Analyse af stentors motilitetsmønstre under og efter oral apparatregenerering ved hjælp af cellesporing

Summary

Vi præsenterer en protokol til karakterisering af bevægelighed og opførsel af en population på hundrede mikron- til millimeterstore celler ved hjælp af brightfieldmikroskopi og cellesporing. Dette assay afslører, at Stentor coeruleus overgår gennem fire adfærdsmæssigt forskellige faser, når man regenererer et tabt oralt apparat.

Abstract

Stentor coeruleus er en velkendt modelorganisme til undersøgelse af encellet regenerering. Transkriptomisk analyse af individuelle celler afslørede hundredvis af gener - mange ikke forbundet med det orale apparat (OA) - der er differentieret reguleret i faser gennem regenereringsprocessen. Det blev antaget, at denne systemiske omorganisering og mobilisering af cellulære ressourcer mod vækst af en ny OA vil føre til observerbare ændringer i bevægelse og adfærd svarende i tid til faserne af differentiel genekspression. Den morfologiske kompleksitet af S. coeruleus nødvendiggjorde imidlertid udviklingen af et assay for at fange statistikken og tidsskalaen. Et brugerdefineret script blev brugt til at spore celler i korte videoer, og statistikker blev udarbejdet over en stor befolkning (N ~ 100). Ved tab af OA mister S. coeruleus oprindeligt evnen til rettet bevægelse; derefter starter ved ~ 4 timer, udviser det et betydeligt fald i hastighed indtil ~ 8 timer. Dette assay giver et nyttigt værktøj til screening af motilitetsfænotyper og kan tilpasses til undersøgelse af andre organismer.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) er en velkendt modelorganisme, der er blevet brugt til at studere encellet regenerering på grund af dens store størrelse, evne til at modstå flere mikrokirurgiske teknikker og lette dyrkning i en laboratorieindstilling ^1,2,3. Tidlige regenereringsundersøgelser fokuserede på det største og mest morfologisk forskellige træk i Stentor - OA - som kastes fuldstændigt på kemisk chok ^4,5,6. De novo udskiftning af en tabt OA begynder med fremkomsten af et nyt membranellarbånd - en række cilia, der gradvist skifter mod den forreste del af cellen, før de danner en funktionel OA over otte morfologiske stadier³. Disse stadier er blevet observeret sekventielt, uanset temperatur, og giver et universelt referencepunkt for næsten alle undersøgelser⁵.

Mekanistisk analyse af Stentor-regenerering kræver værktøjer til måling af tidspunktet for regenerering, der er robuste og enkle nok til at blive anvendt på flere prøver som en del af en kemisk eller molekylær skærm. Standardmetoden til udførelse af et cellebaseret assay er billeddannelse, i dette tilfælde billeddannelse af dannelsen af ny OA under regenerering. Sådanne billedbaserede assays er imidlertid mest effektive, når den regenererende struktur indeholder forskellige molekylære komponenter, der kan bruges som markører, så de let kan detekteres i et fluorescensbillede. I tilfælde af Stentor OA er de kendte komponenter (cilia, basale kroppe) også til stede på resten af celleoverfladen; derfor kan anerkendelse af genoprettelsen af OA ikke opnås blot ved at lede efter tilstedeværelsen eller fraværet af en komponent.

Snarere ville en formgenkendelse være påkrævet for at detektere en OA, og dette er potentielt meget udfordrende i betragtning af det faktum, at Stentor-celler ofte ændrer form via en hurtig kontraktil proces. Dette papir præsenterer et alternativt assay til regenerering, der er afhængig af kroppens bevægelige aktivitet og OA-cilia. Når OA regenererer, gennemgår de nydannede cilier reproducerbare ændringer i position og aktivitet, hvilket igen påvirker cellens svømmemotilitet. Ved at analysere bevægelighed er det muligt at udføre et assay for "funktionel regenerering", der kvantificerer regenerering ved at kvantificere funktionen af de regenererede strukturer. Tidligere analyse af Stentor ciliary funktion under regenerering anvendte partikelbilled velocimetri kombineret med sporstofperler tilsat til det eksterne medie for at observere ændringer i strømningsmønster på forskellige stadier af regenerering⁷; Denne tilgang kræver imidlertid besværlig billeddannelse af individuelle celler og deres tilknyttede strømningsfelter, en ad gangen.

Ved at bruge selve cellens bevægelse som en proxy for cilia-genereret flow ville det være muligt at analysere et større antal celler parallelt ved hjælp af billeddannelsessystemer med lav opløsning, der er kompatible med screeningsplatforme med høj kapacitet. Dette assay kan i princippet bruges til at studere udvikling og funktionel regenerering i andre svømmeorganismer i hundredvis af mikrometer til millimeter størrelse skala. Afsnit 1 i protokollen beskriver konstruktionen af et multiwell-prøveglas, som muliggør billeddannelse med høj kapacitet af en population af celler over op til en hel dag. Der gives oplysninger om, hvordan du justerer til brug med andre celletyper. Afsnit 2 i protokollen dækker erhvervelse af videodata til dette assay, som kan udføres på et dissektionsmikroskop med et digitalt spejlreflekskamera med en enkelt linse. Afsnit 3 i protokollen giver en gennemgang af cellesporing og cellehastighedsberegning ved hjælp af MATLAB-kode (supplerende oplysninger). Afsnit 4 i protokollen forklarer, hvordan man omdanner de numeriske resultater til plots som vist i figur 1C-F og figur 2C for nem fortolkning af resultaterne.

Protocol

BEMÆRK: En population på ca. hundrede S. coeruleus-celler blev dyrket i overensstemmelse med en tidligere offentliggjort JoVE-protokol⁸.

1. Forberedelse af prøve

1. Skær et stykke 250 μm tykt silikone afstandsark (Table of Materials) lidt mindre i både højde og bredde end et mikroskopglas. Brug en 5/16 "hulstans til at skabe cirkulære brønde. Vær opmærksom på at efterlade tilstrækkelig plads mellem nabobrønde for at sikre en god tætning.
   BEMÆRK: Et mellemrum på 3 mm mellem nabobrønde viste sig at være tilstrækkeligt. Med øvelse kan ti brønde placeres på et enkelt prøveglas.
2. Initier regenerering af OA ved at inkubere cellerne i 10% saccharose eller 2% urinstof i 2 minutter (figur 1A). Vask derefter tre gange med frisk medium⁸. Pipetter forsigtigt ca. ti Stentor i hver brønd. Vær forsigtig med at matche prøvevolumen til brøndvolumen så tæt som muligt.
   BEMÆRK: For de brønddimensioner, der anvendes her, blev 12,5 μL prøve pipetteret i hver brønd.
3. Luk brøndene ved forsigtigt at sænke et stykke dækglas (se Materialetabel) over brøndene startende fra den ene kant. Brug en smal og let fleksibel genstand, f.eks. en 10 μL pipettespids, til at trykke ned på dækglasset, hvor det kommer i kontakt med silikonepladen, for at sikre en god tætning.

2. Tidsforløb for mikroskopi i synligt lys

1. Placer prøven på mikroskopstadiet, og indstil forstørrelsen til den laveste tilgængelige, så den passer godt ind i rammen i sin helhed.
   BEMÆRK: En 1,6x kameraadapter og 1x forstørrelse på målet blev brugt på mikroskopet til denne protokol.
2. Begynd time-lapse. Anskaf en 10-sek video med 30 billeder i sekundet af hver brønd på hvert tidspunkt. Hvis du bruger en mikroskopopsætning med et motoriseret X-Y-trin, skal du automatisere hele time-lapse. Ellers skal du sikre dig, at der er en bruger til stede på hvert tidspunkt for manuelt at oversætte eksemplet for at registrere hver brønd.
   BEMÆRK: Undgå at lade prøven være oplyst, når den ikke afbildes for at undgå opvarmning og fordampning. Prøvevolumenerne er små, og fordampning vil føre til luftbobler.
3. Gem film som TIFF, MOV eller AVI.
   BEMÆRK: Dette er de mest almindelige ikke-proprietære videofiltyper. Afhængigt af den specifikke mikroskopsoftware gemmes videoerne muligvis som standard til en proprietær filtype, men kan derefter eksporteres til en af de førnævnte filtyper.
4. Brug en pixel til millimeter konverteringsfaktor til fysisk skala, og udfør en kalibrering, eller brug kendt pixelstørrelse fra det anvendte kamera. For at kalibrere skal du få et klart billede af et kalibreringsdias eller en klar lineal med de samme forstørrelsesindstillinger som videoerne. Brug et hvilket som helst billedvisningsprogram til at tælle antallet af pixels mellem mærker med en kendt fysisk afstand.
   BEMÆRK: Hvis billedet af en lineal f.eks. viser 1 mm-mærket og 2 mm-mærket, der skal adskilles med 100 pixel, er omregningsfaktoren 1 mm pr. 100 pixel. Alternativt, for at udlede denne faktor fra kameraets pixelstørrelse, skal du blot gange kameraets pixelstørrelse med forstørrelsen. For eksempel, hvis det anvendte kamera har 3,45 μm pixels, og den anvendte forstørrelse var 1,6x, er konverteringen 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm pr. 1 pixel.

3. Sporing af celler

1. Download de to scripts, TrackCells.m og CleanTraces.m, til en placering på computeren, der er nem at huske. Hvis datavideoerne ikke allerede findes på denne computer, skal du overføre dem til denne computer.
   BEMÆRK: Datavideoerne og scripts behøver ikke at være i samme mappe.
2. Organiser datavideoer i mapper, en for hvert tidspunkt. Brug scriptet TrackCells.m først til at udføre automatiseret cellesporing i datavideoerne. Åbn TrackCells.m , og kør scriptet.
3. Vælg Føj til sti, hvis du bliver bedt om det af et pop op-vindue., hvilket typisk kun sker, når scriptet køres for første gang fra en given mappe. Når du bliver bedt om det, skal du vælge en eller flere datavideoer for at starte sporing, navigere til datavideoerne (afsnit 2). Vælg flere videofiler ved hjælp af Shift-click, control-click eller ved at holde venstre museknap nede, mens du flytter over filerne for at fremhæve dem.
4. Når du er tilfreds med listen over filer i filnavnet: boks nederst i promptvinduet, skal du klikke på Åbn. Udfør først en testkørsel på en video for at bekræfte, at alle parametre er indstillet korrekt (se diskussion nedenfor).
   BEMÆRK: Dette script opretter nu en mappe for hver valgt videofil. Det vil derefter skrive i denne mappe hver ramme af videoen som en .jpg fil og en fil med navnet position_estimates.mat, som indeholder alle spor, der findes i videoen. Afhængigt af størrelsen på videoerne, antallet af videoer og computerens hastighed kan dette script tage timer at køre.

4. Bekræftelse af sporing

1. Kontroller, at de trin, der er beskrevet i afsnit 3, blev fulgt korrekt, ved at kontrollere, at der ikke er nogen fejlmeddelelser, før du fortsætter. Brug scriptet CleanTraces.m til manuelt at afvise unormale eller falske spor. Åbn CleanTraces.m i MATLAB-editorvinduet ved at dobbeltklikke på filen.
2. Ved prompten Vælg datamappeoutput af TrackCells.m. Det vil have samme navn som videofilen, naviger til en af de mapper, der er oprettet som beskrevet i afsnit 3. Vælg kun én mappe.
   BEMÆRK: Dette script viser nu sporene en efter en i et pop op-vindue. De er overlejret på rammen af videoen, hvor sporet starter, i grønt og rammen af videoen, hvor sporet slutter, i magenta. Derfor bør et gyldigt spor forbinde en grøn celle og en magentacelle.
3. Når du bliver bedt om det, skal du indtaste 1 for at beholde sporingen og 0 for at afvise sporingen. Tryk på Enter for at gå videre til den næste sporing.
   BEMÆRK: Nye spor vil fortsætte med at blive vist, indtil der enten ikke er flere spor, eller de første tres er blevet vist. Når denne proces er fuldført, opretter scriptet automatisk en mappe med navnet CLEAN TRACES til lagring af output og viser alle resterende spor oven på videoens første billede (figur 1B). Dette billede gemmes automatisk som LabeledTraces.png til fremtidig reference. Alle spor, som brugeren havde valgt at beholde, gemmes i filen clean_traces.mat.
4. Udfør dette trin for alle videoer på ét tidspunkt, før du fortsætter.
   BEMÆRK: For dataene i dette manuskript blev der erhvervet en video for hver brønd på hvert tidspunkt, i alt ti videoer pr. Tidspunkt.

5. Visualisering af data

BEMÆRK: For visuelt at sammenligne bevægeligheden for hele cellepopulationen på tværs af forskellige tidspunkter blev alle spor fra afsnit 4 oversat til at begynde ved oprindelsen og skabe en radial forskydning versus tidsdiagram for hvert tidspunkt (figur 1C-F, se supplerende figur S1 for alle tidspunkter).

1. Begynd med at downloade scriptet med titlen SpaghettiPlots.m. Åbn og kør scriptet. Når et vinduesfilbrowservindue dukker op med prompten Vælg tidsmappe, der indeholder brønddata (clean_traces.mat) til graf, skal du navigere til mappen på et af tidspunkterne. Bemærk, at denne mappe skal indeholde en mappe for hver af de analyserede videoer.
2. Når du bliver bedt om kalibrering: Hvad er antallet af pixel pr. millimeter?, skal du indtaste kalibreringsværdien i trin 2.4 og trykke på Enter.
   BEMÆRK: Scriptet kombinerer nu sporene fra alle de analyserede videoer på dette tidspunkt i et enkelt plot (figur 1C-F). Svage stiplede cirkler i plottet indikerer radiale forskydninger på 1, 2, 3 og 4 mm.
3. Juster akser i plottet efter behov ved at ændre linje 55 i scriptet, som som standard er indstillet til rr = 4 for at inkludere en radius på op til 4 mm. Gem plottet.

Representative Results

Målet med dette assay er at kvantificere den gradvise ændring af bevægelsesmønstre og gradvis stigning i bevægelseshastighed fra celler inden for en stor (N ~ 100) regenererende Stentor-population. For at hjælpe med fortolkningen af resultaterne genererer den brugerdefinerede kode, der er inkluderet i denne protokol, to typer plots: en overlejring af alle cellebevægelsesspor i et sæt videodata (figur 1C-F og figur S1) og et plot af svømmehastighed efter time siden starten af regenerering (figur 2C). En population af Stentor, som regenererer normalt, bør demonstrere en stabil overgang fra retningsløs svømning til rettet svømning (figur 1G). Mens hver celle gennemgår denne overgang fuldt ud under OA-regenereringsprocessen, der spænder over ~ 8 timer, kræver variation mellem individer at se på bevægelsen af en stor befolkning samlet for at tendenser bliver tydelige.

Figur 1C-F viser den kollektive bevægelighed for den samme population af Stentor-celler ved 2, 3, 7 og 8 timer i OA-regenereringsprocessen. Disse plot viser både den forventede stigning i antallet af bevægelige individer (antal synlige spor) og den firedobbelte stigning i rækkevidden af de mest bevægelige celler i befolkningen (radial forskydning). Det er vigtigt at bemærke, at akserne er forskellige mellem de forskellige paneler i figur 1C-F, med 1 mm (time 2), 2 mm (timer 3 og 7) og 4 mm (time 8) valgt som mest passende for at fremvise bevægelsen. Ved 2 timer - det tidligste tidspunkt - bevæger ingen celler sig mere end 1 mm i løbet af 10 s-videoen, mens mange celler ved 9 timer krydsede mere end 5 mm i samme tidsrum. Supplerende figur S1 giver disse plots for fuld tidsforløb med identiske akser, der anvendes på tværs af alle plots for at give et klarere billede af den forventede stigning i motilitet i et vellykket eksperiment.

Der er en advarsel til fortolkningen af denne eksempelserie af plot. De hurtigste svømmeceller var i stand til at svømme over brønden i videoen, især hvis de (tilfældigt) startede tæt på kanten; således er de begrænset fra at svømme helt i en lige linje, og deres bevægelsesområde, som visualiseret på denne måde, vil virke mindre. Selvom dette komplicerer ethvert forsøg på at kvantificere den afstand, som cellerne har tilbagelagt, ændrer det ikke den kvalitative tendens, at bevægelsesområdet øges over mindst 8 timer. Dette er i overensstemmelse med den kendte morfologiske regenereringstidslinje (figur 2A)³.

For at kompilere populationsstatistikker blev de sporede celler klassificeret i tre forskellige kategorier: ikke-bevægelig uden synlig holdfast, ikke-bevægelig med synlig holdfast og bevægelig. Disse kategorier af adfærd blev tidligere defineret af Tartar, men aldrig kvantificeret for deres udbredelse over tid³. Figur 2B viser et stablet histogram, der opsummerer relative celletal på tværs af disse kategorier som en funktion af timer i regenerering. På alle tidspunkter var over halvdelen af cellepopulationen ikke observerbart bevægelig. Derudover blev et betydeligt antal af cellerne på senere tidspunkter fundet i kolonier med synlige holdfasts, hvilket stærkt tyder på, at de havde udforsket miljøet og fortrinsvis knyttet sig til andre af deres art. Et eksempel på dette kan ses i den sidste indsats i figur 2C.

Dette assay giver mulighed for statistisk sammenligning af svømmehastigheder i hver fase af motilitetsgendannelse. Middel- og standardafvigelsen for data i figur 2C er opsummeret nedenfor (tabel 1). Når disse statistiske mængder er blevet ekstraheret ved cellesporing, kan den bevægelse, der udvises af populationen af celler i de forskellige faser, sammenlignes nøje ved hjælp af den uparrede t-test. Som et konkret eksempel er t-statistikken, der sammenligner svømmehastighederne i fase 1 og fase 2, beregnet ved hjælp af:

hvor x₁ og x₂ angiver gennemsnitshastigheden i henholdsvis fase 1 og 2 s₁ og s₂ angiver hastighedens standardafvigelser i henholdsvis fase 1 og 2 n₁ og n₂ og angiver antallet af spor, der er udvundet i henholdsvis fase 1 og 2. Den resulterende t-statistik t₁₂ kan derefter oversættes til en p-værdi til hypotesetest. For de data, der er vist i figur 2C, er overgangene fra fase 1 til fase 2 (p < 0,1 %) og fra fase 2 til fase 3 (p < 0,1 %) statistisk signifikante, mens overgangen fra fase 3 til fase 4 (p > 20 %) ikke er det. Det er vigtigt at bemærke, at tendensen til, at cellerne bosætter sig i små kolonier i fase 4 (figur 2B, indsat), som det fremgår af råvideoerne, er et eksempel på adfærdsforskel, der ikke er godt fanget ved måling af svømmehastigheder alene. Dette forklarer den store standardafvigelse målt i fase 4 (0,26 mm/s), som igen bidrog til en lavere t-statistik, når man sammenlignede den med fase 3.

Figur 1: Cellesporing afslører gradvis genopretning af rettet svømning. (A) Saccharosechok inducerer Stentor coeruleus til at kaste membranellarbånd. (B) Eksempel på sporing af resultatet af regenerering af celler i en 10-sek. video med stribede cirkler, der angiver luftbobler i brønden. (C-F) Overlejring af alle baner ved 2 timer, 3 timer, 7 timer og 8 timer. Tiderne blev afrundet til den nærmeste time under indsamlingen af data. Stiplede cirkler angiver radiale forskydninger på en millimeter. (G) Cellemotilitet udvikler sig fra retningsløs svømning karakteriseret ved korte cirkulære baner til rettet svømning karakteriseret ved lange sinusformede baner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Motile subpopulation demonstrerer fire forskellige faser af adfærd gennem OA-regenerering. (A) Morfologi af Stentor-regenerering . (B) Normaliserede antal celler på hver gang, der var (blå) ikke bevægelige, uden synlig holdfast; (orange) ikke bevægelig, med synlig holdfast; (grøn) bevægelig. Flere datasæt, der spænder over forskellige undergrupper af timer, blev kombineret for dette tal, så det samlede celleantal pr. time varierede fra 57 til over 376. Forklaringen viser repræsentative celler under hver kategori som visualiseret af falsk farve, i magenta og grøn. (C) Boxplot af svømmehastighed; bokse strækker sig fra Q1 til Q3 kvartilværdier på hvert tidspunkt med medianværdi angivet med grønt. Scatter overlays er gennemsnitshastigheden for hver bevægelig celle. Indsats viser repræsentativ befolkningsadfærd i hver af de fire faser. Forkortelser: OA = oralt apparat; Q1 = første kvartil; Q3 = tredje kvartil. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Motilitetsanalyse som et fænotypescreeningsværktøj kræver et stort antal celler. (A, B) Sporingsresultater fra to brønde ved 12 timer (C, D) Sporingsresultater fra de samme to brønde ved 18 timer. Stentorceller viser en præference for at fastgøre i klynger, hvor nogle brønde sætter sig i kolonier timer hurtigere end andre. Stribede områder indikerer luftbobler i brønden. Klik her for at se en større version af denne figur.

	Middelværdi (mm/s)	Standardafvigelse (mm/s)
Fase 1	0.14	0.24
Fase 2	0.06	0.13
Fase 3	0.16	0.16
Fase 4	0.15	0.26

Tabel 1: Sammenligning af svømmehastigheder i hver fase af motilitetsgendannelse.

Supplerende figur S1: Befolkningssvømmemønstre gennem regenerering og videre. (Arkivfoto) Bevægelse af Stentor coeruleus celler 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 og 18 timer efter initiering af oral apparatregenerering. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende videoer 1-3: Eksempel på mikroskopivideoer af S. coeruleus til scriptfejlfinding. Afsnit 5 i protokollen kan udføres på dette sæt af tre datavideoer for en hurtig bekræftelse af, at scripts kører korrekt. Derudover giver disse videoer et konkret eksempel på kontrast- og opløsningskrav til datavideoerne. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende filer: Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Der findes i øjeblikket mange partikel- og cellesporingsalgoritmer, nogle helt gratis. Omkostninger og brugervenlighed er ofte kompromiser, der kræver kompromis. Derudover er mange af de eksisterende cellesporingsprogrammer designet til at spore langsom kravlende bevægelse af vævskulturceller snarere end stentors hurtige svømmebevægelse, som roterer under svømning og kan gennemgå pludselige retningsændringer. Efter at have testet mange af disse muligheder er protokollen, der præsenteres her, beregnet til at være en one-stop-løsning, der går hele vejen fra dataindsamling til datavisualisering ved kun at bruge billigt udstyr og en enkelt videnskabelig softwarepakke (Materialetabel). Dette er af særlig interesse for forskningslaboratorier på undervisningsfokuserede institutioner eller biofysikundervisningslaboratorier, hvor det meste af det nødvendige udstyr allerede er tilgængeligt, da det sænker barrieren for studerende at stille deres egne spørgsmål og nå frem til kvantitative resultater inden for en kort tidsramme.

Metoden præsenteret i dette manuskript kan tilpasses til kvantitativt at karakterisere motiliteten af en population af organismer i hundrede mikron til millimeter størrelse skala. Anvendelse på mindre eller større organismer vil kræve ændringer i, hvordan videodataene skal erhverves. Som anvendt på en population af regenererende S. coeruleus her gav denne protokol en tidslinje for den funktionelle genopretning af motilitet på tværs af cellepopulationen, hvilket supplerer det, der i øjeblikket er kendt om transkriptionstidslinjen. For eksempel er det kendt fra RNA-sekventering, at syntese af gener, der koder for ciliære motilitetsproteiner, ikke finder sted før flere timer i regenereringsprocessen, længe efter dannelsen af cilia selv ^9,10. Det statistisk signifikante fald i bevægelighed fra time 0-3 (fase 1) til time 4 (fase 2), der er påvist ovenfor, er i overensstemmelse med denne forsinkelse i ekspressionen af ciliære motilitetsfaktorer sammenlignet med ekspressionen af gener involveret i ciliær samling. Ingen transkriptomisk undersøgelse af Stentor-regenerering til dato var blevet udført ud over time ni, så lidt er kendt om den genomiske aktivitet. Manglen på statistisk signifikant forskel mellem time 8-10 (fase 3) og timer 11+ (fase 4) tyder på, at cellerne er fuldt regenereret på dette tidspunkt, og få gener, der er relevante for cellemotilitet, bør reguleres forskelligt ud over time 9.

To store begrænsninger for denne metode er dens manglende sporing af grupperede og / eller rørende celler og dens manglende evne til at kvantificere mere komplekse aspekter af bevægelse end svømmehastigheder eller baner. Alle partikel- / cellesporingsalgoritmer har svært ved at følge celler, der midlertidigt er visuelt blokeret af en anden celle, og når flere celler bruger flere rammer i nærheden; scriptet inkluderet her er ikke en undtagelse. Heldigvis kan frekvensen af førstnævnte reduceres effektivt ved blot at begrænse antallet af celler placeret i en brønd som diskuteret i næste afsnit. Specifikt for S. coeruleus-populationen , der blev undersøgt her, forårsagede deres præference for at bosætte sig i kolonier (figur 3), at nogle af disse celler ikke blev identificeret af scriptet. Men da alle disse celler udviser ringe eller ingen bevægelse, er statistikker om den bevægelige cellepopulation upåvirket. Derudover er videoer, hvor flere celler undgår sporing, lette at identificere og manuelt udelukke fra yderligere analyse. Med hensyn til kvantificeringen af komplekse aspekter af bevægelse antyder overgangen fra retningsløs til rettet svømning, der ses i supplerende figur S1 , kvantitative ændringer i tidskorrelationen mellem retning, gennemsnitlig acceleration og potentielt andre målbare. Hastighed og rækkevidde, de eneste mængder, der analyseres i denne protokol, repræsenterer kun et lille aspekt af bevægelse.

Endelig er nogle få dele af protokollen af særlig betydning eller konsekvens i den praktiske anvendelse. Montering af multiwell prøveglass med tynde silikoneplader, som beskrevet i protokolafsnit 1, kræver øvelse. Det er let at indføre lækager eller luftbobler i mindst en brønd, mens prøven forsegles med dækglasset. Brøndene kan opdeles over flere prøveglas for at muliggøre brug af mindre dækglas, hvilket vil gøre processen lettere (og fejl billigere). Selvom analysen, der præsenteres her, kan bruges til at karakterisere motilitetsmønstrene for en cellepopulation på et enkelt tidspunkt, demonstreres det her som et værktøj til at sammenligne motilitetsmønstre for en enkelt population over et langt tidsforløb (over 10 timer). Som med ethvert langt tidsforløb er fordampning af en våd prøve uundgåelig. Fordampning kan minimeres ved en sikker tætning af silikoneafstandsstykket i billedkammeret til både glasglasset og dækslippen. Undladelse af at gøre dette vil resultere i, at brønde lækker ind i hinanden eller luftbobler dannes inde i brøndene. For forskere, der ikke er bekendt med brugen af silikoneafstandsstykker, skal pasteuriseret kildevand eller andet rent medium pipetteres i hver brønd for at teste for lækage før brug. Dimensionerne på prøvebrøndene blev alle valgt til at fungere godt for S. coeruleus, som er ca. 1 mm i størrelse. Dette inkluderer silikoneafstandstykkelse (valgt for at begrænse S. coeruleus-cellerne , der undersøges til et todimensionelt plan), 5/16 "diameter og 10 celler pr. Brønd. Disse tal skal justeres, når denne protokol tilpasses til andre celletyper.

Flere parametre i TrackCells.m-scriptet kan justeres for at optimere automatisk celleidentifikation og sporingsvalidering. Parametrene MinCellArea og MaxCellArea (linje 15 og 16 i scriptet) giver brugeren mulighed for at indstille det acceptable størrelsesområde for en celle i kvadratpixel. Hvilke værdier der er bedst, afhænger af mange detaljer i eksperimentet, herunder cellestørrelse, kamerapixelstørrelse, forstørrelse, og om der er objekter, der kan fejlidentificeres som celler, for eksempel luftbobler. Standardværdierne på 300 og 1500 var optimale for det nøjagtige udstyr og de indstillinger, der er angivet i protokollen. Når MinCellArea og MaxCellArea er blevet optimeret, skal du indstille parameteren Threshold (Linje 17) for at ændre billedkontrast. Når de er forkert indstillet, vil celleoversigterne blive dårligt identificeret eller helt savnet, hvilket forhindrer korrekt sporing. Hvis ingen værdi af Threshold fungerer godt for korrekt sporing, kan du prøve med en video med højere kontrast, eller som er mere i fokus. Linje 218 i scriptet, bad_trks = find(strk_trks > 20); er ansvarlig for at kassere spor, der afviger fra den forudsagte bevægelse (via Kalman-filter) for mange gange. Som det er, har scriptet denne tærskel for for mange sat til 20. Reducer denne heltalsværdi til så langt som 1 for at kassere spor mere aggressivt. Forøg værdien for at kassere mindre aggressivt. Meget af TrackCells.m blev vedtaget fra multi-object tracking tutorial frit tilgængelig på http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, som læseren kunne henvise til for flere detaljer. Supplerende videoer 1-3 er eksempler på datavideoer til en testkørsel af scripts.

S. coeruleus evne til fuldt ud at regenerere en tabt OA er først blevet observeret for over et århundrede siden, men der er stadig mange åbne spørgsmål vedrørende genopretning af motilitet og adfærdsmæssige tilstande. Protokollen, der præsenteres her, er beregnet til at afmystificere kombinationen af brightfield-billeddannelse, automatiseret celleidentifikation og sporing og datavisualisering, som forfatterne anvendte til kvantitativt at karakterisere motiliteten af en population af regenererende Stentor. Denne arbejdsgang er bredt anvendelig til undersøgelse af motilitet generelt, og de inkluderede scripts og protokoller kan let vedtages til at arbejde med andre biologiske systemer af lignende størrelse og hastighed, for eksempel andre ciliater som Paramecium og Blepharisma. Desuden udvider ændring af billedkammeret (f.eks. Ved hjælp af tørre brønde eller brønde i forskellig størrelse kombineret med forskellig billedforstørrelse) i høj grad anvendeligheden af denne arbejdsgang. Det nuværende værktøjssæt til Stentor omfatter kirurgisk dissektion, osmotisk shock, RNAi, DNA/RNA-analyse og småmolekylehæmmere⁶. Metoden med høj kapacitet til kvantificering af bevægelighed, der præsenteres her, tilføjer en komplementær grad af karakterisering og vil blive brugt i fremtidigt arbejde til at undersøge motilitetsfænotyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m