-एडिपोसाइट्स (डेटा नहीं दिखाए गए) के समान एक फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान वाली कोशिकाएं शामिल थीं। फाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट प्रोटीन-1 (एफएसपी-1) के लिए इम्यूनोस्टेटिंग ने फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव की पुष्टि की, जबकि प्लिन-1 (पेरिलिपिन-1; एक एडिपोसाइट मार्कर)42 और तेल लाल ओ ने क्रमशः आदिपोसाइट्स के भेदभाव और तटस्थ ट्राइग्लिसराइड्स और लिपिड की उपस्थिति की पुष्टि की(चित्रा 4B)। FAPs संस्कृतियों में एक मायोजेनिक वंश से कोशिकाओं को दूषित करने की अनुपस्थिति की पुष्टि सह-इम्यूनोसटेनिंग फॉर मायोसिन हैवी चेन (एमएचसी), विभेदित मायोसाइट्स के एक मार्कर द्वारा की गई थी। फाइब्रोजेनिक भेदभाव (एफडी) के अधीन एफएपी संस्कृतियों का मूल्यांकन कोलेजन टाइप 1 (Col1a1) अभिव्यक्ति के लिए किया गया था, जो मुख्य एफएपीएस-व्युत्पन्न कोलेजन8में से एक है। 11 दिन में Col1a1 और MHC के लिए सह-इम्यूनोदाता ने मजबूत कोलेजन टाइप 1 अभिव्यक्ति का खुलासा किया जिसमें कोई दूषित MHC सकारात्मक कोशिकाओं(चित्रा 4B)के साथ । किसी भी दूषित सांसदों की वृद्धि को प्रोत्साहित करने के लिए मायोजेनिक मीडिया में फासियों की खेती करके एफएपी की आबादी की शुद्धता की अंतिम पुष्टि की गई थी । कोई एमएचसी पॉजिटिव सेल नहीं देखा गया(सप्लीमेंट्री फिगर 2ए)।

मायोजेनिक स्थितियों के अधीन एमपी संस्कृतियों ने एमएचसी-एक्सप्रेसिंग मेच्योर मायोसाइट्स और मल्टी-न्यूक्लिटेड मायोट्यूब्स 12 दिन पोस्ट प्लेटिंग(चित्रा 4C) काप्रदर्शन किया । एफएसपी-1 के साथ एमपी संस्कृतियों का सह-इम्यूनोसटेनिंग, और प्लिन-1 ने क्रमशः फाइब्रोब्लास्ट या एडिपोसाइट्स को दूषित करने की अनुपस्थिति का प्रदर्शन किया। इसी तरह, ORO धुंधला लिपिड संदूषण (अंजीर 4C) का प्रदर्शन नहीं किया । Col1a1, जो फाइब्रोब्लास्ट द्वारा अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, को मायोजेनिक अग्रदूतों और मायोब्लास्ट द्वारा कुछ हद तक उत्पादित किए जाने की भी सूचना दी गई है, हालांकि इस संबंध में साहित्य में विरोधाभासी आंकड़े हैं8,43,44। जबकि Col1a1 और MHC के साथ सांसदों के सह-इम्यूनोसदात से हमारी सांसद संस्कृति के मायोसाइट भेदभाव का पता चला, Col1a1 इम्यूनोपोसिटिटी का कोई सबूत नहीं मिला(चित्रा 4C)। जनसंख्या की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए, एमपी संस्कृतियों को एडिपोजेनिक्स और फाइब्रोब्लास्ट(अनुपूरक चित्रा 2बी)के विकास को प्रोत्साहित करने के लिए एडिपोजेनिक या फाइब्रोजेनिक स्थितियों के अधीन किया गया था। फास वंश से कोई दूषित कोशिकाओं को नहीं देखा गया ।

जबकि हम की पहचान करने और चूहा मांसपेशी से FAPs और सांसदों की शुद्ध आबादी तरह की क्षमता का प्रदर्शन किया था, हम अगले लिन की पहचान निर्धारित करने की मांग की//Sca-1 +/VCAM-1 + (डबल सकारात्मक) कोशिकाओं । चूंकि स्वस्थ मांसपेशी45 और इसी तरह कुछ फैक्स (लगभग) में सांसदों (लगभग 3%) के बहुत छोटे अनुपात पर एससीए-1 अभिव्यक्ति की सूचना दी गई है। 4%) स्वस्थ मांसपेशी10में VCAM-1 व्यक्त करने के लिए सूचित किया गया है, हौसले से हल लिन के इम्यूनोदाते-/Sca-1 +/VCAM-1 + कोशिकाओं PDGFRα और Pax7 के लिए किया गया था के साथ उंहें मायोजेनिक, adipogenic में खेती, और फाइब्रोजेनिक स्थितियां क्रमशः मायोजेनेसिस, एडिपोजेनेसिस और फाइब्रोजेनेसिस को प्रेरित करती हैं। यह पाया गया कि डबल पॉजिटिव कोशिकाएं सांसदों और एफओपी की मिश्रित आबादी थीं, जिनमें ताजा सॉर्ट कोशिकाएं या तो PDGFRα या Pax7(अनुपूरक चित्रा 3ए)और सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए सकारात्मक है जो परिपक्व मायोसाइट्स, एडिपोसाइट्स या फाइब्रोब्लास्ट(अनुपूरक चित्रा 3बी, सी)में अंतर करती हैं।

आईटीजीए7 बनाम वीसीएएम-1प्रवाह साइटोमेट्रिक एफएपी पहचान के दौरान सांसदों की पहचान करने के लिए
जबकि क्रमशः एससीए-1 और वीसीएएम-1 का उपयोग करके चूहे के FAPs और सांसदों की प्रवाह साइटोमेट्रिक पहचान के लिए एक सफल प्रोटोकॉल स्थापित किया गया था, हमने यह निर्धारित करने की मांग की कि क्या एक स्व-संयुग्मित ITGA7 एंटीबॉडी का उपयोग वीसीएएम-1 के बजाय सांसदों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि माउस में मानक है । एक चूहा-विशिष्ट ITGA7 एंटीबॉडी पीई-Cy7 (अनुपूरक फ़ाइलदेखें) के लिए संयोजित किया गया था और एंटीबॉडी के प्रदर्शन को वाणिज्यिक क्षतिपूर्ति मोतियों और चूहे गैस्ट्रोकनेमियस(अनुपूरक चित्रा 4ए-सी)से उत्पन्न एकल सेल निलंबन पर मान्य किया गया था। ITGA7::P E-Cy7 एंटीबॉडी एकल धुंधला और FMO प्रयोगों(अनुपूरक चित्रा 4डी)पर पर्याप्त रूप से प्रदर्शन किया । हालांकि, जब CD31 के साथ पूर्ण धुंधला गैस्ट्रोकनेमियस सेल निलंबन:::FITC, सीडी 45::FITC, Sca-1::APC, और ITGA7::P E-Cy7, एक बातचीत Sca-1:: एपीसी और ITGA7::P E-Cy-7 एंटीबॉडी के बीच स्पष्ट हो गया । दोनों FACS के बाद संस्कृति लिन-/Sca-1 +/ITGA7-कोशिकाओं (कथित FAPs) और लिन/Sca-1-/IGTA7 + कोशिकाओं (कथित सांसदों)(अनुपूरक चित्रा 4ई)हल मुख्य रूप से FAPs मिले और कुछ सांसदों(अनुपूरक चित्रा 4एफ)के साथ, एससीए-1:: एपीसी और ITGA7::P E-Cy-7 एंटीबॉडी के बीच बातचीत का संकेत है नकारात्मक सेल पहचान की विशिष्टता को प्रभावित किया ।

लंबे समय तक डिनेरवेट कंकाल की मांसपेशियों में एक उपन्यास एफएपीएस टाइम-कोर्स
चूंकि11,38के शुरुआती मॉडलों में अल्पकालिक दर्दनाक डिनेर्वेशन के संदर्भ में एफएपी गतिशीलता का मूल्यांकन किया गया है, इसलिए हमने स्वस्थ और गंभीर रूप से एट्रोफिक, फाइब्रोटिक मांसपेशियों से एफएपी अलगाव के लिए हमारी विधि के प्रदर्शन को मान्य करने की मांग की। चूहों को अच्छी तरह से मान्य एकतरफा टिबियल तंत्रिका ट्रांसेक्शन मॉडल46 का उपयोग करके दर्दनाक दीर्घकालिक डेनेर्वेशन चोट के अधीन किया गया था, जिसमें गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी के साथ 14 सप्ताह के बाद डीनेरवेट अंग और कॉन्ट्रालेटरल इनरवेट्ड अंग (आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए) से चार सीरियल टाइमपॉइंट पर काटा गया था। जैसा कि पहले बताया गया है, डिनेरवेटेड मांसपेशी ने समय47के साथ बढ़ते फाइब्रोसिस और वसा जमाव(चित्रा 5C-F)के साथ प्रगतिशील शोष(चित्रा 5A,बी)का प्रदर्शन किया।

हमारे प्रोटोकॉल ने प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाएं उत्पन्न कीं, भले ही 12 और 14 सप्ताह-denervated गैस्ट्रोकनेमियस का वजन लगभग 0.2-0.3 ग्राम (संबंधित कॉन्ट्रालेटरल कंट्रोल मांसपेशी का 15-20%)(चित्रा 5B)था। हमने प्रयोग की 14 सप्ताह की अवधि(चित्रा 6 ए,बी),प्रगतिशील मांसपेशी फाइब्रोसिस और वसा जमाव के साथ सामंजस्य के लिए बनाए रखा गया है, जो कि इनरवेट्ड कॉन्ट्रालेट्रल कंट्रोल मांसपेशी की तुलना में डिनेरवेट गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशियों में एफएपी के नियमन को देखा गया। मांसपेशियों के हिस्टोलॉजिक क्रॉस सेक्शन के एससीए-1 इम्यूनोस्टेटिंग ने स्वस्थ मांसपेशियों में myofibers के बीच इंटरस्टिटियम में बेसलाइन अभिव्यक्ति के अलावा 14 सप्ताह-denervated मांसपेशी(चित्रा 5G)में फाइब्रो-फैटी परिवर्तन के क्षेत्रों में कोशिकाओं को व्यक्त करने वाली एससीए-1 के स्थानीयकरण की पुष्टि की । कोशिकाओं का एक अलग सबसेट समय के बाद DENERvation के साथ FAPs आबादी में उभरा SCA-1 संकेत (एससीए-1 उच्च) में एक मजबूत वृद्धि की विशेषता; चित्रा 6A,लाल बॉक्स) प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण पर, FAPs बेसल एससीए-1 अभिव्यक्ति (Sca-1 मेड/कम की तुलना में; चित्रा 6A,ग्रीन बॉक्स) । इन उपजनसंख्याओं के परिमाणीकरण से समय के साथ अंतर गतिशीलता का पता चला; एससीए-1 उच्च एफएप्स में काफी वृद्धि हुई, जिसमें 12-और 14 सप्ताह के बाद-denervation(चित्रा 6B),जिसमें कुल FAPs आबादी का लगभग आधा(चित्रा 6C)शामिल है । इसके विपरीत, Sca-1 मेड/कम FAPs 2 और 5 सप्ताह के बाद denervation(चित्रा 6C)में प्रमुख उपजनसंख्या थे और केवल स्तर में एक क्षणिक वृद्धि के बाद denervation(चित्रा 6B) दिखाया।

दीर्घकालिक डीनेरवेट पेशी में एफएपी की निरंतर उपस्थिति के विपरीत, सांसदों ने डीनेर्वेशन के लिए एक अपेक्षित द्विफेसिक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया। शुरू में सांसदों के ऊपर denervated मांसपेशी में वृद्धि हुई है कि नियंत्रण अंग में देखा है, लेकिन 5 सप्ताह के बाद denervation जनसंख्या में गिरावट शुरू हुई(चित्रा 6D)। लंबे समय तक denervated मांसपेशी47में मांसपेशियों उपग्रह सेल की आबादी की प्रसिद्ध थकावट के साथ ध्यान में रखते हुए, 12 सप्ताह तक सांसदों पर या बेसलाइन स्तर के नीचे थे टिबियल तंत्रिका ट्रांसेक्शन के बाद।

हमने लिन-/एससीए-1 +/वीसीएएम-1 + जनसंख्या(अनुपूरक चित्रा 3डी-ई)की गतिशीलता का भी विश्लेषण किया । जबकि लिन-जनसंख्या के सापेक्ष डबल पॉजिटिव कोशिकाओं की आवृत्ति उत्तरोत्तर समय के साथ denervated मांसपेशियों में कमी आई है, जब निरपेक्ष सेल गिनती मांसपेशियों के प्रति ग्राम निर्धारित किया गया था डबल सकारात्मक आबादी में एक अस्थाई वृद्धि देखी गई थी, 14 सप्ताह के बाद denervation द्वारा बेसलाइन स्तर पर गिरने से पहले ।

Figure 1
चित्रा 1:FAPs और सांसदों की पहचान, अलगाव, और संस्कृति के लिए चित्रमय योजनाबद्ध: ग्राफिकल योजनाबद्ध चूहा गैस्ट्रोकनेमियस से FAPs और सांसदों की पहचान का चित्रण । नमूनों को दो अनुक्रमिक एंजाइमीय पाचन से गुजरने से पहले काटा और यांत्रिक रूप से कीमा बनाया जाता है। ऊतक की तैयारी को फिर संसाधित किया जाता है और एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए फ़िल्टर किया जाता है। फ्लोरोसेंटली-संयुग्मित एंटीबॉडी का कॉकटेल प्रत्येक नमूने में जोड़ा जाता है जिसे फिर एक प्रवाह साइटोमीटर या सेल सॉर्टर के माध्यम से चलाया जाता है ताकि क्रमशः FAPs और सांसदों की पहचान या उन्हें अलग किया जा सके । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:एससीए-1:: एपीसी स्वयं-संयुग्मित एंटीबॉडी सत्यापन और टिटरेशन। एससीए-1 का सत्यापन:: स्वस्थ चूहा गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी(बी)से उत्पन्न वाणिज्यिक क्षतिपूर्ति मोतियों(ए)और एकल सेल निलंबन पर एकल-धुंधला द्वारा एपीसी एंटीबॉडी संयतंशकरण। दोनों एससीए-1 लेबल मोती और कोशिकाओं की अलग आबादी स्पष्ट कर रहे है (काले बक्से) । एंटीबॉडी टिटरेशन एससीए-1:: एकल सेल निलंबन(सी)पर एपीसी की पांच अलग-अलग सांद्रता का परीक्षण करके किया गया था; इष्टतम एकाग्रता न्यूनतम पृष्ठभूमि धुंधला के साथ सबसे बड़ी फ्लोरेसेंस तीव्रता के आधार पर चुना गया था और बैच निर्भर पाया गया था। एक प्रतिनिधि टिटरेशन को लाल बॉक्स द्वारा इंगित बैच विशिष्ट इष्टतम एकाग्रता के साथ दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:चूहा गैस्ट्रोकनेमियस में FAPs और सांसदों की फ्लो साइटोमेट्री पहचान। (ए-एफ) एफएपी और सांसदों के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति।(ए)नमूनों को पहले मलबे (ब्लैक बॉक्स) को बाहर करने के साथ-साथ मोतियों (लाल बॉक्स) की गिनती के लिए गेट करने के लिए गेट किया जाता है । इसके बाद कोशिकाओं को फ्रंट स्कैटर (एफएससी)(बी)और साइड स्कैटर (एसएससी) विशेषताओं(सी)दोनों द्वारा डबल्स को बाहर करने के लिए गेट किया जाता है । परिणामस्वरूप एकल कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन SYTOX ब्लू(डी)के साथ धुंधला करके किया जाता है । SYTOX ब्लू निगेटिव (लाइव) सिंगल्स तो CD31 और CD45 (वंश) की पहचान फिटसी संकेत के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं; लिन) आगे के विश्लेषण (ब्लैक बॉक्स लिन-कोशिकाओं)(ई)से लिन + अंशों को बाहर करने के लिए। लिन जनसंख्या तो SCA के लिए मूल्यांकन किया जाता है-1:: एपीसी बनाम VCAM-1::P E संकेत(एफ)। एफएपी की पहचान लिन-/एससीए-1 +/वीसीएएम-1-(एफ; रेड बॉक्स) के रूप में की जाती है जबकि सांसदों की पहचान लिन-/एससीए-1-/वीसीएएम-1 + इवेंट्स (एफ; ब्लू बॉक्स) के रूप में की जाती है । एक लिन-/एससीए-1 +/VCAM-1 + डबल पॉजिटिव आबादी भी स्पष्ट है (ऊपरी सही चतुर्भुज) । (जी)FMO (फ्लोरेसेंस माइनस एक) CD31 के लिए नियंत्रण::FITC और CD45:: FITC उचित मुआवजा और लिन कोशिकाओं के लिए गेटिंग प्रदर्शित करता है । (एच-1) Sca-1:: एपीसी बनाम VCAM-1::P एफएमओ नियंत्रण के ईई भूखंडों उचित मुआवजा और FAPs (एससीए-1 एफएमओ) और सांसदों (VCAM-1 FMO) के लिए गेटिंग का प्रदर्शन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:फ़ेस और सांसदों सेल संस्कृति और इम्यूनोस्टेपिंग को क्रमबद्ध किया गया। (A)ताजा हल हुए फैक्स (शीर्ष पंक्ति) और सांसदों (निचली पंक्ति) पर PDGFRα (ग्रीन) और Pax7 (लाल) के लिए सह-इम्यूनोदाता । DAPI के साथ नाभिक दाग नीला। FAPs पूरी तरह से PDGFRα व्यक्त करते हैं और कोई Pax7 सकारात्मक कोशिकाओं स्पष्ट हैं, जबकि सांसद विशेष रूप से कोई PDGFRα सकारात्मक सेल संदूषण के साथ Pax7 व्यक्त करते हैं, दोनों हल आबादी की शुद्धता का प्रदर्शन । (ख)एडिपोजेनिक विभेदन मीडिया (एडी) में 12 दिन में FAPs फाइब्रोब्लास्ट-विशिष्ट प्रोटीन 1 (एफएसपी-1; ग्रीन) और पेरिलिपिन-1 (प्लिन-1; ग्रीन) के लिए सकारात्मक दाग, क्रमशः विभेदित फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट्स का प्रदर्शन । नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ है। तेल लाल ओ (ORO) धुंधला (लाल) 12 दिन तक परिपक्व adipocytes से उत्पन्न तटस्थ ट्राइग्लिसराइड्स और लिपिड की उपस्थिति को इंगित करता है । फाइब्रोजेनिक विभेदन मीडिया (एफडी) के अधीन एफएपी-व्युत्पन्न कोलेजन प्रकार 1 (Col1a1; ग्रीन) की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करता है। या तो एडिपोजेनिक या फाइब्रोजेनिक मीडिया में सुसंस्कृत FAPs मायोसिन भारी श्रृंखला (एमएचसी, लाल) के लिए सह-इम्यूनोदाग नहीं है, जो मायोसाइट्स को दूषित करने की अनुपस्थिति का संकेत देता है। (ग)एमपीएस ने 12 दिन में मायोजेनिक विभेदन मीडिया (एमडी) में विकसित किया प्रदर्शन एमएचसी पॉजिटिव (लाल) धुंधला परिपक्व मायोसाइट्स और फ्यूज्ड मल्टीन्यूक्लिटेड मायोट्यूब्स की उपस्थिति का प्रदर्शन किया । नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ है। एमपी संस्कृतियां फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट संदूषण से स्पष्ट थीं, जैसा कि एफएसपी-1 (ग्रीन), प्लिन-1 (ग्रीन) और ओआरओ धुंधला के लिए सह-इम्यूनोस्टेपिंग की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है। Co1a1 इम्यूनोदाता को समायोजित करने के लिए लेमिनिन पर उगाए गए सांसद 12 दिन तक मायोट्यूब फ्यूजन की एक ही डिग्री प्रदर्शित नहीं करते हैं जैसा कि कोलेजन पर होता है। Col1a1 (ग्रीन) सांसद संस्कृतियों से अनुपस्थित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:शोष, फाइब्रोसिस, और दीर्घकालिक denervated मांसपेशियों की फैटी घुसपैठ। (A)प्रतिनिधि ने चार सीरियल टाइमपॉइंट्स पोस्ट-डिनेर्वेशन में गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशियों को काटा । गैस्ट्रोस्नेमियस निरूपित कॉन्ट्रा दो सप्ताह के डिनेरवेटेड जानवर से एक प्रतिनिधि कॉन्ट्रालेट्रल अंग नमूना है। (ख)मांसपेशियों के शोष के बाद denervation के Quantification के अनुपात के रूप में व्यक्त किया denervated (DEN) गैस्ट्रोकनेमियस गीला वजन के अनुपात के रूप में व्यक्त की है कि contralateral (CONTRA) अंग की । (ग)पिरोसिरियस रेड (पीएसआर) ने गैस्ट्रोकनेमियस के हिस्टोलॉजिक क्रॉस-सेक्शन को दाग दिया, जो 2 या 14 सप्ताह बाद काटा गया था, जो प्रगतिशील फाइब्रोसिस का प्रदर्शन करता है । मांसपेशियों के दाग पीले, कोलेजन दाग लाल। (घ)फाइब्रोसिस कुल ऊतक क्षेत्र के सापेक्ष पीएसआर सकारात्मक ऊतक के क्षेत्र का निर्धारण करके मात्रा निर्धारित करता है। (ई)तेल लाल ओ (ORO) गैस्ट्रोकनेमियस के दाग पार वर्गों 2 या 14 सप्ताह के बाद denervation काटा, काउंटर हेमेटॉक्सीलिन के साथ दाग । लिपिड दाग लाल। (च)फैटी घुसपैठ कुल ऊतक क्षेत्र के सापेक्ष ORO दाग ऊतक के क्षेत्र का निर्धारण करके मात्रा निर्धारित । (जी)गैस्ट्रोस्नेमियस हिस्टोलॉजिक क्रॉस-सेक्शन 2-या 14 सप्ताह के बाद-denervation, लैमिनिन (ग्रीन) और एससीए-1 (लाल) के लिए इम्यूनो दाग काटा । लैमिनिन सकारात्मक रूप से बेसल लैमिना को दाग देता है जो व्यक्तिगत मायोफिबरर्स को घेरे हुए है। एससीए-1 कई जनक कोशिका प्रकारों की पहचान करता है। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ है। इनसेट स्वस्थ मांसपेशियों में बेसल लैमिना के बाहर एससीए-1 + कोशिकाओं का स्थानीयकरण दिखाता है; पीले तीर फाइब्रोटिक क्षेत्रों के भीतर एससीए-1 + कोशिकाओं की उपस्थिति को निरूपित करते हैं। (डेटा का मतलब है +/-S.D; n=3 के लिए 2 और 14 सप्ताह के टाइमपॉइंट्स । पैनल बी में डेटा एक तरह से ANOVA द्वारा विश्लेषण, पैनलों डी और एफ में डेटा दो तरह से ANOVA द्वारा विश्लेषण किया । पोस्ट-हॉक सिडक का परीक्षण कई तुलनाओं के लिए सही करने के लिए किया गया। = = पी<0.05 CONTRA और DEN के बीच; #= नमूनों के बीच पी<0.05) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:लंबे समय तक डिनेरवेटेड रैट गैस्ट्रोकनेमियस में एफएपी और सांसद गतिशीलता। (A)प्रतिनिधि एससीए-1:: एपीसी बनाम VCAM-1::P लिन के ई पैनल-(CD31-/CD45-) मांसपेशियों के नमूनों से आबादी 2-, 5-, 12-, या 14 सप्ताह के बाद denervation काटा । शीर्ष पंक्ति denervated (DEN) गैस्ट्रोकनेमियस से भूखंडों से पता चलता है, जबकि नीचे पंक्ति contralateral, असंचालित (CONTRA) गैस्ट्रोकनेमियस से उन लोगों को दिखाता है । लिन-/एससीए-1 +/वीसीएएम-1-एफएपी (कुल) को एससीए-1 हाई (रेड बॉक्स) और स्का-1 मेड/लो (ग्रीन बॉक्स) अंशों में विभाजित किया जाता है, जबकि लिन-/एससीए-1-/वीसीएएम-1 + सांसदों को ब्लू बॉक्स में दिखाया जाता है । (ख)प्रत्येक समय बिंदु के बाद-denervation पर FAPs (कुल, एससीए-1 उच्च, एससीए-1 मेड/कम) का परिमाणीकरण, लिन-कोशिकाओं (शीर्ष पंक्ति) की आवृत्ति (%) और प्रति ग्राम मांसपेशी (निचली पंक्ति) कोशिकाओं की संख्या के रूप में सूचित किया जाता है जो कॉन्ट्रालेटरल कंट्रोल गैस्ट्रोकनेमियस के लिए सामान्य होता है । (ग)कुल एफएपी आबादी के एससीए-1 उच्च और एससीए-1 मेड/कम उपआबादी के सापेक्ष अनुपात । (घ)प्रत्येक समय बिंदु के बाद सांसदों की मात्राकरण लिन-कोशिकाओं (बाएं ग्राफ) की आवृत्ति (%) के रूप में और प्रति ग्राम मांसपेशी (दाएं ग्राफ) की कोशिकाओं की संख्या के रूप में गर्भनिरोधक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत के रूप में रिपोर्ट । (डेटा का मतलब है +/-S.D; n=4 के लिए 2 और 12 सप्ताह के टाइमपॉइंट; एन = 5 सप्ताह के समय बिंदु के लिए; 14 सप्ताह के समय बिंदु के लिए n =2 । डेटा एक तरह से ANOVA द्वारा विश्लेषण; कई तुलनाओं के लिए सही करने के लिए पोस्ट-हॉक सिडक का परीक्षण। # = पी<0.05.) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1:एंटीबॉडी सत्यापन और टिटरेशन। CD31 का सत्यापन:: फिटसी (ए-सी), सीडी 45:एफटीसी (डी-एफ), और वीसीएएम-1::P ई (जी-I) मुआवजा मोती (ए, डी, जी) और स्वस्थ चूहे गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी (बी, ई, एच) से एकल कोशिका निलंबन पर व्यावसायिक रूप से संयुग्मित एंटीबॉडी। प्रत्येक एंटीबॉडी को 5 अलग-अलग सांद्रता (सी, एफ, आई) पर टिटैर किया गया था। इष्टतम एकाग्रता को न्यूनतम पृष्ठभूमि धुंधला (लाल बक्से) के साथ सबसे बड़ी फ्लोरेसेंस तीव्रता के आधार पर चुना गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2:रिवर्स भेदभाव संस्कृति स्थितियों में फ़ेस और सांसदों को हल किया गया। (A)एफएसपी-1 (ग्रीन), प्लिन-1 (ग्रीन) या Col1a1 (ग्रीन) और एमएचसी (लाल) के लिए 12 दिन में मायोजेनिक विभेदन मीडिया (एमडी) में सुसंस्कृत FAPs मायोसाइट संदूषण का प्रदर्शन नहीं करते हैं । सकारात्मक FSP-1, और Col1a1 धुंधला फाइब्रोब्लास्ट के लिए FAPs भेदभाव प्रकट करते हैं । ओआरओ धुंधला (लाल) लिपिड उत्पादन से पता चलता है, हालांकि प्लिन-1 सकारात्मक एडीपोसाइट्स आसानी से दिखाई नहीं देते हैं। नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग । (ख)आदिपोजेनिक विभेदन मीडिया के अधीन सांसदों का निधन हो गया । सांसदों ने 12 दिनों के लिए एफएपी ग्रोथ मीडिया (एफएपी जीएम) में सुसंस्कृत और एफएसपी-1 (ग्रीन) या प्लिन-1 (ग्रीन) और एमएचसी (लाल) के लिए सह-इम्यूनोडांडित एफएसपी-1 या प्लिन-1 सकारात्मक कोशिकाओं की अनुपस्थिति के साथ विभेदित मायोसाइट्स और मायोट्यूब का प्रदर्शन किया। ओआरओ धुंधला की अनुपस्थिति आगे संस्कृति में आदिपोजेनिक कोशिकाओं की कमी की पुष्टि करती है। सांसदों फाइब्रोजेनिक भेदभाव मीडिया (एफडी) में बड़े और Col1a1 और MHC शो परिपक्व myocytes और Col1a1 सकारात्मक कोशिकाओं की अनुपस्थिति के लिए सह इम्यूनोडाटांड । Col1a1 इम्यूनोदाता को समायोजित करने के लिए लेमिनिन पर उगाए गए सांसद संस्कृति में 12 दिनों में मायोट्यूब को एक ही डिग्री संलयन प्रदर्शित नहीं करते हैं जैसा कि कोलेजन पर होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 3:लिन-/एससीए-1+/वीसीएएम-1+कोशिकाएं फास और सांसदों की मिश्रित आबादी हैं। (A)PDGFRα और Pax7 हौसले से अलग लिन-/Sca-1 +/VCAM-1 + कोशिकाओं के सह-इम्यूनोसदात PDGFRα एकल सकारात्मक (सफेद तीर) और Pax7 एकल सकारात्मक (पीले तीर) कोशिकाओं क्रमशः FAPs और सांसदों की पहचान की एक मिश्रित आबादी दिखाते हैं । (ख)लिन-/एससीए-1 +/वीसीएएम-1 + संस्कृतियों में 12 दिन में उगाई गई मायोजेनिक विभेदन मीडिया (एमडी) में क्रमशः फाइब्रोब्लास्ट और मायोसाइट्स/ट्यूब की पहचान करने वाली एफएसपी-1 सिंगल पॉजिटिव (ग्रीन) और एमएचसी सिंगल पॉजिटिव (रेड) कोशिकाएं शामिल हैं । प्लिन-1 (हरा) और ओआरओ (लाल) धुंधला की अनुपस्थिति परिपक्व एडिपोसाइट्स की अनुपस्थिति का संकेत देती है। Col1a1 (ग्रीन) और MHC (लाल) के लिए सह-इम्यूनोस्टेटिंग परिपक्व मायोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट दिखाते हैं। (C)लिन-/एससीए-1 +/VCAM-1 + कोशिकाओं पर 12 दिन में विकसित एडिपोजेनिक विभेदन मीडिया (एडी) इसी तरह FSP-1 (ग्रीन) एकल सकारात्मक और MHC (लाल) एकल सकारात्मक कोशिकाओं का मिश्रण दिखाते हैं, लेकिन प्लिन-1 (ग्रीन) एकल सकारात्मक कोशिकाओं और ओआरओ दाग वर्तमान के साथ भी, फाइब्रोब्लास्ट, myoctes और adicys के भेदभाव की पुष्टि । फाइब्रोजेनिक विभेदन मीडिया (एफडी) में उगाई जाने वाली संस्कृतियां परिपक्व मायोसाइट्स और Col1a1 एकल सकारात्मक कोशिकाओं (फाइब्रोब्लास्ट) को दिखाती हैं। (घ)प्रतिनिधि एससीए-1:: एपीसी बनाम VCAM-1::P लिन के ई पैनल-(CD31-/CD45-) denervated मांसपेशियों के नमूनों से आबादी 2-, 5-, 12-, या 14 सप्ताह के बाद denervation काटा; लिन-/एससीए-1 +/वीसीएएम-1 + जनसंख्या बैंगनी बॉक्स में इंगित की गई है । (ई)चार धारावाहिक समय-अंक के बाद denervation में लिन-/Sca-1 +/VCAM-1 + कोशिकाओं की मात्रा, लिन कोशिकाओं (बाएं ग्राफ) और कोशिकाओं प्रति ग्राम मांसपेशी (दाएं ग्राफ) की आवृत्ति के रूप में रिपोर्ट विपरीत गैस्ट्रोकनेमियस को सामान्यीकृत । (डेटा का मतलब है +/-S.D; n=4 के लिए 2 और 12 सप्ताह के टाइमपॉइंट; एन = 5 सप्ताह के समय बिंदु के लिए; 14 सप्ताह के समय बिंदु के लिए n =2 । डेटा का विश्लेषण वन-वे एवरोवा द्वारा किया गया था; कई तुलनाओं के लिए सही करने के लिए पोस्ट-हॉक सिडक का परीक्षण; # = पी<0.05.) कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 4:आईटीजीए7 चूहे कंकाल की मांसपेशी के प्रवाह साइटोमेट्री में मायोजेनिक कोशिकाओं के मार्कर के रूप में। ITGA7 का सत्यापन: :P E-Cy7 एंटीबॉडी संकुस्कार वाणिज्यिक मुआवजा मोती(ए)और स्वस्थ चूहा गैस्ट्रोस्नेमियस मांसपेशी(बी)से उत्पन्न एकल सेल निलंबन पर एकल धुंधला द्वारा । दोनों ITGA7 लेबल मोती और कोशिकाओं की आबादी स्पष्ट कर रहे है (काले बक्से)(सी)एंटीबॉडी टाइटेशन एकल सेल निलंबन पर पांच अलग सांद्रता का परीक्षण करके किया गया था । लाल बॉक्स आदर्श एकाग्रता को इंगित करता है। (घ)फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण के भूखंड एंटीबॉडी कंजूगेट्स में फ्लोरेसेंस स्पिलओवर की अनुपस्थिति को प्रदर्शित करते हैं, लेकिन सेल निलंबन का पूरा दाग एससीए-1:: एपीसी और ITGA7::P E-Cy7 (ग्रीन बॉक्स) के बीच एक गैर-विशिष्ट बातचीत का पता चलता है । गेटिंग(ई)लिन-/एससीए-1 +/ITGA7-कोशिकाओं (कथित "FAPs") और लिन-/Sca-1-/IGTA7 + कोशिकाओं (कथित "सांसदों" को अलग करने के लिए) । (एफ)फ्लोरिलिपिन-1 (ग्रीन) और एमएचसी (लाल) के साथ 12 दिनों के बाद चढ़ाना में FACS-सॉर्ट सेल संस्कृतियों की सह-प्रतिरक्षा मौजूद कुछ मायोसाइट्स के साथ मुख्य रूप से एडिपोसाइट्स में परिपक्व होती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

1. दागदार
2. व्यवहार्यता नियंत्रण
3. सीडी 31 + सीडी 45 एफएमओ
4. एससीए-1 एफएमओ
5. वीसीएएम-1 एफएमओ
6. CD31 + CD45 एकल दाग (मोती)
7. CD31 + CD45 एकल दाग (कोशिकाओं)
8. एससीए-1 एकल दाग (मोती)
9. एससीए-1 एकल दाग (कोशिकाएं)
10. VCAM-1 एकल दाग (मोती)
11. वीसीएएम-1 एकल दाग (कोशिकाएं)

तालिका 1:फ्लो साइटोमेट्री एंटीबॉडी स्टेनिंग नियंत्रण। एंटीबॉडी धुंधला नियंत्रण का पूरा पूरक। यदि प्रयोग पहली बार किया जा रहा है, तो मुआवजा मोतियों और एकल कोशिका निलंबन दोनों पर एकल दाग नियंत्रण चलाया जाना चाहिए। बाद के सभी प्रयोगों के लिए, एकल दाग नियंत्रण केवल मुआवजा मोती पर चलाने की जरूरत है ।

CD31::FITC (μg) CD45:: फिटसी (μg) एससीए-1:: एपीसी (μg)* VCAM-1::P E (μg) SYTOX ब्लू
(μM; अंतिम एकाग्रता)
अन दागदार नियंत्रण
-- -- -- -- --
एकल दाग नियंत्रण
SYTOX ब्लू (व्यवहार्यता नियंत्रण) -- -- -- -- 1
सीडी 31 और सीडी 45 0.5 0.25 -- -- 1
एससीए-1 -- -- 0.25 -- 1
वीसीएएम-1 -- -- -- 0.25 1
फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ)
सीडी 31 और सीडी 45 -- -- 0.25 0.25 1
एससीए-1 0.5 0.25 -- 0.25 1
वीसीएएम-1 0.5 0.25 0.25 -- 1
प्रायोगिक नमूने
पूरा दाग 0.5 0.25 0.25 0.25 1

तालिका 2:फ्लो साइटोमेट्री एंटीबॉडी धुंधला मैट्रिक्स। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए प्रायोगिक और नियंत्रण नमूनों के धुंधला करने के लिए एंटीबॉडी राशि दिखाई जाती है। सभी धुंधला वॉश बफर के 100 माइक्रोन की कुल मात्रा में किया जाता है। * स्वयं-संयुग्मित एससीए-1 की इष्टतम राशि:: एपीसी एंटीबॉडी उपयोग किए गए बैच के आधार पर भिन्न हो सकती है। सभी हौसले से संयुग्मित एससीए-1:: एपीसी बैचों को पहले मुआवजा मोती और एकल सेल निलंबन दोनों को धुंधला करके मान्य किया जाना चाहिए।

अनुपूरक फाइल: रिएजेंट रेसिपी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

चूहे की मांसपेशियों के लिए एक अनुकूलित, मान्य FAPs अलगाव प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक है जो चोट मॉडल का अध्ययन करना चाहते हैं जो जीवविज्ञान या तकनीकी कारणों से माउस में व्यवहार्य नहीं हैं। उदाहरण के लिए, चूहों एक इष्टतम पशु मॉडल नहीं हैं जिसमें पुरानी स्थानीय, या न्यूरोडीजेनेरेटिव चोटों जैसे दीर्घकालिक डिनेर्वेशन का अध्ययन करना है। जैविक रूप से, चूहों की छोटी उम्र और तेजी से उम्र बढ़ने से उम्र बढ़ने के जटिल कारक से डीनर्वेशन के कारण मांसपेशियों को सटीक रूप से चित्रित करना मुश्किल हो जाता है। एक तकनीकी दृष्टिकोण से, गंभीर शोष के कारण काफी कम मांसपेशियों का द्रव्यमान प्रभावी प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए अपर्याप्त होगा। वास्तव में, माउस FAPs अलगाव प्रोटोकॉल व्यवस्थित मांसपेशियों को एक साथ समूहित करने का सुझाव देते हैं ताकि सॉर्ट किए गए FAPs29की उपज को बेहतर तरह से बढ़ाया जा सके । हालांकि यह विश्लेषण के लिए पर्याप्त मांसपेशियों के ऊतकों को प्राप्त करने की तकनीकी बाधा को हल करता है, यह एक साथ मांसपेशियों के विशिष्ट स्तर पर FAPs का आकलन करने से शोधकर्ताओं को सीमित करता है । चूंकि विशिष्ट मांसपेशी समूह अपने फाइबर प्रकार की संरचना, संवहनी की डिग्री, और माइटोकॉन्ड्रियल नंबर47 में स्वाभाविक रूप से भिन्न होते हैं, उदाहरण के लिए, प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए कई अलग-अलग मांसपेशियों के संयोजन से मांसपेशियों के विशिष्ट एफएपी लक्षण वर्णन को रोकता है। इसके विपरीत, हम बताते हैं कि स्वस्थ और दीर्घकालिक दोनों, एट्रोफिक और फाइब्रोटिक रैट गैस्ट्रोकनेमियस प्रभावी प्रवाह साइटोमेट्री के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रारंभिक सामग्री प्रदान करते हैं। इसके अलावा, स्वस्थ नमूनों में, मांसपेशियों के अधिशेष को कई डाउनस्ट्रीम परखों के लिए और अधिक विभाजित किया जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को एक ही ऊतक की सेलुलर, आणविक और हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं का सहवर्ती विश्लेषण करने की अनुमति मिलती है। अंत में, चिकित्सा विज्ञान के साथ चोट मॉडल में FAPs हेरफेर प्रयोगों के लिए, शारीरिक समारोह और सतर्क और सक्रिय चूहों में चाल के अच्छी तरह से मान्य विश्लेषण उपलब्ध हैं21,22,23,24,पशु की समाप्ति की आवश्यकता के बिना मांसपेशियों के समारोह के धारावाहिक मूल्यांकन को सक्षम करने।

चूहे के लिए एक अनुकूलित FAPs अलगाव प्रोटोकॉल बनाने में एक प्रमुख बाधा एंटीबॉडी उपलब्धता थी। हमारे आरंभिक दृष्टिकोण में माउस 1 , 7 , 8 , 9 , 10,11 ,12,13,14में व्यापक रूप से नियोजित एंटीबॉडी पैनल और गेटिंग रणनीति प्रोटोकॉल की प्रतिलिपि बनानेकीमांग की गई थी । जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, संयुग्मित, प्रवाह साइटोमेट्री-परीक्षण किया गया, और चूहे को पहचानने वाले मान्य एंटीबॉडी वंश मार्कर सीडी 31 और सीडी 45 के लिए उपलब्ध थे, कोई भी सकारात्मक FAPs के लिए मौजूद नहीं था जो मार्कर एससीए-1 या पीडीजीएफआरα की पहचान करते हैं, साथ ही नकारात्मक चयन मार्कर ITGA7 के लिए भी। इन मार्कर के लिए विशिष्ट, प्राथमिक एंटीबॉडी और प्रवाह साइटोमेट्री में प्रभावी होने के लिए कथित रूप से उपलब्ध थे, लेकिन एफएपी मार्कर एससीए-1 और पीडीजीएफआरα के, केवल एससीए-1 एंटीबॉडी को चूहे की कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण में प्रकाशित साहित्य में मान्य किया गया था48। इसलिए हमने एएससीए-1 को एफएपी के लिए सकारात्मक चयन मार्कर के रूप में चुना । एससीए-1 और ITGA7 मार्कर को चित्रित करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की संभावना कई कारणों से संभव नहीं थी, लेकिन मुख्य रूप से क्योंकि प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मान्य एससीए-1 और आईटीजीए7 के लिए एकमात्र चूहा-विशिष्ट एंटीबॉडी एक ही मेजबान प्रजातियों में उत्पन्न हुए थे। इसलिए, शेष विकल्प व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किटों का उपयोग करके दोनों एंटीबॉडी का आत्म-संवत् था।

एंटीबॉडी वैंजुगेशन के लिए इष्टतम किट चुनने की प्रक्रिया व्यापक थी, क्योंकि प्राथमिक एंटीबॉडी में मौजूद विभिन्न बफर डिलुएंट्स (जैसे, ग्लाइसिन, ग्लाइसेरोल, बीएसए, सोडियम एजाइड) के लिए कई किट पूरी तरह से या आंशिक रूप से असहिष्णु हैं। इसके अलावा, प्रदान किए गए फ्लोरोफोर को अन्वेषक के लिए उपलब्ध प्रवाह साइटोमीटर/सेल सॉर्टर के भीतर सुसज्जित लेजर के साथ संगत होना चाहिए, और नमूने में अन्य सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य फ्लोरोफोरस के समान तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जित नहीं करना चाहिए। चूहे-विशिष्ट PDGFRα प्राथमिक एंटीबॉडी में मंद घटकों की उपस्थिति जो संयुग्मण किट के साथ खराब संगत थी, इस प्रोटोकॉल में सकारात्मक एफएपी चयन मार्कर के रूप में एससीए-1 की पसंद में एक अतिरिक्त विचार था। हालांकि इन परिणामों से पता चलता है कि दोनों Sca-1:: एपीसी और ITGA7::P E-Cy7 conjugations दोनों मुआवजा मोती और कोशिकाओं पर अलग सकारात्मक दाग आबादी की पहचान के परिणामस्वरूप, पूर्व फ्लोरेसेंस में क्षय प्रदर्शन करने के लिए जल्दी से निर्माता द्वारा विज्ञापित किया गया पाया गया । यह अत्यधिक सिफारिश की है कि शोधकर्ताओं ने Sca-1 conjugate:: निर्माता के निर्देशों के अनुसार एपीसी, मजबूत संकेत सुनिश्चित करने के लिए पहली बार उपयोग (उदाहरण के लिए, प्रयोग से पहले दिन) से तुरंत पहले, तदनुसार प्रयोगों की योजना बनाएं कि प्रभावशीलता की एंटीबॉडी की खिड़की के भीतर संयुग्मित एंटीबॉडी का एक बैच उपयोग किया जा सकता है, और प्रत्येक बैच को एकल-धुंधला मुआवजा मोती द्वारा मान्य करें और एकल सेल निलंबन पर टिरेटिंग करें। इससे भी महत्वपूर्ण बात, तथापि, एससीए-1 के बीच उल्लेखनीय बातचीत:: एपीसी और ITGA7::P E-Cy7 ने एफएपी बनाम सांसदों की आबादी के सटीक चित्रण को रोका, एक वैकल्पिक रणनीति को नियोजित करने की आवश्यकता है ।

Boscolo Sesillo एट अल हाल ही में सीडी 31, सीडी 45 और CD11b नकारात्मक कोशिकाओं में एक सकारात्मक चयन मार्कर33 के रूप में वीसीएएम-1 का उपयोग कर चूहा मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के सफल प्रवाह साइटोमेट्रिक अलगाव का प्रदर्शन किया। एमपी चयन मार्कर के रूप में वीसीएएम-1 के साथ, हमने एफएपी (लिन-/एससीए-1+/वीसीएएम-1-) और सांसदों (लिन-/एससीए-1-/वीसीएएम-1+) की पहचान करने के लिए एक उपन्यास एंटीबॉडी पैनल का उपयोग किया और स्वस्थ गैस्ट्रोस्नेमियस मांसपेशी से FACS सॉर्ट कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृति के साथ दृष्टिकोण को मान्य किया। हौसले से अलग FAPs और सांसदों को अपने संबंधित वैकल्पिक मार्कर PDGFRα और Pax7 के लिए पूरी तरह से इम्यूनो दाग । सुसंस्कृत FAPs परिपक्व फाइब्रोब्लास्ट और adipocytes की आबादी में विभेदित, और परिपक्व myocytes/myotubes में सांसदों । संस्कृतियों के भीतर फैक्स और सांसदों का कोई क्रॉस संदूषण नहीं हुआ । हिस्टोलॉजिक क्रॉस-सेक्शन के इम्यूनोस्टेटिंग ने एससीए-1 सकारात्मक कोशिकाओं के साथ डीनेरवेट मांसपेशियों में फाइब्रो-फैटी क्षरण के क्षेत्रों की घुसपैठ की पुष्टि की।

जब तक हमने गंभीर रूप से एट्रोफिक, फाइब्रोटिक और वसा-घुसपैठ की मांसपेशियों में हमारे प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए दीर्घकालिक विकृत मांसपेशियों का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण किया, तो हमने निश्चित रूप से बेसलाइन एससीए-1 अभिव्यक्ति (एनोटेड एससीए-1 उच्च) के साथ एक एफएपीएस उप-आबादी के उद्भव को देखा। Sca-1 उच्च FAPs काफी देर से बाद denervation (12 सप्ताह से अधिक) में वृद्धि हुई है, जबकि Sca-1 मेड/कम FAPs बेसलाइन स्तर पर वापस गिरावट से पहले 5 सप्ताह में जल्दी नुकीला । 10,30को फास्प्स फेनोटाइप में विषमता बताई गई है . उच्च एससीए-1 अभिव्यक्ति वाले एफएपी को एडिपोसाइट्स में अधिक आसानी से अंतर करने के लिए दिखाया गया था, और जब फाइब्रोजेनिक उत्तेजना के संपर्क में आया तो Col1a130,49की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई। यहां देखी गई एफएपी उप-आबादी की गतिशीलता डिनेर्वेशन-प्रेरित सीक्वेल और मांसपेशियों की पुनर्योजी क्षमता47 के समय-पाठ्यक्रम के साथ लाइन में दिखाई देती है और इस प्रकार अलग-अलग सेलुलर कार्यक्रमों के साथ एफएपी उप-आबादी की विशेषता हो सकती है। Sca-1 उच्च FAPs देर से समय पर विनियमित हो-फाइब्रो के साथ सहवर्ती अंक/फैटी घुसपैठ और पुनर्योजी क्षमता में गिरावट, जबकि Sca-1 मेड/कम FAPs मांसपेशियों की पुनर्योजी खिड़की के दौरान विनियमित हो जाते है और प्रभावी पुनर्योजी myogenesis में सहायता कर सकते हैं । यहां प्रस्तुत एफएपी आइसोलेशन प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को भविष्य के अध्ययन के लिए इन विभिन्न आबादी की पहचान करने और उन्हें अलग करने की क्षमता प्रदान करता है ।

हम दोनों एससीए-1 और VCAM-1 (लिन/Sca-1 +/VCAM-1 +) के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं की आबादी की पहचान की और इस दोहरी सकारात्मक आबादी का पता लगाया FAPs और सांसदों का मिश्रण हो । एक तिहाई मार्कर-ITGA7 का उपयोग कर इस आबादी के जुदाई-SCA-1 और ITGA7 प्राथमिक एंटीबॉडी के बीच बातचीत के कारण संभव नहीं था । मालेकोवा और उनके सहयोगियों ने वीसीएएम-1 की एक उप-आबादी की सूचना दी जो फैक्स को व्यक्त करती है जो स्वस्थ मांसपेशियों में लगभग अनुपस्थित है, क्षणिक रूप से तीव्र सूजन के साथ बढ़ी है, और एमडीएक्स चूहों (मांसपेशियों के डिस्ट्रॉफी का मॉडल) में उनका हठ पुरानी मांसपेशियों की सूजन और फाइब्रोसिस10से जुड़ा हुआ था। इसके विपरीत, और हालांकि एक शुद्ध FAPs आबादी नहीं है, हमने पाया कि लिन-/Sca-1 +/VCAM-1 + जनसंख्या 12 में पुरानी मांसपेशी फाइब्रोसिस के साथ बेसलाइन स्तर से नीचे या नीचे कमी आई-और 14 सप्ताह के बाद denervation । Denervation एक ही भड़काऊ प्रतिक्रिया और साइकिल चालन उत्थान mdx चूहों, जो हमारे परिणामों में अंतर समझा सकता है द्वारा अनुभवी प्रयास प्रेरित नहीं करता है । लिन-/एससीए-1 +/वीसीएएम-1 + सेल आबादी में सांसदों की हमारी पहचान स्वस्थ मांसपेशियों में सांसदों के बहुत छोटे अनुपात पर एससीए-1 अभिव्यक्ति की रिपोर्ट को ध्यान में रखते हुए है, जिसमें मायोब्लास्ट प्रसार के दौरान चोट के बाद क्षणिक वृद्धि हुई है और बाद में सेल चक्र४५से वापसी । इस प्रकार, जबकि हमारी एंटीबॉडी लेबलिंग और FACS गेटिंग रणनीति सफलतापूर्वक अध्ययन के लिए FAPs और सांसदों की शुद्ध आबादी को अलग करती है, इन आबादी के प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित मात्राकरण की आवश्यकता वाले प्रयोगों से दोनों जनक लाइनों में कोशिकाओं के छोटे प्रतिशत के कारण उनकी संख्या को थोड़ा कम आंकना पड़ सकता है जो एससीए-1 और वीसीएएम-1 को सह-एक्सप्रेस करते हैं । भले ही, वर्तमान प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से सांसदों की क्लासिक बिफेसिक प्रतिक्रिया को दर्शाता है, जिसमें अल्पकालिक अपरेगुलेशन और दीर्घकालिक denervated मांसपेशियों में जनसंख्या की बाद में कमी है। इसी प्रकार, अलग-अलग कम अवधि के डिनेर्वेशन इंजरी में रिपोर्ट किए गए एफएपी में वृद्धि को यहां फिर से रीकैपिटल किया जाता है, और दीर्घकालिक टिबियल तंत्रिका ट्रांसेक्शन मॉडल का उपयोग करके आगे निरंतर दिखाया जाता है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को पहले से बेरोज़गार जानवर, चूहा प्रदान करता है, जिसमें फाउप्स और सांसदों का अध्ययन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक विधियों का उपयोग करना है। कंकाल की मांसपेशियों की मात्रा से सीमित चूहों में प्रयोग, और मांसपेशियों की ताकत और कार्य का आकलन करने के लिए टर्मिनल प्रयोग शुरू करने की लगातार आवश्यकता, बड़े चूहे में आसानी से आयोजित किया जा सकता है और गैर-घातक शक्ति और कार्यात्मक मूल्यांकन विधियों की अधिक व्यापक श्रृंखला के साथ। कुल मिलाकर, चूहे में FAPs अध्ययन तीव्र और पुरानी मांसपेशियों और परिधीय तंत्रिका आघात और रोग में इस प्रमुख जनक आबादी की उपन्यास भूमिकाओं को उजागर कर सकते हैं, बाद में सेल-विशिष्ट उपचारों के विकास की क्षमता में वृद्धि कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है ।

Acknowledgments

हम ओटावा विश्वविद्यालय में फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधाओं और बायोमेडिकल साइंसेज के लिए कीनन रिसर्च सेंटर (केआरसी), सेंट माइकल्स हॉस्पिटल यूनिटी हेल्थ टोरंटो को इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रवाह साइटोमेट्री/एफएस प्रोटोकॉल के अनुकूलन में उनकी विशेषज्ञता और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस काम को मेडिसिन द्वारा डिजाइन न्यू आइडियाज 2018 फंड (MbDNI-2018-01) द्वारा जेबी को वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson --
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson --
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson --
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter --
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

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References

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चूहे में कंकाल मांसपेशी में फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर्स (एफएपी) और मायोजेनिक प्रोजेनिटर्स (सांसदों) की पहचान, अलगाव और लक्षण वर्णन
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Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

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