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Biology

Identificazione, isolamento e caratterizzazione di progenitori fibro-adipogeni (FAPs) e progenitori miogeni (MP) nel muscolo scheletrico nel ratto

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/61750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo delinea un metodo per isolare i progenitori fibro-adipogeni (FAP) e i progenitori miogeni (MP) dal muscolo scheletrico del ratto. L'utilizzo del ratto nei modelli di lesione muscolare fornisce una maggiore disponibilità di tessuto dal muscolo atrofico per l'analisi e un repertorio più ampio di metodi convalidati per valutare la forza muscolare e l'andatura negli animali in movimento libero.

Abstract

I progenitori fibro-adipogeni (FAPs) sono cellule interstiziali residenti nel muscolo scheletrico che, insieme ai progenitori miogeni (MP), svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi muscolare, nelle lesioni e nella riparazione. Gli attuali protocolli per l'identificazione e l'isolamento dei FAP utilizzano la citometria a flusso/ lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e gli studi che valutano la loro funzione in vivo fino ad oggi sono stati intrapresi esclusivamente nei topi. La maggiore dimensione intrinseca del ratto consente un'analisi più completa dei FAP nei modelli di lesione del muscolo scheletrico, specialmente nel muscolo gravemente atrofico o quando gli investigatori richiedono una massa tissutale sostanziale per condurre più saggi a valle. Il ratto fornisce inoltre una selezione più ampia di saggi funzionali muscolari che non richiedono sedazione o sacrificio animale, riducendo così al minimo la morbilità e l'uso di animali consentendo valutazioni seriali. I protocolli di citometria a flusso/FACS ottimizzati per i topi sono specifici per specie, in particolare limitati dalle caratteristiche degli anticorpi disponibili in commercio. Non sono stati ottimizzati per separare i FAP dal ratto o dal muscolo altamente fibrotico. È stato sviluppato un protocollo di citometria a flusso/FACS per l'identificazione e l'isolamento di FAP e MP dal muscolo scheletrico di ratto sano e denervato, basandosi sull'espressione differenziale dei marcatori di superficie CD31, CD45, Sca-1 e VCAM-1. Poiché gli anticorpi primari specifici per il ratto, convalidati con citometria a flusso, sono gravemente limitati, è stata eseguita la coniugazione interna dell'anticorpo che prende di mira Sca-1. Utilizzando questo protocollo, è stata confermata la coniugazione Sca-1 di successo e l'identificazione citometrica a flusso di FAP e MP è stata convalidata mediante coltura cellulare e immunocolorazione di FAPs e MP isolati da FACS. Infine, riportiamo un nuovo decorso temporale dei FAP in un modello di denervazione prolungata (14 settimane). Questo metodo fornisce ai ricercatori la possibilità di studiare i FAP in un nuovo modello animale.

Introduction

Le cellule progenitrici fibro-adipogene (FAP) sono una popolazione di cellule progenitrici multipotenti residenti nel muscolo scheletrico che svolgono un ruolo critico nell'omeostasi muscolare, nella riparazione e nella rigenerazione e, al contrario, mediano anche le risposte patologiche alle lesioni muscolari. Come suggerisce il nome, i FAP sono stati originariamente identificati come una popolazione progenitrice con il potenziale di differenziarsi in fibroblasti e adipociti1 e sono stati pretesi per essere i principali mediatori dell'infiltrazione fibro-grassa del muscolo scheletrico in lesioni croniche e malattie. Ulteriori studi hanno rivelato che i FAP sono inoltre in grado di osteogenesi e condrogenesi2,3,4. Pertanto, sono più ampiamente notati in letteratura come progenitori mesenchimali ostromali 3,5,6,7,8. Nel danno acuto del muscolo scheletrico, i FAP aiutano indirettamente nella miogenesi rigenerativa proliferando transitoriamente per fornire un ambiente favorevole per le cellule satelliti muscolari attivate e le loro controparti progenitrici miogeniche (MP) a valle1,9,10. Parallelamente alla rigenerazione di successo, i FAP subiscono l'apoptosi, riportando il loro numero ai livellibasali1,9,10,11. Al contrario, nelle lesioni muscolari croniche, i FAP sovrascrivono i segnali pro-apoptotici, il che si traduce nella loro persistenza9,10,11 e nella riparazione muscolare anormale.

Studi in vivo che valutano i meccanismi cellulari e molecolari con cui i FAP mediano le risposte muscolari hanno utilizzato modelli animali murini fino ad oggi1,7,9,10,11,12,13,14. Mentre i topi geneticamente modificati sono potenti strumenti da utilizzare in queste analisi, le piccole dimensioni dell'animale limitano la disponibilità di tessuti per lo studio in modelli di lesioni localizzate a lungo termine in cui l'atrofia muscolare può essere profonda, come la denervazione traumatica. Inoltre, la misurazione della forza muscolare e della funzione fisica richiede misurazioni ex vivo o in situ che richiedono la cessazione del topo, o metodi in vivo che richiedono un intervento chirurgico e/o un anestetico generale per consentire la valutazione delle prestazioni contrattili muscolari15,16,17,18,19,20 . Nei ratti, esistono analisi funzionali muscolari ben convalidate e utilizzate a livello globale, oltre alle analisi per comportamenti motori più complessi come l'analisi dell'andatura (ad esempio, indice di funzione sciatica, analisi CatWalk) e vengono eseguite in animali svegli e in movimento spontaneo21,22,23,24 . Ciò ottimizza ulteriormente i principi di morbilità minima nella sperimentazione animale e il numero di animali da ricerca utilizzati. Il ratto fornisce quindi al ricercatore FAPs la flessibilità aggiuntiva di un maggiore volume muscolare ferito per analisi proteiche e cellulari e la capacità di intraprendere valutazioni seriali dell'attività e dei comportamenti funzionali statici e dinamici del complesso muscolare, nell'animale di allerta.

I FAP sono stati identificati e isolati principalmente da campioni di muscoli interi utilizzando rispettivamente la citometria a flusso e lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Si tratta di saggi basati su laser che sono in grado di identificare più popolazioni cellulari specifiche in base a caratteristiche caratteristiche come dimensioni, granularità e una combinazione specifica di superficie cellulare o marcatori intracellulari25. Questo è molto vantaggioso nello studio di un sistema di organi come il muscolo scheletrico, poiché l'omeostasi e la rigenerazione sono processi complessi e multifattoriali coordinati da una pletora di tipi di cellule. Uno studio seminale ha identificato i FAP, così come i MP, utilizzando metodi citometrici a flusso nel muscolo scheletrico del topo1. Hanno dimostrato che i FAP sono di natura mesenchimale, in quanto mancavano di antigeni di superficie specifici per le cellule di origine endoteliale (CD31), ematopoietica (CD45) o miogenica (Integrina-α7 [ITGA7]), ma esprimevano il marcatore delle cellule staminali mesenchimali Sca-1 (antigene delle cellule staminali 1)1 e differenziato in cellule fibrogene e adipogeniche in coltura. Altri studi hanno dimostrato il successo dell'isolamento dei progenitori mesenchimali nel muscolo in base all'espressione di un marcatore alternativo di cellule staminali, il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα)2,7,8 e ulteriori analisi hanno rivelato che questi probabilmente sono la stessa popolazione cellulare dei FAPs3. I FAP sono ora comunemente identificati nella citometria a flusso utilizzando Sca-1 o PDGFRα come marcatore di selezionepositiva 1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . L'uso di PDGFRα è preferenziale per il tessuto umano tuttavia, in quanto un omologo umano diretto di Sca-1 murino deve ancora essere identificato32. Inoltre, altre proteine di superficie cellulare sono state segnalate come marcatori di MP (ad esempio, VCAM-1), fornendo una potenziale alternativa a ITGA7 come indicatore di cellule di lignaggio miogenico durante l'isolamento dei FAPs33.

Mentre la citometria a flusso / FACS è una potente metodologia per studiare il ruolo e il potenziale patogenetico dei FAP nel muscolo scheletrico1,9,10,11,13,29, è limitato tecnicamente dalla specificità e dall'ottimizzazione dei suoi reagenti richiesti. Poiché l'identificazione citometrica a flusso e l'isolamento dei FAP sono stati sviluppati e condotti in modelli animalimurini1,9,10, 11,29, ciòpone sfide per i ricercatori che desiderano studiare i FAP in altri organismi modello. Molti fattori - come la dimensione ottimale del tessuto da elaborare, nonché la specificità e la disponibilità di reagenti e/o anticorpi - differiscono a seconda della specie utilizzata.

Oltre alle barriere tecniche allo studio dei FAP in un nuovo modello animale, sono state in gran parte studiate in un ambiente acuto e tossico, di solito tramite iniezione chimica intramuscolare o cardiotossina. La valutazione delle dinamiche a lungo termine dei FAP è limitata principalmente alla valutazione nella distrofia muscolare di Duchenne, utilizzando il modello murino mdx9,10,11e modelli di lesioni muscolari combinate come la rottura massiccia della cuffia dei rotatori in cui la traslazione e la denervazione del tendine concomitanti vengono eseguite sulla muscolatura della spalla26,27,28 . La risposta dei FAP al solo insulto della denervazione traumatica cronica, un evento comune negli incidenti sul posto di lavoro nell'industria pesante, nell'agricoltura e nei traumi alla nascita (lesione del plesso brachiale)34,35,36,37 con morbilità significativa, non è stata altrettanto ben caratterizzata, spesso limitata a un breve periodo di tempo11,38.

Descriviamo un metodo per identificare e isolare FAP e MP dal muscolo scheletrico sano e gravemente atrofico e fibrotico nel ratto. In primo luogo, viene dimostrata l'identificazione di MP CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- e CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizzando un protocollo di colorazione della digestione dei tessuti e della citometria a flusso e la successiva convalida dei nostri risultati viene eseguita attraverso la coltura e la colorazione immunocitochimica di cellule isolate da FACS. Usando questo metodo, riportiamo anche un nuovo decorso temporale dei FAP in un modello di lesione da denervazione isolata a lungo termine nel ratto.

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Protocol

Gli investigatori che conducono questo protocollo devono ricevere il permesso dal loro comitato etico / comitato di cura degli animali locale. Tutto il lavoro sugli animali è stato approvato dal St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC # 918) ed è stato condotto in conformità con le linee guida stabilite dal Canadian Council on Animal Care (CCAC). Uno schema del protocollo di citometria a flusso è mostrato nella Figura 1. Se l'applicazione a valle è FACS e successiva coltura cellulare, tutti i passaggi devono essere completati con una tecnica asettica adeguata.

1. Raccolta muscolare

  1. Anestetizzare i ratti utilizzando un anestetico appropriato e sacrificare secondo le linee guida locali del vivaio e del comitato etico animale. Questo protocollo raccoglie il muscolo gastrocnemio da ratti Lewis femmine adulte (200-250 g), ad esempio. I ratti sono stati anestetizzati con isoflurano al 2-3% e sono stati sacrificati mediante iniezione intracardiaca di T61.
  2. Una volta che l'animale è stato sacrificato, radere l'intero arto posteriore per facilitare la posizione del muscolo e ridurre al minimo la contaminazione della pelliccia del tessuto raccolto.
  3. Usando un bisturi sterile, fai due incisioni nella pelle: la prima intorno alla circonferenza dell'articolazione della caviglia e la seconda fino alla linea mediana dell'aspetto mediale dell'arto posteriore dalla caviglia all'anca.
  4. Staccare la pelle e gli strati muscolari superficiali per rivelare il gastrocnemio sottostante, che ha origine nei condili mediali e laterali del femore e si inserisce nel tendine di Achille.
  5. Utilizzare la dissezione smussata per separare il gastrocnemio dal tessuto circostante, maneggiando il muscolo solo dal tendine per evitare lesioni da schiacciamento.
  6. Separare il gastrocnemio dalla sua inserzione transettando il tendine di Achille nel modo più distale possibile con forbici affilate. Una volta tagliato, afferrare il tendine di Achille con una pinza e staccare delicatamente il gastrocnemio dall'osso sottostante. Tenendo ancora il muscolo con una pinza in una mano, individuare le due origini del gastrocnemio e tagliare i condili femorali mediali e laterali.
  7. Tamponare delicatamente il gastrocnemio asportato contro un pezzo sterile di garza per rimuovere più sangue possibile. Tagliare il muscolo su una superficie sterile e rimuovere il tessuto connettivo in eccesso e il tendine di Achille.
  8. Posiziona i muscoli in una barca di pesatura e pesa usando una bilancia di precisione. Questo protocollo è ottimizzato per digerire i muscoli con un peso umido che va da 200-600 mg. Gli operatori possono suddividere il tessuto raccolto in eccesso per altri saggi a valle, se lo desiderano.
  9. Dividere ulteriormente il muscolo raccolto da utilizzare per la citometria a flusso in 3-4 pezzi più piccoli (circa 1-2 cm3) e immergersi in 1x PBS ghiacciato. Mantenere freddo sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti.

2. Digestione muscolare

  1. Rimuovere il muscolo dalla PBS e metterlo in una capsula sterile di coltura cellulare di 10 cm. Strappare e tritare delicatamente il tessuto con una pinza fino a quando i pezzi sono di circa 3-4 mm3, rimuovendo il più possibile il tessuto connettivo. Una volta accuratamente tritato, trasferire in un tubo conico sterile da 50 ml contenente 6 mL dmEM + 1% penicillina/ streptomicina (P / S).
  2. Aggiungere 10 μL di soluzione di CaCl2 da 300 mM a 365 μL di soluzione di Collagenasi II (concentrazione di stock 4800 U/mL) per attivare l'enzima collagenasi. Aggiungere la soluzione di collagenasi II attivata al tubo conico da 50 ml contenente il liquame tissutale. La concentrazione finale di collagenasi II è di 250 U/mL.
  3. Incubare i tubi in uno shaker per 1 ora a 37 °C, 240 x g, assicurandosi di ruotare manualmente ogni 15 minuti per rimuovere qualsiasi tessuto che ha aderito al lato del tubo.
  4. Dopo 1 ora, rimuovere i tubi dallo shaker e aggiungere quanto segue per campione: 100 μL di collagenasi II (4.800 U/mL) e 50 μL di dispasa (4,8 U/mL).
  5. Campioni di pipetta utilizzando una pipetta sierologica 15-20 volte fino a quando la soluzione è omogenea. Se si elaborano più campioni, utilizzare una pipetta sterile separata per ciascun campione per evitare la contaminazione incrociata del campione.
  6. Incubare nuovamente in uno shaker per 30 minuti a 37 °C e 240 x g. Dopo 15 minuti, agitare i campioni a mano per rimuovere il tessuto aderente dal lato del tubo.

3. Generazione di sospensioni monocellulari

  1. Tagliare lentamente i campioni attraverso una siringa da 10 ml con un ago da 20 G per 10 cicli.
    NOTA: Un ciclo prevede l'assunzione della soluzione muscolare nella siringa e l'iniezione nel tubo. Assicurarsi di ridurre al minimo eventuali bolle completando lentamente la tosatura, poiché un'eccessiva schiuma può causare ulteriore morte cellulare39.
  2. Posizionare un filtro cellulare da 40 μm su un tubo conico sterile da 50 mL e bagnarlo pipettando 5 mL DMEM + 10% FBS e 1% P/S.
  3. Pipettare 1 mL del campione alla volta attraverso il filtro cellulare.
  4. Lavare il filtro cellulare pipettando DMEM con 10% FBS e 1% P/S attraverso il filtro per portare il volume totale nel tubo a 25 ml.
  5. Dividere equamente 25 mL del campione in due tubi conici da 15 mL e centrifugare a 15 °C, 400 x g per 15 min.
    NOTA: La scissione della soluzione muscolare in due tubi conici da 15 mL garantisce un migliore recupero cellulare dopo la centrifugazione rispetto a un singolo tubo.
  6. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL 1x tampone di lisi RBC (vedi File supplementare)a temperatura ambiente per 7 minuti per eliminare gli eritrociti.
  7. Portare il volume a 10 mL con 9 mL di tampone di lavaggio (vedi File supplementare)e centrifuga tubi a 400 x g,15 °C per 15 min.
  8. Aspirare il surnatante e ricombinare i pellet riaspensendo in 1 mL di tampone di lavaggio.
  9. Trasferire un volume appropriato di cellule in un tubo microcentrifuga separato da 1,5 ml e mescolare con colorante blu tripano. Conta le cellule vive su un microscopio ottico usando un emocitometro.

4. Colorazione anticorpale per citometria a flusso

NOTA: L'anticorpo Sca-1 deve essere coniugato all'APC prima degli esperimenti di citometria a flusso/FACS, secondo le istruzioni del produttore. Le prestazioni devono essere convalidate per ogni lotto di coniugati (Figura 2). Le coniugazioni finali possono essere conservate in aliquote da 20 μL a -20 °C e sono stabili per tre settimane. Fare riferimento al file supplementare per il protocollo di coniugazione completo.

  1. Per la citometria a flusso, trasferire 1-2 x10 6 cellule per campione sperimentale in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 ml. Portare il volume fino a 1 mL con tampone di lavaggio e mettere sul ghiaccio.
  2. Per ogni esperimento, impostare i seguenti controlli richiesti: i) non macchiati e ii) controlli di vitalità per selezionare con precisione la popolazione di cellule vive; iii) controlli di fluorescenza meno uno (FMO) su sospensioni a cella singola per impostare cancelli accurati per frazioni CD31-/CD45-, FAPs e MP; e iv) perline di compensazione monocolorate per correggere lo spillover di fluorescenza tra i canali.
    1. Per tutti i controlli cellulari, aliquota 5 x 105 - 1 x 106 celle in 1 mL di tampone di lavaggio in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e posto su ghiaccio.
    2. Per i controlli delle perline, aggiungere 1 goccia di perline di compensazione positiva (~ 1,5 x 105 perline per goccia) a ciascun tubo microcentrifuga da 1,5 mL etichettato. L'intero complemento dei controlli è elencato nella tabella 1.
      NOTA: se l'esperimento viene eseguito per la prima volta, eseguire controlli a colorazione singola per ciascun anticorpo coniugato su sospensioni monocellulari (oltre a controlli non macchiati, vitali, perline di compensazione a colorazione singola e FMO) per valutare la popolazione macchiata positiva nelle cellule e convalidare la colorazione osservata sulle perle di compensazione. Convalidare ogni preparazione Sca-1::APC appena coniugata eseguendo una singola colorazione su perline di compensazione e sospensioni a cella singola. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco completo dei controlli di colorazione.
  3. Per preparare il controllo di vitalità, trasferire metà del volume di cellule dal tubo di "vitalità" a un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Etichettare questo tubo "Morto".
  4. Incubare il tubo "morto" a 65 °C per 2-3 minuti per uccidere le cellule, quindi metterle sul ghiaccio. Dopo 2-3 minuti, ricompilare le cellule morte con le cellule vive che rimangono nel tubo di controllo della vitalità. Questa popolazione di cellule verrà utilizzata per impostare i valori di compensazione (se necessario) e impostare correttamente le porte per il colorante di vitalità.
  5. Centrifugare le sospensioni monocellulari (campioni sperimentali e controlli) a 500 x g,4 °C per 5 min.
  6. Aspirare il surnatante e ri-sospendere i pellet di cella in un tampone di lavaggio da 100 μL.
  7. Aggiungere anticorpi, a seconda del campione sperimentale o del controllo. Fare riferimento alla matrice di colorazione (Tabella 2) per informazioni sulle combinazioni e le quantità di anticorpi.
  8. Scorrere delicatamente ogni campione per garantire la miscelazione completa e incubare sul ghiaccio al buio per 15 minuti. Per la compensazione delle perline, incubare a temperatura ambiente al buio per 15 minuti.
  9. Per i campioni sperimentali e di controllo in sospensione monocellulare, portare il volume a 1 mL aggiungendo un tampone di lavaggio da 900 μL. Per i controlli delle perline di compensazione, portare il volume a 1 mL con 900 μL di 1x PBS.
  10. Centrifugare campioni di sospensione monocellulare a 500 x g,4 °C per 5 min. Controlli per perline di compensazione centrifughe a 300 x g,4 °C per 5 min.
  11. Per tutti i campioni di sospensione a cella singola, aspirare ed eliminare il surnatante e rimettere il pellet cellulare in un tampone di lavaggio da 300 μL. Per i controlli del tallone di compensazione, aspirare e scartare il surnatante, sospendere nuovamente il pellet in 300 μL di 1x PBS, quindi aggiungere 1 goccia (~ 1,5 x 105) di perline di compensazione negativa.
  12. Conservare tutti i campioni di sospensione a singola cellula su ghiaccio sotto un foglio di alluminio e procedere all'acquisizione citometrica a flusso. Anche i controlli dei talloni di compensazione devono essere protetti dalla luce, ma possono essere mantenuti a temperatura ambiente.
    NOTA: se l'endpoint sperimentale è l'identificazione dei FAPs mediante citometria a flusso, seguire i passaggi 5.1.1-5.1.11. Se l'endpoint è l'isolamento cellulare tramite FACS per la coltura e la colorazione, seguire i passaggi 5.2.1-5.2.9 e i paragrafi 6-7.

5. Citometria a flusso e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)

  1. Citometria a flusso
    NOTA: Questo protocollo utilizza un citometro a flusso da banco dotato di laser da 405 nm, 488 nm e 640 nm in grado di distinguere contemporaneamente 10 colori diversi. I filtri passa-banda e i fluorocromi associati utilizzati in questo protocollo sono i seguenti: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) e 670/30 (APC). Le tensioni per ogni rivelatore sono le seguenti: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Blu 360; APC 570. Assicurarsi di essere addestrati sul corretto funzionamento del citometro a flusso o del selezionatore di cellule prima dell'uso.
    1. Assicurarsi che il citometro sia stato acceso per 10-20 minuti prima dell'uso e che sia stato innescato pulendo sequenzialmente con soluzioni fluide pulite, risciacquate e guainate per 30-45 s ciascuna. Terminare con un risciacquo con dH2O. Assicurarsi che un volume adeguato di liquido di guaina sia stato aggiunto al contenitore di stoccaggio per mantenere il corretto flusso del campione durante l'acquisizione.
    2. Impostare la strategia di gating per identificare i FAP e i PARLAMENTARI come delineato nella Figura 3.
      NOTA: i FAP e i MP sono identificati dalla seguente strategia gerarchica di gating: i) SSC-A vs FSC-A (area di scatter delle celle laterali rispetto all'area di scatter delle celle in avanti per separare le celle vs detriti), ii) FSC-W vs FSC-H (larghezza di dispersione della cella in avanti rispetto all'altezza di dispersione della cella in avanti per discriminare i singoletti dai doppietti nel parametro FSC), iii) SSC-W vs SSC-H (larghezza dello scatter della cella laterale rispetto all'altezza dello scatter della cella laterale per discriminare le canottiere dai doppietti nel parametro SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (per distinguere le singolette vive da quelle morte), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (per escludere le celle CD31+ e CD45+ da ulteriori analisi) e vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E dal CD31-/CD45- (Lineage; Lin-) popolazione (identificazione di FAPs e MP). I FAP sono identificati come eventi CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- e i MP sono identificati come eventi CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. Per prima cosa eseguire ogni controllo del tallone di compensazione a singola colorazione attraverso il citometro a bassa velocità per generare valori di compensazione utilizzati per correggere eventuali ricadute di fluorescenza tra i canali. Valutare la compensazione confrontando il segnale fluorescente di ciascun controllo nel proprio rivelatore (ad esempio, SSC-A vs APC per perline a colorazione singola Sca-1::APC) e tutti gli altri rilevatori. Ci dovrebbero essere due popolazioni distinte (una con segnale negativo e una con segnale positivo) nel rivelatore appropriato e solo una popolazione negativa in tutti gli altri rivelatori. Imposta il cancello di arresto su 10.000 eventi di perline di compensazione e registra i dati.
      NOTA: tra un'acquisizione e l'altra di ciascun campione, assicurarsi di eseguire dH2O attraverso il citometro per 10-20 secondi per evitare la contaminazione da campione a campione.
    4. Successivamente elaborare i campioni di controllo non macchiati e di vitalità per gateare correttamente su singole celle vive. Imposta il cancello di arresto su 10.000 eventi singlet e registra i dati.
      NOTA: Circa 5 minuti prima dell'acquisizione di ogni singolo campione di sospensione cellulare ad eccezione del campione non macchiato, aggiungere 1 μL di colorante di vitalità SYTOX Blue (concentrazione di lavoro di 300 μM diluita da 1 mM di soluzione madre) a ciascun campione e scorrere delicatamente per miscelare (concentrazione finale 1 μM).
    5. Quindi acquisire i restanti campioni di controllo della sospensione a cella singola. Valutare ogni controllo FMO con il suo grafico appropriato nella strategia di gating (Figura 3). Ad esempio, valutare il segnale FITC dell'FMO CD31+CD45 per garantire un gate CD31/CD45 accurato. Un esempio ottimale è mostrato nella Figura 3G. Se il protocollo viene eseguito per la prima volta, i controlli a macchia singola sulle cellule devono essere eseguiti prima dell'acquisizione dei controlli FMO.
    6. Valutare il segnale fluorescente di ciascun campione di cella a singola macchia nel suo rivelatore appropriato e in tutti gli altri rivelatori per convalidare la corretta compensazione. Imposta il cancello di arresto su 10.000 eventi singlet dal vivo e registra sul software.
    7. Una volta che tutti i controlli (sospensioni e perline a cella singola) sono stati elaborati, preparare tutti i campioni sperimentali misurando e registrando prima il volume di ciascun campione. Queste misurazioni saranno utilizzate per quantificare con precisione FAP e MP, come descritto nella fase 5.1.11. Quindi, aggiungere 50 μL di perline di conteggio di precisione e mescolare delicatamente pipettando su e giù 2-3 volte.
    8. Eseguire brevemente il primo campione sperimentale per convalidare l'identificazione della popolazione di perline di conteggio. Questa popolazione appare come un piccolo cluster distinto separato dalla popolazione cellulare generale sul grafico FSC-A vs SSC-A (Figura 3A, riquadro rosso). Crea un cancello attorno alla popolazione di perline di conteggio. Quindi acquisire i dati per ogni campione sperimentale elaborando attraverso il citometro a bassa velocità. Imposta il cancello di arresto su 10.000 eventi di perline di conteggio e registra.
      NOTA: gli investigatori possono in alternativa identificare le perle di conteggio impostando un terreno aggiuntivo che valuti SSC-A rispetto a uno qualsiasi dei rivelatori, poiché le perle di conteggio sono fluorescenti in tutti i rivelatori.
    9. Dopo che tutti i campioni sono stati elaborati, pulire il citometro utilizzando i protocolli appropriati. Esporta tutti i dati per l'analisi.
    10. Aprire tutti i file di dati su un software di analisi della citometria a flusso appropriato. Impostare la strategia di gating utilizzata per l'acquisizione dei dati come descritto nel passaggio 5.1.2. Esaminare i controlli nello stesso ordine dell'acquisizione dei dati (ad esempio, non macchiato, vitalità, singola macchia, quindi controlli FMO) per riconvalidare la strategia di gating. Una volta che i cancelli accurati sono stati impostati utilizzando i controlli FMO, applicare i cancelli a tutti i campioni sperimentali. Esporta i dati grezzi come foglio di calcolo per la quantificazione.
    11. Calcola il numero di FAP e MP in ciascun campione sperimentale utilizzando le perle di conteggio:
      Equation 1
      dove, Il conteggio delle cellule acquisite è il numero di eventi registrati della popolazione cellulare pertinente (ad esempio VIP o MP) sul software di acquisizione; Il conteggio dei perline acquisito è il numero di eventi registrati di conteggio delle perline sul software di acquisizione; Counting Beads Volume è il volume della soluzione di perline di conteggio aggiunto nel passaggio 5.1.7; Il volume del campione è il volume di ciascun campione sperimentale colorato prima dell'aggiunta di perline di conteggio. La concentrazione di perline è il numero di perline per soluzione di μL; questo valore si trova nella scheda tecnica del prodotto.
  2. FACS - smistamento per colture cellulari
    NOTA: Questo protocollo esegue FACS su un selezionatore di celle dotato di 4 laser (UV, Viola, Blu, Rosso) che è in grado di distinguere contemporaneamente 11-14 colori. Seguire la colorazione sperimentale del campione (sezione 4) e il protocollo di citometria a flusso, con le eccezioni dei passaggi da 1 a 3 delineati di seguito, per ottimizzare il flusso di lavoro FACS:
    1. Aumentare la concentrazione di cellule nei campioni sperimentali da selezionare a 7 x 106 celle/ml per generare robuste rese di FAP e MP.
    2. Per tenere conto di questo significativo aumento della concentrazione cellulare, raddoppiare tutte le concentrazioni di anticorpi nei campioni sperimentali da selezionare.
    3. Elaborare i campioni finali di cellule colorate attraverso un tappo del filtro cellulare da 40 μM fissato a un tubo di polistirene da 5 ml immediatamente prima della cernita per ridurre l'aggregazione cellulare e aumentare le rese di selezione.
    4. Raccogliere FAP e MP di ratto singoli e vivi direttamente dalla selezionatrice cellulare in un tubo di raccolta in polipropilene da 5 ml contenente 1 mL di siero bovino fetale sterile al 100% (FBS). Mantenere le cellule sul ghiaccio fino al completamento dello smistamento.
      NOTA: se si esegue FACS in un luogo fuori sede, trasferire tutte le celle selezionate sul ghiaccio e in un contenitore coperto e protetto.
    5. Lavorando in un armadio sterile di biosicurezza (BSC), portare il volume di cellule selezionate fino a 7 ml con mezzi di crescita appropriati (ad esempio, mezzi di crescita FAP (FAP GM) per i FAP ordinati e mezzi di crescita MP (MP GM) per i MP ordinati; vedere File supplementare per le ricette) e centrifugare a 500 x g, 4 °C per 7 minuti per rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio residuo.
    6. Sostituire i pellet in 1 mL di terreno di crescita appropriato e in una piastra in una piastra a 12 pozzetti contenente un coperchio/pozzetto sterile di vetro da 12 mm rivestito di collagene per la successiva immunocolorazione (vedere paragrafo 6).
      NOTA: Se l'immunocitochimica colora per il collagene, le cellule selezionate in una piastra a 12 pozzetti contenente un coperchio / pozzetto di vetro sterile da 12 mm rivestito di laminina, invece di rivestito di collagene. Se sono necessari esperimenti di immunocitochimica di progenitori immediatamente isolati, seminare FAP e MP ad una densità di 15.000 cellule per cm2 e procedere direttamente al passaggio 6.1. Per le colture a lungo termine per indurre la differenziazione progenitrice, i FAP di semi ad una densità di 5.000 cellule per cm2e i PARLAMENTARI ad una densità di 7.500 cellule per cm2.
    7. Incubare le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore di colture cellulari. Dopo 72 ore in cultura, cambia metà dei media. Cambia completamente i supporti ogni 2-4 d dopo.
    8. Per indurre lo sviluppo dei miociti, passare le colture dei MP al mezzo di differenziazione MP (MD) il giorno 9 della coltura. Per indurre gli adipociti, passare le colture DI FAPs al mezzo di differenziazione adipogenica FAP (AD) il giorno 10 della coltura.
    9. Per indurre la fibrogenesi, i FAP possono essere commutati in mezzi di differenziazione fibrogenica (FD) in momenti variabili durante la coltura o, in alternativa, possono essere seminati direttamente in mezzi FD dopo l'isolamento (fase 5.2.6) (vedere file supplementare per tutte le ricette dei media).

6. Immunocitochimica di FAP e PARLAMENTARI in coltura

  1. Per convalidare l'ordinamento cellulare e dimostrare la purezza delle colture di FAPs e MP, immunomacchia con marcatori specifici del tipo cellulare tra cui PDGFRα (marcatore FAPs), Pax-7 (marcatore cellulare [satellite] dello stelo muscolare), proteina specifica dei fibroblasti (FSP-1, marcatore dei fibroblasti), Perilipin-1 (Plin-1, marcatore degli adipociti), Collagene di tipo 1 (Col1a1, indicatore di fibrosi), Myosin Heavy Chain (MHC, marcatore di miociti maturi).
    1. Per l'immunocolorazione delle cellule appena selezionate, centrifugare la piastra a 12 pozzetti a 200 x g per 3 minuti a temperatura ambiente per facilitare l'aderenza delle cellule al coverslip/pozzo. Questo passaggio non è necessario per le culture a lungo termine. Rimuovere i supporti della cultura.
    2. Per l'immunocolorazione con FSP-1, fissare le cellule con 1 mL di metanolo al 100% (MeOH) per 2 minuti a 4 °C. Se immunocolorante per PDGFRα, Plin-1, Pax7 o Col1a1, fissare colture cellulari con 1 mL 4% PFA in 1x PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. L'immunocolorazione MHC tollera entrambi i fissativi.
      NOTA: per le celle fisse a metanolo, saltare il passaggio 6.2 e procedere al passaggio 6.3.
  2. Aspirare il 4% di PFA e lavare rapidamente le colture cellulari 3-4 volte con 1x PBS. Aggiungere 1 mL di 100 mM di glicina in 1x PBS e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per inattivare il PFA residuo. Aspirare e lavare 1-2 volte con 1x PBS.
    NOTA: Le celle possono essere lasciate in questa fase in 2 mL di 1x PBS, avvolte in pellicola trasparente e conservate a 4 °C per un massimo di 7-10 giorni.
  3. Dopo il lavaggio, aggiungere 1 mL di Triton-X allo 0,1% in 1x PBS e incubare per 20 minuti per permeabilizzare le membrane cellulari.
  4. Lavare i pozzetti 2-3 volte con 1-2 mL di 1x PBS quindi bloccare le celle con 1 mL di 1x PBS + 3% BSA per pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente.
  5. Pipetta 80 μL di anticorpo primario diluito in 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 pulito, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) su un pezzo di parafilm fissato a un contenitore mobile. Usando una pinza fine sterile, sollevare con attenzione la slitta di copertura dal pozzo e invertire sulla goccia di soluzione anticorpale. Incubare il coperchio con due pezzi bagnati di carta assorbente e coprire il contenitore in pellicola di plastica per evitare l'evaporazione della soluzione anticorpale. Incubare durante la notte a 4 °C.
    NOTA: la colorazione dei coverslip fuori dal pozzo utilizza meno anticorpi (~ 80 μL) rispetto alla colorazione all'interno del pozzo (minimo 500 μL).
  6. Il giorno 2, lasciare le coperture a temperatura ambiente per 30 minuti per riscaldare. Usando la pinza con attenzione a destra e trasferisci le coperture ai rispettivi pozzetti (cellule rivolte verso l'alto) e lava 2-3 volte con 1-2 ml di 1x PBS per 2 minuti ciascuna per rimuovere il maggior numero possibile di anticorpi primari.
  7. Utilizzando la stessa tecnica di colorazione della colorazione degli anticorpi primari, le cellule di colore con l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488 anti-coniglio di capra (1:400) per rilevare FSP-1, Plin-1, Col1a1 o PDGFRα e l'anticorpo secondario alexa Fluor 555 anti-topo di capra (1:300) per rilevare MHC o Pax-7. Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente e mantenere le cellule protette dalla luce.
  8. Riportare le cellule al pozzo e incubare le cellule con Hoechst (1:10.000) per 2-4 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle altre 2-3 volte con 1x PBS per 2 minuti ciascuna per rimuovere l'eccesso di Hoechst.
  9. Montare i coperchi su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio fluorescente anti-dissolvenza e lasciare asciugare le diapositive durante la notte al buio a temperatura ambiente. Conservare i coperchi montati a 4 °C al buio.

7. Colorazione Oil Red O (ORO) di FAP e PARLAMENTARI coltivati

  1. Eseguire la colorazione ORO su cellule non permeabilizzate, poiché la permeabilizzazione della membrana cellulare può comportare una colorazione non specifica / indesiderata di tipi di cellule non adipogeniche. Prima di iniziare la colorazione, preparare un brodo di lavoro ORO (vedere il file supplementare per la ricetta) e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
  2. Dopo 20 minuti, filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm per rimuovere eventuali aggregati non disciolti.
  3. Aspirare i mezzi dal pozzo e aggiungere 1 mL di formalina tamponata neutra al 10% (10% NBF). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: la confluenza cellulare può comportare il sollevamento dal pozzo / coverslip. Prestare attenzione quando si aspirano/si aggiungono soluzioni.
  4. Aspirare e aggiungere 1 mL di NBF fresco al 10% e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
    NOTA: il protocollo può essere interrotto a questo punto, poiché le celle possono essere lasciate in 10% NBF durante la notte.
  5. Lavare rapidamente i pozzetti una volta con 1 mL di isopropanolo al 60%, quindi aspirare e lasciare asciugare completamente i pozzetti (circa 2 min).
  6. Aggiungere 400 μL di olio rosso O di stock di lavoro per pozzetto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi di evitare il pipettaggio di qualsiasi ORO sulle pareti della piastra.
  7. Rimuovere tutto l'Olio Rosso O e lavare rapidamente il pozzetto 4 volte con dH2O.
    NOTA: se i pozzetti macchiati contengono coverslip, montare utilizzando la stessa tecnica descritta al passaggio 6.9.
  8. Immagine di coverslip montati o del pozzo macchiato usando un microscopio a campo luminoso.

8. Colorazione tissutale di sezioni di gastrocnemio di ratto controlaterale e denervato

  1. Picrosirius Rosso (PSR)
    1. Eseguire la colorazione PSR su sezioni istoma istologica di ratto incorporato in paraffina incorporata (FFPE) con paraffina fissa in formalina di spessore 5 μm come descritto in precedenza40.
  2. Olio Rosso O (ORO)
    1. Fissare sezioni istologiche di ratto congelato con isopentano di spessore 5 μm in PFA al 4% per 10 minuti, incubare in alcool isopropilico al 60% per 1 minuto.
    2. Macchia con stock di lavoro ORO per 12 min. Incubare in alcool isopropilico al 60% per 1 minuto, lavare per 10 minuti in dH2O. Montare su coperchi utilizzando un supporto di montaggio solubile in acqua.
  3. Sca-1 e immunoistochimica fluorescente del tessuto laminina (IHC)
    1. Eseguire IHC fluorescenti su sezioni istologiche gastrocnemio di ratto congelate con isopentano di spessore 5 μm.
    2. Idratare i campioni in 1x PBS per 5 min, fissare in PFA al 4% per 10 min, quindi incubare i campioni in soluzione di blocco IF tissutale (vedere File supplementare)per 90 min.
    3. Incubare con anticorpo primario anti-Sca-1 (1:500) diluito in 1x PBS + 0,05% Tween a 4 °C durante la notte.
    4. Il giorno 2, lavare tre volte in 1x PBS + 0,05% Tween per 5 minuti ciascuno, quindi incubare in capra anti-coniglio Alexa Fluor 555 (1:500) per 1 ora.
    5. Lavare di nuovo (come prima), incubare con soluzione bloccante per 1 ora, quindi aggiungere l'anticorpo primario anti-laminina (1:500) diluito in 1x PBS + 0,05% Tween per 1 ora.
    6. Lavare di nuovo (come prima), quindi incubare in capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 (1:500) per 1 ora (per laminina).
    7. Lavare di nuovo (come prima) quindi incubare in DAPI (1:10.000) per 4 min. Lavare e montare su coverslip utilizzando un mezzo di montaggio anti-dissolvenza.

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Representative Results

Identificazione di FAP e MP tramite citometria a flusso utilizzando un nuovo pannello anticorpale tra cui Sca-1 e VCAM-1
La strategia di gating per l'identificazione dei FAP nel muscolo di ratto si basa sui protocolli di citometria a flusso nel topo29, che gate su cellule cd31 (endoteliali) e CD45 (ematopoietiche) positive (chiamato lignaggio [Lin]) ed esamina il profilo fluorescente del marcatore FAPs Sca-1 e del marcatore MP ITGA7 dalla popolazione linage-negativa (Lin-). In assenza di anticorpi validati in commercio, coniugati con fluoroforo e citometria a flusso per il ratto Sca-1 e ITGA7, abbiamo auto-coniugato un anticorpo Sca-1::APC di ratto e intrapreso una strategia alternativa per identificare i PARLAMENTARI. Poiché VCAM-1 ha recentemente dimostrato di essere un efficiente marcatore di selezione positivo singolo per l'isolamento dei MP di ratto33 ed è disponibile un anticorpo specifico per il ratto, coniugato, convalidato con citometria a flusso, mirato a VCAM-1, abbiamo utilizzato VCAM-1 per identificare i MP, al contrario di ITGA7.

Abbiamo confermato il successo della coniugazione e delle prestazioni dell'anticorpo Sca-1:APC con singola colorazione di perle di compensazione e sospensioni cellulari generate da gastrocnemio di ratto sano (Figura 2A,B). Una titolazione a cinque punti di Sca-1::APC (Figura 2C) è stata eseguita in aggiunta a tutti gli altri anticorpi (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) utilizzati nel protocollo ( Figura supplementare 1), per identificare le concentrazioni ottimali. Utilizzando questo nuovo design del pannello, i PRESUNTI FAP e MP sono stati identificati simultaneamente da gastrocnemio sano (Figura 3), in cui le cellule single-positive per Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) sono state designate FAPs (scatola rossa) e le cellule single-positive per VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) sono state designate COME MP (blue box). Abbiamo anche identificato una popolazione di cellule doppie positive per Sca-1 e VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)(Figura 3F;quadrante in alto a destra).

Validazione dell'identificazione di FAP e MP mediante FACS e coltura cellulare
Per convalidare il protocollo presentato per l'identificazione citometrica a flusso di FAP e MP nel muscolo scheletrico del ratto, abbiamo cercato di isolare le cellule vive per la coltura in vitro. Utilizzando FACS, i FAP e i PARLAMENTARI vitali sono stati isolati utilizzando la stessa strategia di gating dell'analisi citometrica a flusso. Circa 20.000-40.000 FAP e 30.000-50.000 MP sono stati raccolti per la coltura cellulare da un singolo muscolo gastrocnemio da un ratto di 230 g.

Per confermare la purezza di ogni popolazione, abbiamo co-immunoinato FAP e PARLAMENTARI appena ordinati per PDGFRα e Pax7. PDGFRα è il secondo marcatore progenitore mesenchimale, oltre a Sca-1, comunemente usato per identificare i FAPs2,7,8. Pax-7 è un marcatore ben riconosciuto e ampiamente utilizzato di cellule satelliti muscolari (staminali)41. La popolazione ordinata di FAP ha mostrato una colorazione positiva per PDGFRα senza contaminazione da parte di cellule positive Pax7 (Figura 4A; riga superiore). Al contrario, la popolazione ordinata di parlamentari è risultata positiva per Pax7 con un'assenza di cellule PDGFRα positive (Figura 4A; riga inferiore), convalidando la capacità dei profili di antigene di superficie cellulare Lin-/Sca-1+/VCAM-1- e Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ di isolare rispettivamente popolazioni pure di FAP e MP.

Successivamente abbiamo coltivato FAP e MP ordinati in un arco di tempo di 10-12 giorni in condizioni per indurre differenziazione adipogena, fibrogena e miogenica. Al giorno 12, le colture di FAP sottoposte a condizioni adipogene contenevano cellule con una morfologia simile ai fibroblasti o una morfologia multiloculare simile a quella dei pre-adipociti bianchi con goccioline di grasso (dati non mostrati). L'immunocolorazione per la proteina-1 specifica dei fibroblasti (FSP-1) ha confermato la differenziazione dei fibroblasti, mentre la colorazione per Plin-1 (Perilipin-1; un marcatore degli adipociti)42 e Oil red O ha confermato la differenziazione degli adipociti e la presenza di trigliceridi neutri e lipidi, rispettivamente (Figura 4B). L'assenza di cellule contaminanti da un lignaggio miogenico nelle colture DI FAPs è stata confermata dalla co-immunocolorazione per la catena pesante della miosina (MHC), un marker di miociti differenziati. Le colture di FAPs sottoposte a differenziazione fibrogenica (FD) sono state valutate per l'espressione di Collagene di tipo 1 (Col1a1), uno dei principali collageni derivati dai FAPs8. La co-immunocolorazione per Col1a1 e MHC al giorno 11 ha rivelato una robusta espressione di collagene di tipo 1 senza cellule MHC positive contaminanti (Figura 4B). La conferma finale della purezza della popolazione di FAPs è stata intrapresa coltivando FAP in mezzi miogenici, per incoraggiare la crescita di eventuali parlamentari contaminanti. Non sono state osservate cellule MHC positive (Figura supplementare 2A).

Le colture di MP sottoposte a condizioni miogeniche hanno dimostrato miociti maturi che esprimono MHC e miotubi multinucleati 12 giorni dopo la placcatura (Figura 4C). La co-immunocolorazione delle colture mp con FSP-1 e Plin-1 ha dimostrato l'assenza di fibroblasti o adipociti contaminanti, rispettivamente. Allo stesso modo, la colorazione ORO non ha dimostrato la contaminazione lipidica (Fig. 4C). Col1a1, che è altamente espresso dai fibroblasti, è stato anche segnalato per essere prodotto in misura minore da precursori miogenici e mioblasti, sebbene ci siano dati contraddittori in letteratura a questo proposito8,43,44. Mentre la co-immunocolorazione dei PARLAMENTARI con Col1a1 e MHC ha rivelato la differenziazione dei miociti della nostra coltura MP, non è stata trovata alcuna evidenza di immunopositività Col1a1 (Figura 4C). Per confermare ulteriormente la purezza della popolazione, le colture di MP sono state sottoposte a condizioni adipogene o fibrogene per favorire la crescita di adipociti e fibroblasti (Figura supplementare 2B). Non sono state osservate cellule contaminanti del lignaggio FAPs.

Mentre avevamo dimostrato la capacità di identificare e ordinare popolazioni pure di FAP e PARLAMENTARI dal muscolo di ratto, abbiamo successivamente cercato di determinare l'identità delle cellule Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (doppie positive). Poiché l'espressione di Sca-1 è stata riportata su una percentuale molto piccola di PARLAMENTARI (circa il 3%) nel muscolo sano45 e allo stesso modo pochi FAP (circa il 4%) sono stati segnalati per esprimere VCAM-1 nel muscolo sano10,l'immunocolorazione delle cellule Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ appena selezionate è stata eseguita per PDGFRα e Pax7 insieme alla loro coltura in miogenico, adipogenico, e condizioni fibrogene per indurre rispettivamente miogenesi, adipogenesi e fibrogenesi. Si è scoperto che le cellule doppie positive erano una popolazione mista di PARLAMENTARI e FAP, con cellule appena selezionate immunocolorate positive per PDGFRα o Pax7(Figura supplementare 3A)e cellule in coltura che si differenziavano in miociti maturi, adipociti o fibroblasti (Figura supplementare 3B,C).

ITGA7 vs VCAM-1 per identificare i PARLAMENTARI durante l'identificazione dei FAPs citometrici a flusso
Mentre è stato stabilito un protocollo di successo per l'identificazione citometrica a flusso di FAP e MP di ratto utilizzando rispettivamente Sca-1 e VCAM-1, abbiamo cercato di determinare se un anticorpo ITGA7 auto-coniugato potesse essere utilizzato in modo simile per identificare i PARLAMENTARI invece di VCAM-1, come è standard nel topo. Un anticorpo ITGA7 specifico per il ratto è stato coniugato a PE-Cy7 (vedere file supplementare) e le prestazioni dell'anticorpo sono state convalidate su perline di compensazione commerciali e sospensioni monocellulari generate da gastrocnemio di ratto (Figura supplementare 4A-C). L'anticorpo ITGA7::P E-Cy7 ha funzionato adeguatamente su singoli esperimenti di colorazione e FMO (Figura supplementare 4D). Tuttavia, quando si colorano completamente le sospensioni di cellule gastrocnemio con CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7, è diventata evidente un'interazione tra gli anticorpi Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy-7. La successiva coltura di entrambe le cellule Lin-/Sca-1+/ITGA7- selezionate facs (presunti FAP) e le cellule Lin-/Sca-1-/IGTA7+ (presunti MP)(Figura supplementare 4E)ha prodotto prevalentemente FAP e con pochi MP ( Figurasupplementare 4F), indicando l'interazione tra gli anticorpi Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy-7 ha avuto un impatto negativo sulla specificità dell'identificazione cellulare.

Un nuovo decorso temporale dei FAP nel muscolo scheletrico denervato a lungo termine
Poiché le dinamiche dei FAP sono state valutate nel contesto della denervazione traumatica a breve termine, nei modelli murini11,38, abbiamo cercato di convalidare le prestazioni del nostro metodo per l'isolamento dei FAPs dal muscolo fibrotico sia sano che gravemente atrofico. I ratti sono stati sottoposti a lesioni traumatiche da denervazione a lungo termine utilizzando il modello di transezione unilaterale del nervo tibiale ben convalidato46 con muscolo gastrocnemio raccolto in quattro timepoint seriali in 14 settimane dopo la denervazione dall'arto denervato e dall'arto innervato controlaterale (per servire come controllo interno). Come è stato precedentemente riportato, il muscolo denervato ha dimostrato atrofia progressiva (Figura 5A,B), con aumento della fibrosi e della deposizione di grasso (Figura 5C-F) nel tempo47.

Il nostro protocollo ha generato un numero adeguato di cellule per l'analisi citometrica a flusso, anche se 12 e 14 gastrocnemio denervato a settimana pesavano circa 0,2-0,3 g (15-20% del rispettivo muscolo di controllo controlaterale) (Figura 5B). Abbiamo osservato l'up-regolazione dei FAP nel muscolo gastrocnemio denervato rispetto al muscolo di controllo controlo innervato, mantenuto per la durata di 14 settimane dell'esperimento(Figura 6A,B),in concordante con la fibrosi muscolare progressiva e la deposizione di grasso. L'immunocolorazione Sca-1 delle sezioni trasversali istologiche muscolari ha confermato la localizzazione delle cellule che esprimono Sca-1 in aree di cambiamento fibro-grasso nel muscolo denervato a 14 settimane (Figura 5G), oltre all'espressione basale nell'interstizio tra miofibre nel muscolo sano. Un sottoinsieme distinto di cellule è emerso nella popolazione FAPs nel tempo post-denervazione caratterizzato da un robusto aumento del segnale Sca-1 (Sca-1 alto; Figura 6A,riquadro rosso) sull'analisi citometrica a flusso, confrontata con l'espressione basale di SCA-1 dei FAPs (Sca-1 Med/Low; Figura 6A, riquadro verde). La quantificazione di queste sottopopolazioni ha rivelato dinamiche differenziali nel tempo; I FAP alti sca-1 sono aumentati significativamente a 12 e 14 settimane dopo la denervazione (Figura 6B), comprendendo circa la metà della popolazione totale di FAP (Figura 6C). Al contrario, Sca-1 Med/Low FAPs era la sottopopolazione dominante a 2 e 5 settimane dopo la denervazione (Figura 6C) e ha mostrato solo un aumento transitorio dei livelli post-denervazione precoce (Figura 6B).

In contrasto con la presenza sostenuta di FAP nel muscolo denervato a lungo termine, i PARLAMENTARI hanno dimostrato una risposta bifasica attesa alla denervazione. Inizialmente i parlamentari sono aumentati nel muscolo denervato al di sopra di quello visto nell'arto di controllo, ma a 5 settimane dopo la denervazione la popolazione ha iniziato a diminuire (Figura 6D). In linea con il ben noto esaurimento della popolazione di cellule satelliti muscolari nel muscolo denervato a lungo termine47, entro 12 settimane i parlamentari erano pari o inferiori ai livelli basali dopo la traslazione del nervo tibiale.

Abbiamo anche analizzato la dinamica della popolazione Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (Figura supplementare 3D-E). Mentre la frequenza delle cellule doppie positive rispetto alla popolazione di Lin- è progressivamente diminuita nel muscolo denervato nel tempo, quando è stata determinata la conta cellulare assoluta per grammo di muscolo è stato osservato un aumento temporaneo della popolazione doppia positiva, prima di scendere o scendere al di sotto dei livelli basali entro 14 settimane dopo la denervazione.

Figure 1
Figura 1: Schema grafico per l'identificazione, l'isolamento e la cultura di FAP e MP: schema grafico raffigurante l'identificazione di FAP e MP da gastrocnemio di ratto. I campioni vengono raccolti e tritati meccanicamente prima di subire due digestioni enzimatiche sequenziali. I preparati tissutali vengono quindi elaborati e filtrati per generare una sospensione a singola cellula. Un cocktail di anticorpi coniugati fluorescenti viene aggiunto a ciascun campione che viene poi eseguito attraverso un citometro a flusso o un selezionatore di cellule per identificare o isolare rispettivamente i FAP e i MP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Sca-1::APC validazione e titolazione degli anticorpi autoconiugati. Validazione della coniugazione degli anticorpi Sca-1::APC mediante singola colorazione su perline di compensazione commerciale (A) e sospensioni monocellulari generate da muscolo gastrocnemio di ratto sano (B). Popolazioni distinte di perline e cellule etichettate sca-1 sono evidenti (scatole nere). La titolazione anticorpale è stata eseguita testando cinque diverse concentrazioni di Sca-1::APC su sospensioni monocellulari (C); la concentrazione ottimale è stata scelta in base alla massima intensità di fluorescenza con una colorazione di fondo minima ed è risultata dipendente dal lotto. Viene mostrata una titolazione rappresentativa con la concentrazione ottimale specifica del lotto indicata dalla casella rossa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Identificazione della citometria a flusso di FAP e MP nel gastrocnemio di ratto. (A-F) Strategia di gating per l'analisi citometrica a flusso di FAP e MP. (A) I campioni vengono prima recintati per escludere i detriti (scatola nera) e per il gate per il conteggio delle perline (scatola rossa). Le celle vengono quindi chiuse per escludere i doppietti sia per caratteristiche di scatter frontale (FSC)(B)che di scatter laterale (SSC) (C). La vitalità delle singole cellule risultanti viene valutata mediante colorazione con SYTOX Blue (D). Le singolette SYTOX Blue negative (live) vengono quindi valutate per il segnale FITC che identifica CD31 e CD45 (Lineage; Lin) al fine di escludere le frazioni di Lin+ da ulteriori analisi (scatola nera cellule di Lin) (E). La popolazione di Lin- viene quindi valutata per il segnale Sca-1::APC rispetto al segnale VCAM-1::P E (F). I FAP sono identificati come Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; casella rossa) mentre gli MP sono identificati come eventi Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ (F; riquadro blu). È anche evidente una popolazione di Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ doppia positiva (quadrante in alto a destra). (G) I controlli FMO (Fluorescence Minus One) per CD31::FITC e CD45::FITC dimostrano una corretta compensazione e gating per le cellule Lin- . (H-I) I grafici Sca-1::APC vs VCAM-1::P E dei controlli FMO dimostrano una corretta compensazione e gating per FAP (Sca-1 FMO) e MP (VCAM-1 FMO). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Coltura cellulare e immunocolorazione di FAP e MP ordinati. (A) Co-immunocolorazione per PDGFRα (verde) e Pax7 (rosso) su FAP appena ordinati (riga superiore) e MP (riga inferiore). Nuclei macchia blu con DAPI. I FAP esprimono esclusivamente PDGFRα e nessuna cellula Pax7 positiva è evidente, mentre i PARLAMENTARI esprimono esclusivamente Pax7 senza contaminazione cellulare PDGFRα positiva, dimostrando la purezza di entrambe le popolazioni selezionate. (B) FAPs al giorno 12 in mezzi di differenziazione adipogenica (AD) stain positivi per la proteina 1 specifica dei fibroblasti (FSP-1; verde) e la perilipina-1 (Plin-1; verde), dimostrando rispettivamente fibroblasti e adipociti differenziati. I nuclei sono colorati con DAPI (blu). La colorazione Oil Red O (ORO) (rosso) indica la presenza di trigliceridi neutri e lipidi derivanti da adipociti maturi entro il giorno 12. I FAP sottoposti a mezzi di differenziazione fibrogenica (FD) dimostrano l'espressione del collagene di tipo 1 derivato dai FAPs (Col1a1; verde). I FAP coltivati in mezzi adipogeni o fibrogenici non co-immunostain per la catena pesante della miosina (MHC, rosso), indicando un'assenza di miociti contaminanti. (C)I parlamentari cresciuti in mezzi di differenziazione miogenica (MD) al giorno 12 mostrano una colorazione MHC positiva (rossa) che dimostra la presenza di miociti maturi e miotubi multinucleati fusi. I nuclei sono colorati con DAPI (blu). Le colture di MP erano prive di contaminazione da fibroblasti e adipociti, come indicato dall'assenza di co-immunocolorazione per la colorazione FSP-1 (verde), Plin-1 (verde) e ORO. I parlamentari cresciuti con laminina per ospitare l'immunocolorazione Co1a1 non mostrano lo stesso grado di fusione dei miotubi entro il giorno 12 come avviene sul collagene. Col1a1 (verde) è assente dalle culture MP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Atrofia, fibrosi e infiltrazione grassa del muscolo denervato a lungo termine. (A) Muscoli gastrocnemio raccolti rappresentativi in quattro punti temporali seriali dopo la denervazione. Gastrocnemio indicato CONTRA è un campione rappresentativo di arto controlaterale da un animale denervato di due settimane. (B) Quantificazione dell'atrofia muscolare post-denervazione espressa come rapporto tra il peso umido gastrocnemio denervato (DEN) e quello dell'arto controlaterale (CONTRA). (C)Le sezioni trasversali istologiche colorate di Picrosirius Red (PSR) di gastrocnemio raccolte 2 o 14 settimane dopo la denervazione dimostrano fibrosi progressiva. Macchie muscolari gialle, macchie di collagene rosso. (D) Fibrosi quantificata determinando l'area del tessuto PSR positivo rispetto all'area totale del tessuto. (E) Olio Rosso O (ORO) sezioni trasversali colorate di gastrocnemio raccolte 2 o 14 settimane dopo la denervazione, controcolorate con ematossilina. I lipidi si colorano di rosso. (F) Infiltrazione grassa quantificata determinando l'area del tessuto colorato ORO rispetto all'area totale del tessuto. (G) Sezioni trasversali istologiche gastrocnemio raccolte 2 o 14 settimane dopo la denervazione, immunocolorate per laminina (verde) e Sca-1 (rosso). La laminina macchia positivamente la lamina basale che circonda le singole miofibre. Sca-1 identifica più tipi di cellule progenitrici. I nuclei sono colorati con DAPI (blu). L'inserto mostra la localizzazione delle cellule Sca-1+ al di fuori della lamina basale nel muscolo sano; le frecce gialle denotano la presenza di cellule Sca-1+ all'interno delle aree fibrotiche. (I dati sono medi +/- S.D; n=3 per i timepoint di 2 e 14 settimane. Dati nel pannello B analizzati da ANOVA unidirezionale, dati nei pannelli D e F analizzati da ANOVA bidirezionale. Test post-hoc di Sidak eseguito per correggere confronti multipli. * = P<0,05 tra CONTRA e DEN; # = P<0.05 tra i campioni) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Dinamica di FAPs e MP nel gastrocnemio di ratto denervato a lungo termine. (A) Rappresentante Sca-1::APC contro VCAM-1::P E della popolazione Lin- (CD31-/CD45-) da campioni muscolari raccolti 2-, 5-, 12-, o 14-settimane dopo-denervazione. La riga superiore mostra i grafici del gastrocnemio denervato (DEN), mentre la riga inferiore mostra quelli del gastrocnemio controlaterale non penetrato (CONTRA). I FAP Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (Totale) sono suddivisi in frazioni Sca-1 High (riquadro rosso) e Sca-1 Med/Low (riquadro verde), mentre i PARLAMENTARI Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ sono mostrati nella casella blu. (B) Quantificazione dei FAPs (Total, Sca-1 High, Sca-1 Med/Low) in ogni punto temporale post-denervazione, riportata come la frequenza (%) delle cellule di Lin (riga superiore) e il numero di cellule per grammo muscolare (riga inferiore) normalizzato al gastrocnemio di controllo controlaterale. (C) Proporzioni relative delle sottopopolazioni Sca-1 High e Sca-1 Med/Low della popolazione totale di FAPs. (D) Quantificazione dei parlamentari in ogni punto temporale post-denervazione riportato come la frequenza (%) delle cellule di Lin (grafico a sinistra) e come il numero di cellule per grammo muscolare (grafico a destra) normalizzato al controllo controlaterale. (I dati sono medi +/- S.D; n=4 per i timepoint di 2 e 12 settimane; n=5 per i timepoint di 5 settimane; n=2 per i timepoint di 14 settimane. Dati analizzati da ANOVA unidirezionale; Test post-hoc di Sidak per correggere confronti multipli. # = P<0,05.) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Validazione e titolazione degli anticorpi. Validazione di anticorpi CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) e VCAM-1::P E (G-I) coniugati commercialmente su perle di compensazione (A,D,G) e sospensioni unicellulari da muscolo gastrocnemio di ratto sano (B,E,H). Ogni anticorpo è stato titolato a 5 diverse concentrazioni (C,F,I). La concentrazione ottimale è stata scelta in base alla massima intensità di fluorescenza con colorazione di fondo minima (scatole rosse). Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Ordinamento di FAP e MP in condizioni di coltura di differenziazione inversa. (A) I FAP coltivati in mezzi di differenziazione miogenica (MD) al giorno 12 co-immunocolorati per FSP-1 (verde), Plin-1 (verde) o Col1a1 (verde) e MHC (rosso) non dimostrano contaminazione miocitaria. La colorazione positiva di FSP-1 e Col1a1 rivela la differenziazione dei FAP ai fibroblasti. La colorazione ORO (rossa) rivela la produzione di lipidi anche se gli adipociti Plin-1 positivi non sono facilmente visibili. Nuclei colorati con DAPI (blu). (B) I parlamentari sottoposti a mezzi di differenziazione adipogenica sono deceduti. I parlamentari coltivati in FAP Growth Media (FAP GM) per 12 giorni e co-immunocolorati per FSP-1 (verde) o Plin-1 (verde) e MHC (rosso) dimostrano miociti e miotubi differenziati con assenza di cellule positive FSP-1 o Plin-1. L'assenza di colorazione ORO conferma ulteriormente la mancanza di cellule adipogeniche in coltura. I parlamentari cresciuti in mezzi di differenziazione fibrogenica (FD) e co-immunocolorati per Col1a1 e MHC mostrano miociti maturi e un'assenza di cellule Col1a1 positive. I parlamentari cresciuti con laminina per ospitare l'immunocolorazione Col1a1 non mostrano lo stesso grado di fusione ai miotubi a 12 giorni in coltura come avviene sul collagene. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Le celluleLin-/Sca-1+/VCAM-1+ sono una popolazione mista diFAP e MP. (A) La coimmunosizione PDGFRα e Pax7 di cellule Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ appena isolate mostra una popolazione mista di cellule PDGFRα single positive (frecce bianche) e Pax7 single positive (freccia gialla) che identificano rispettivamente FAP e MP. (B) Le colture di Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ al giorno 12 coltivate in mezzi di differenziazione miogenica (MD) contengono sia cellule FSP-1 single positive (verdi) che MHC single positive (rosse) che identificano rispettivamente fibroblasti e miociti/tube. L'assenza di colorazione Plin-1 (verde) e ORO (rosso) indica l'assenza di adipociti maturi. La co-immunocolorazione per Col1a1 (verde) e MHC (rosso) mostra miociti e fibroblasti maturi. (C) Le cellule Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ al Giorno 12 coltivate in mezzi di differenziazione adipogenica (AD) mostrano similmente un mix di cellule FSP-1 (verdi) single positive e MHC (rosse) singole positive, ma anche con Plin-1 (verde) singole cellule positive e colorazione ORO presente, confermando la differenziazione di fibroblasti, miociti e adipociti. Le colture coltivate in mezzi di differenziazione fibrogenica (FD) mostrano miociti maturi e cellule col1a1 single positive (fibroblasti). (D) Rappresentante Sca-1::APC contro VCAM-1::P E della popolazione Lin- (CD31-/CD45-) da campioni muscolari denervati raccolti 2-, 5-, 12-, o 14-settimane post-denervazione; La popolazione lin-/Sca-1+/VCAM-1+ è indicata nella casella viola. (E) Quantificazione delle cellule Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ attraverso quattro punti temporali seriali post-denervazione, riportata come la frequenza delle cellule di Lin (grafico sinistro) e delle cellule per grammo muscolare (grafico destro) normalizzata al gastrocnemio controlaterale. (I dati sono medi +/- S.D; n=4 per i timepoint di 2 e 12 settimane; n=5 per i timepoint di 5 settimane; n=2 per i timepoint di 14 settimane. I dati sono stati analizzati da ANOVA unidirezionale; test post-hoc di Sidak per correggere confronti multipli; # = P<0,05.) Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: ITGA7 come marcatore di cellule miogeniche nella citometria a flusso del muscolo scheletrico del ratto. Validazione della coniugazione anticorpale ITGA7::P E-Cy7 mediante singola colorazione su perle di compensazione commerciali (A) e sospensioni monocellulari generate da muscolo gastrocnemio di ratto sano (B). Le popolazioni di perline e cellule marcate itGA7 sono evidenti (scatole nere) (C) La titolazione degli anticorpi è stata eseguita testando cinque diverse concentrazioni su sospensioni monocellulari. La casella rossa indica la concentrazione ideale. (D) I grafici dei controlli FMO (Fluorescence Minus One) dimostrano l'assenza di spillover di fluorescenza attraverso i coniugati anticorpali, ma la colorazione completa delle sospensioni cellulari rivela un'interazione non specifica tra Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7 (scatola verde). Gating (E) per separare le celle Lin-/Sca-1+/ITGA7- (presunti "FAP") e le celle Lin-/Sca-1-/IGTA7+ (presunti "MP"). (F) La coimmunosizione di colture cellulari selezionate con FACS a 12 giorni dopo la placcatura con Perilipin-1 (verde) e MHC (rosso) dimostra che entrambi i gruppi di cellule selezionate maturano prevalentemente in adipociti con pochi miociti presenti. Fare clic qui per scaricare questo file.

1. Non macchiato
2. Controllo della redditività
3. CD31 + CD45 FMO
4. Sca-1 FMO
5. VCAM-1 FMO
6. CD31 + CD45 macchia singola (perline)
7. CD31 + CD45 macchia singola (celle)
8. Sca-1 Macchia singola (perline)
9. Sca-1 Macchia singola (celle)
10. VCAM-1 macchia singola (perline)
11. VCAM-1 Macchia singola (celle)

Tabella 1: Controlli di colorazione degli anticorpi della citometria a flusso. Complemento completo di controlli di colorazione degli anticorpi. Se l'esperimento viene eseguito per la prima volta, i controlli a singola macchia devono essere eseguiti sia su perline di compensazione che su sospensioni a cella singola. Per tutti gli esperimenti successivi, i controlli a macchia singola devono essere eseguiti solo su perline di compensazione.

CD31::FITC (μg) CD45::FITC (μg) Sca-1::APC (μg)* VCAM-1::P E (μg) SYTOX Blu
(μM; Concentrazione finale)
Controllo non macchiato
-- -- -- -- --
Controlli a colorazione singola
SYTOX Blue (Controllo di vitalità) -- -- -- -- 1
CD31 e CD45 0.5 0.25 -- -- 1
Sca-1 · -- -- 0.25 -- 1
VCAM-1 · -- -- -- 0.25 1
Fluorescenza meno uno (FMO)
CD31 e CD45 -- -- 0.25 0.25 1
Sca-1 · 0.5 0.25 -- 0.25 1
VCAM-1 · 0.5 0.25 0.25 -- 1
Campioni sperimentali
Macchia completa 0.5 0.25 0.25 0.25 1

Tabella 2: Matrice di colorazione degli anticorpi della citometria a flusso. Viene mostrata la quantità di anticorpi per la colorazione di campioni sperimentali e di controllo per la citometria a flusso. Tutta la colorazione viene eseguita in un volume totale di 100 μL di tampone di lavaggio. *La quantità ottimale di anticorpi Sca-1::APC auto-coniugati può variare a seconda del lotto utilizzato. Tutti i lotti di Sca-1::APC appena coniugati devono essere prima convalidati mediante singola colorazione sia delle perle di compensazione che delle sospensioni a cella singola.

File supplementare: Ricette di reagenti. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Un protocollo di isolamento DEI FAP ottimizzato e convalidato per il muscolo di ratto è essenziale per i ricercatori che desiderano studiare modelli di lesioni che non sono fattibili nel topo per motivi biologici o tecnici. Ad esempio, i topi non sono un modello animale ottimale in cui studiare lesioni croniche locali o neurodegenerative come la denervazione a lungo termine. Biologicamente, la breve durata della vita e il rapido invecchiamento dei topi rendono difficile delineare con precisione le sequalae muscolari a causa della denervazione dal fattore confondente dell'invecchiamento. Da un punto di vista tecnico, la massa muscolare drasticamente ridotta a causa di una grave atrofia sarebbe insufficiente per un'efficace analisi citometrica a flusso. In effetti, i protocolli di isolamento dei FAP del topo suggeriscono di raggruppare i muscoli sani insieme per aumentare meglio la resa dei FAP ordinati29. Mentre questo risolve la barriera tecnica di ottenere un tessuto muscolare adeguato per l'analisi, allo stesso tempo limita i ricercatori dal valutare i FAP a livello muscolare specifico. Poiché gruppi muscolari specifici variano intrinsecamente nella loro composizione del tipo di fibra, nel grado di vascolarizzazione e nei numeri mitocondriali47, ad esempio, la combinazione di più muscoli diversi per l'analisi citometrica a flusso impedisce la caratterizzazione dei FAP specifici del muscolo. Al contrario, mostriamo che sia il gastrocnemio di ratto sano che quello denervato, atrofico e fibrotico forniscono una quantità adeguata di materiale di partenza per un'efficace citometria a flusso. Inoltre, in campioni sani, il surplus muscolare può essere ulteriormente suddiviso per più saggi a valle, consentendo ai ricercatori di analizzare contemporaneamente le caratteristiche cellulari, molecolari e istologiche dello stesso tessuto. Infine, per gli esperimenti di manipolazione dei FAP in modelli di lesione con terapie, sono disponibili analisi ben convalidate della funzione fisica e dell'andatura in ratti in allerta e attivi21,22,23,24,che consentono la valutazione seriale della funzione muscolare senza la necessità di terminazione dell'animale.

Un ostacolo chiave nella creazione di un protocollo di isolamento DEI FAP ottimizzato per il ratto era la disponibilità di anticorpi. Ilnostro approccio iniziale ha cercato di copiare il pannello anticorpale e i protocolli di strategia di gating ampiamente utilizzati nel topo1,7,8,9,10,11, 12,13,14. Mentre gli anticorpi disponibili in commercio, coniugati, testati per citometria a flusso e convalidati che riconoscono il ratto erano disponibili per i marcatori di lignaggio CD31 e CD45, nessuno esisteva per i FAP positivi che identificavano i marcatori Sca-1 o PDGFRα, così come per il marcatore di selezione negativo ITGA7. Erano disponibili anticorpi primari non coniugati specifici per questi marcatori e pretesi efficaci nella citometria a flusso, ma dei marcatori FAPs Sca-1 e PDGFRα, solo l'anticorpo Sca-1 era stato convalidato nella letteratura pubblicata nell'analisi citometrica a flusso delle cellule di ratto48. Pertanto, abbiamo selezionato Sca-1 come marcatore di selezione positivo per i FAP. La prospettiva di utilizzare anticorpi secondari per delineare i marcatori Sca-1 e ITGA7 non era fattibile per diversi motivi, ma principalmente perché gli unici anticorpi specifici per il ratto per Sca-1 e ITGA7 convalidati per la citometria a flusso sono stati generati nella stessa specie ospite. Pertanto, l'opzione rimanente era l'auto-coniugazione di entrambi gli anticorpi utilizzando kit disponibili in commercio.

Il processo di scelta di un kit ottimale per la coniugazione anticorpale è stato ampio, poiché molti kit sono completamente o parzialmente intolleranti a vari diluenti tampone (ad esempio, glicina, glicerolo, BSA, azide di sodio) presenti negli anticorpi primari. Inoltre, il fluoroforo fornito deve essere compatibile con i laser equipaggiati all'interno del citometro a flusso/selezionatore di cellule a disposizione dello sperimentatore e non emettere a una lunghezza d'onda simile ad altri fluorofori utilizzati per identificare altri tipi di cellule nel campione. La presenza di componenti diluenti negli anticorpi primari PDGFRα specifici per il ratto che erano scarsamente compatibili con i kit di coniugazione, è stata un'ulteriore considerazione nella scelta di Sca-1 come marcatore di selezione FAPs positivo in questo protocollo. Mentre questi risultati dimostrano che sia le coniugazioni Sca-1::APC che ITGA7::P E-Cy7 hanno portato all'identificazione di distinte popolazioni macchiate positivamente sia su perle di compensazione che su cellule, le prime hanno mostrato decadimento in fluorescenza prima di quanto pubblicizzato dal produttore. Si raccomanda vivamente che i ricercatori coniugino Sca-1::APC secondo le istruzioni del produttore, immediatamente prima del primo utilizzo (ad esempio, il giorno prima dell'esperimento) per garantire un segnale robusto, pianifichino gli esperimenti di conseguenza in modo tale che un singolo lotto di anticorpi coniugati possa essere utilizzato all'interno della finestra di efficacia dell'anticorpo e convalidi ogni lotto con perline di compensazione a colorazione singola e titolazione su sospensioni monocellulari. Ancora più importante, tuttavia, l'interazione critica osservata tra Sca-1::APC e ITGA7::P E-Cy7 ha impedito l'accurata delineazione delle popolazioni di FAP vs PARLAMENTARI, rendendo necessaria l'impiego di una strategia alternativa.

Boscolo Sesillo et al. hanno recentemente dimostrato il successo dell'isolamento citometrico a flusso delle cellule staminali muscolari di ratto utilizzando VCAM-1 come singolo marcatore di selezionepositiva 33 nelle cellule CD31, CD45 e CD11b negative. Con VCAM-1 come marcatore di selezione MP, abbiamo utilizzato un nuovo pannello anticorpale per identificare i FAP (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) e i MP (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) e convalidato l'approccio con la coltura in vitro di cellule selezionate FACS da muscolo gastrocnemio sano. I FAP e i PARLAMENTARI appena isolati sono immunostituiti esclusivamente per i rispettivi marcatori alternativi PDGFRα e Pax7. I FAP coltivati differenziati in popolazioni di fibroblasti e adipociti maturi e i MP in miociti / miotubi maturi. Non si è verificata alcuna contaminazione incrociata di FAP e PARLAMENTARI all'interno delle culture. L'immunocolorazione delle sezioni trasversali istologiche ha confermato l'infiltrazione di aree di degradazione fibro-grassa nel muscolo denervato con cellule Sca-1 positive.

Mentre abbiamo intrapreso l'analisi citometrica a flusso del muscolo denervato a lungo termine per convalidare il nostro protocollo in muscoli gravemente atrofici, fibrotici e infiltrati di grasso, abbiamo incidentalmente osservato l'emergere di una sottopopolazione DI FAPs con aumento del segnale Sca-1 (indicato Sca-1 High) rispetto all'espressione sca-1 al basale (indicato Sca-1 Med / Low) nel tempo. I FAP alti sca-1 sono aumentati significativamente dopo la denervazione (12 settimane in più), mentre i FAP Sca-1 Med / Low hanno raggiunto il picco all'inizio di 5 settimane prima di tornare ai livelli basali. L'eterogeneità nel fenotipo DEI FAPs è statariportata 10,30. I FAP con maggiore espressione di Sca-1 hanno dimostrato di differenziarsi più facilmente in adipociti e, se esposti alla stimolazione fibrogenica, hanno aumentato l'espressione di Col1a130,49. La dinamica delle sottopopolazioni DI FAP qui osservate sembra essere in linea con il decorso temporale delle sequele indotte dalla denervazione e la capacità rigenerativa muscolare47 e quindi può caratterizzare le sottopopolazioni di FAP con diversi programmi cellulari. I FAP alti sca-1 diventano up-regolati in momenti temporali tardivi in concomitanza con l'infiltrazione fibro / grassa e un declino del potenziale rigenerativo, mentre Sca-1 Med / Low FAPs diventano up-regolati durante la finestra rigenerativa del muscolo e possono aiutare in un'efficace miogenesi rigenerativa. Il protocollo di isolamento DEI FAP qui presentato fornisce ai ricercatori la capacità di identificare e isolare queste varie popolazioni per studi futuri.

Abbiamo identificato una popolazione di cellule che si colorano positive sia per Sca-1 che per VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) e abbiamo accertato che questa popolazione doppiamente positiva è una miscela di FAP e MP. La separazione di questa popolazione utilizzando un terzo marcatore - ITGA7 - non è stata possibile a causa dell'interazione tra gli anticorpi primari Sca-1 e ITGA7. Malecova e colleghi hanno riportato una sottopopolazione di FAP che esprimono VCAM-1 che è quasi assente nel muscolo sano, aumentata transitoriamente con infiammazione acuta e la loro persistenza nei topi mdx (modello di distrofia muscolare) è stata associata a infiammazione muscolare cronica e fibrosi10. Al contrario, e sebbene non sia una popolazione di FAP puri, abbiamo scoperto che la popolazione Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ è diminuita a o al di sotto dei livelli basali con fibrosi muscolare cronica a 12 e 14 settimane dopo la denervazione. La denervazione non induce la stessa reazione infiammatoria e i tentativi di rigenerazione ciclica sperimentati dai topi mdx, il che può spiegare le differenze nei nostri risultati. La nostra identificazione dei parlamentari nella popolazione cellulare Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ è in linea con il rapporto di espressione di Sca-1 su una percentuale molto piccola di PARLAMENTARI in muscoli sani, con un aumento transitorio a seguito di lesioni durante la proliferazione dei mioblasti e il successivo ritiro dal ciclo cellulare45. Pertanto, mentre la nostra strategia di etichettatura degli anticorpi e di gating FACS isola con successo popolazioni pure di FAP e MP per lo studio, gli esperimenti che richiedono la quantificazione basata sulla citometria a flusso di queste popolazioni possono leggermente sottostimare il loro numero a causa della piccola percentuale di cellule in entrambe le linee progenitrici che co-esprimono Sca-1 e VCAM-1. Indipendentemente da ciò, l'attuale protocollo dimostra chiaramente la classica risposta bifasica dei parlamentari alla lesione da denervazione, con sovraregolazione a breve termine e conseguente esaurimento della popolazione nel muscolo denervato a lungo termine. Allo stesso modo, l'aumento dei FAP riportato nel danno isolato da denervazione a breve termine è ricapitolato qui e dimostrato di essere ulteriormente sostenuto utilizzando il modello di transezione del nervo tibiale a lungo termine.

In sintesi, questo protocollo fornisce ai ricercatori un animale precedentemente inesplorato, il ratto, in cui utilizzare metodi citometrici a flusso per studiare contemporaneamente FAP e MP. Esperimenti su topi limitati dalla quantità di muscolo scheletrico e la frequente necessità di intraprendere esperimenti terminali per valutare la forza e la funzione muscolare, possono essere facilmente condotti nel ratto più grande e con una gamma più ampia di metodi di valutazione della forza non letale e funzionale. Nel complesso, gli studi FAPs nel ratto possono scoprire nuovi ruoli di questa popolazione progenitrice chiave nel trauma e nella malattia acuta e cronica dei muscoli e dei nervi periferici, aumentando successivamente il potenziale per lo sviluppo di terapie cellulari specifiche.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare le strutture principali della citometria a flusso presso l'Università di Ottawa e il Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto per la loro esperienza e guida nell'ottimizzazione del protocollo di citometria a flusso / FACS presentato in questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson --
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson --
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson --
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter --
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

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Biologia Numero 172 progenitori mesenchimali progenitori fibro-adipogeni progenitori miogeni citometria a flusso selezione cellulare attivata dalla fluorescenza FACS muscolo scheletrico denervazione traumatica cronica ratto atrofia muscolare fibrosi
Identificazione, isolamento e caratterizzazione di progenitori fibro-adipogeni (FAPs) e progenitori miogeni (MP) nel muscolo scheletrico nel ratto
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Te, L. J. I., Doherty, C., Correa,… More

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

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