Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات

Published: June 30, 2021 doi: 10.3791/62621
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

تهدف هذه الورقة إلى تقديم بروتوكول لإعداد الاندوسومات المعاد تدويرها من خلايا الثدييات باستخدام الطرد الفائق الانحدار لكثافة السكروز.

Abstract

20- الاتجار بالمخدرات بالنهر هو عملية خلوية أساسية تنظم طائفة واسعة من الأحداث البيولوجية. يتم استيعاب البروتينات من غشاء البلازما ثم يتم نقلها إلى الاندوسومات المبكرة. يمكن نقل البروتينات الداخلية إلى الليسوسوم للتحلل أو إعادة تدويرها مرة أخرى إلى غشاء البلازما. مطلوب مسار إعادة تدوير الغدد الصماء قوية لتحقيق التوازن بين إزالة مواد الغشاء من الغدد الصماء. وتفيد التقارير أن البروتينات المختلفة لتنظيم المسار، بما في ذلك عامل الريبوسيليشن ADP-6 (ARF6). الكثافة الانحدار الطرد الفائق هو أسلوب كلاسيكي يجزئ الخلية. بعد الطرد المركزي، يتم ترسيب العضيات على سطحها غير المقوي. يتم تجميع الكسور واستخدامها لتطبيقات المتلقين للمعلومات الأخرى. الموصوفة هنا بروتوكول للحصول على إعادة تدوير النعوم المحتوية على جزء من خلايا الثدييات المصابة باستخدام كثافة التدرج الطرد الفائق. تعرضت الكسور المعزولة للنشاف الغربي القياسي لتحليل محتويات البروتين الخاصة بها. من خلال استخدام هذه الطريقة ، حددنا أن غشاء البلازما الذي يستهدف الابتلاع وحركة الخلية 1 (ELMO1) ، وهو مادة توكسين C3 botulinum ذات الصلة من راس ركيزة 1 (Rac1) عامل تبادل نواة جوانين ، هو من خلال إعادة التدوير الانسطي بوساطة ARF6.

Introduction

الاتجار بالاندوسومال هو عملية فسيولوجية أساسية تورط مختلف الأحداث البيولوجية1، على سبيل المثال ، نقل مستقبلات الإشارات ، والقنوات الأيونية ، وجزيئات الالتصاق. يتم استيعاب البروتينات المترجمة في غشاء البلازما عن طريق الغدد الصماء2. ثم يتم فرز البروتينات الداخلية من قبل endosome3في وقت مبكر . وتستهدف بعض البروتينات إلى الليسوسومات لتدهور4. ومع ذلك، يتم إعادة تدوير كمية كبيرة من البروتينات مرة أخرى إلى سطح الخلية عن طريق إعادة التدوير السريع وعمليات إعادة التدوير البطيئة. في إعادة التدوير السريع ، تترك البروتينات الاندوسومات المبكرة وتعود مباشرة إلى غشاء البلازما. وعلى العكس من ذلك، في إعادة التدوير البطيئة، يتم فرز البروتينات أولا إلى مقصورة إعادة التدوير الصماء ثم يتم نقلها مرة أخرى إلى غشاء البلازما. بروتينات الشحن المختلفة، على سبيل المثال، clathrin، مجمع ريتريمر، مجمع المسترد وبروتين متلازمة ويسكوت الدريتش، ومجمع SCAR Homologue (WASH)، تشارك في عملياتإعادة تدوير الأغشية هذه4و5و6و7و8و9. توازن حدث الانسد وإعادة التدوير أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلية ويساهم في الأحداث الخلوية المختلفة10، على سبيل المثال ، التصاق الخلايا ، وهجرة الخلايا ، قطبية الخلية ، ونقل الإشارات.

ARF6، GTPase صغيرة، هو منظم ذكرت من الاتجار بالغدد الصماء7،11،12. من المثير للاهتمام، وقد أوضحت مجموعات بحثية مختلفة أهمية ARF6 في إعادة التدوير13،14،15،16،17. وتهدف الدراسة إلى التحقيق في العلاقة بين نمو العصب بوساطة ARF6 وإعادة التدوير الانسطي. يشير التقرير السابق إلى أن تفعيل ARF6 هو المنبع إلى نشاط Rac1 من خلال العمل على ELMO1-dedicator من السيتوكينسيس 1 (DOCK180) مجمع18. ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح كيف يؤدي ARF6 إلى إشارة RAC1 بوساطة ELMO1-DOCK180. واستخدمت أجهزة الطرد الفائق الانحدار للكثافة للتحقيق في دور إعادة التدوير الإندوسيتيكي بوساطة ARF6 في هذه العملية. باستخدام ذلك ، تم الحصول على إعادة تدوير الكسر المحتوي على الإنسوم من lysatesالخلية 19. تعرض الكسر للنشاف الغربي لتحليل محتوى البروتين. كشفت نتائج المؤامرة المناعية أنه في ظل وجود FE65 ، وهو بروتين محول غني بالدماغ ، زاد ARF6 النشط بشكل كبير من مستوى ELMO1 في الكسر المحتوي على الإنسوم المعاد تدويره. ويتضمن البروتوكول التالي إجراءات (1) خلايا الثدييات العابرة؛ (2) الإصابة بالخلايا الثديية؛ (2) الإصابة بخلايا الثدييات؛ (2) الإصابة بخلايا الثدييات؛ (2) الإصابة بخلايا ال (2) إعداد العينات وأعمدة تدرج الكثافة؛ و (3) الحصول على إعادة تدوير الكسر المحتوي على الإندوسوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة خلايا الثدييات والعابها

  1. طبق 2 × 106 خلايا في طبق ثقافة 100 ملم. استخدم أربعة أطباق لكل إصابة.
    ملاحظة: قد يختلف عدد الخلايا المطلوبة لخطوط الخلايا المختلفة. قد يكون التحسين ضروريا قبل الانتقال إلى خطوة العزل.
  2. في اليوم التالي، تحمى الخلايا مع ليبوفيكتامين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

2. حصاد الخلية

  1. تجاهل الثقافة المتوسطة 48 ساعة بعد العدوى.
  2. غسل الخلايا مع الجليد الباردة PBS (10 mM فوسفات الصوديوم، 2.68 mM كلوريد البوتاسيوم، 140 mM كلوريد الصوديوم) مرتين.
  3. إضافة 1 مل من الجليد الباردة PBS+ (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5x كوكتيل مثبطات البروتيز و0.5x كوكتيل مثبط فوسفاتاز) إلى كل طبق.
  4. جمع الخلايا مع مكشطة الخلية ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
  5. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام الدوار دلو سوينغ في 400 × ز لمدة 5 دقائق.
  6. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية بلطف في 5 مل من العازلة التجانس (HB; 250 mM السكروز, 3 mM imidazole في درجة الحموضة 7.4, 1 MM EDTA تكملها مع 0.03 mM سيكلوهيكسميد, 1x كوكتيل البروتيز, و1x كوكتيل مثبط فوسفاتاز).
  7. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1300 × ز لمدة 10 دقيقة.
  8. Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من HB.
  9. تجانس الخلايا مع المتجانس Dounce ل15-20 السكتات الدماغية.
    ملاحظة: يمكن استخدام طرق التجانس الأخرى، على سبيل المثال، تمرير العينة من خلال حقنة. ويمكن الكشف عن كفاءة التجانس من خلال مراقبة التجانس تحت مجهر التباين المرحلي.
  10. نقل المتجانسة إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل.
    ملاحظة: حصاد 50 ميكرولتر من المتجانسة مع 12.5 ميكرولتر من 5x عينة المخزن المؤقت وتسميته كما lysate الكلي.
  11. إضافة 0.7 مل من HB إلى المتجانسة.
  12. تدور المتجانس المخفف في 2000 × غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يحتوي بيليه على خلايا نوى وغير منقطعة.
  13. جمع 1.5 مل من supernatant وتكرار الخطوة 2.12 مرة واحدة.
  14. جمع 1.4 مل من supernatant وتسميتها بأنها ما بعد النووية العملاقة (PNS).

3. كثافة التدرج إعداد العمود

  1. نقل 1.2 مل من PNS إلى أنبوب الطرد المركزي للغاية.
  2. إضافة 1 مل من محلول السكروز 62٪ (2.351 M السكروز، 3 mM imidazole في pH 7.4) إلى العينة وتخلط جيدا عن طريق pipetting لطيف.
    ملاحظة: الحل الناتج هو محلول السكروز 40.6٪.
  3. إضافة 3.3 مل من محلول السكروز 35٪ (1.177 M السكروز، 3 mM imidazole في pH 7.4) بعناية على رأس العينة.
  4. إضافة 2.2 مل من محلول السكروز 25٪ (0.806 M السكروز، 3 mM imidazole في pH 7.4) بعناية على رأس الحل السكروز 35٪.
    ملاحظة: مؤشر الانكسار من 62٪، 40.6٪، 35٪، و 25٪ حلول السكروز في درجة حرارة الغرفة هي 1.44، 1.40، 1.39، و 1.37، على التوالي. ويمكن فحص الفهارس الانكسارية لحلول السكروز باستخدام مقياس الانكسار لضمان دقة التجربة واتساقها.
  5. ملء أنبوب الطرد الفائق مع HB.
    ملاحظة: تخزين عمود تدرج الكثافة المعدة مؤقتا عند 4 درجات مئوية.

4. تجزئة واستعادة إعادة تدوير الكسر المحتوي على الإنسوم

  1. طرد مركزي العمود في 210،000 س ز ل 3 ساعة في 4 درجة مئوية.
  2. جمع 12 كسور (1 مل لكل منهما) بعناية، بدءا من أعلى التدرج.
    ملاحظة: يجب العثور على الاندوسومات إعادة التدوير في واجهة بين حلول السكروز 35٪ و 25٪. يمكن تجميد الكسور المجمعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  3. تمييع جميع الكسور مع 1 مل من تخفيف العازلة (3 mM imidazole في pH 7.4، 1 mM EDTA).
  4. طرد مركزي العينة المخففة في 100،000 س ز ل 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
  5. أسبيرات supernatant وإضافة 50 ميكرولتر من 1x عينة العازلة لحصاد الكسور.
  6. تحليل محتويات البروتين في الكسور عن طريق النشاف الغربي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد تجزئة خلايا HEK293 غير المصابة حسب التدرج الكثافي للطرد الفائق، تم جمع 12 كسرا بدءا من أعلى التدرج. تم تخفيف الكسور المحصودة مع حاجز التخفيف بنسبة 1:1 وتعرضت لجولة ثانية من الطرد المركزي. ثم تعرضت العينات للنشاف الغربي لتحليل محتويات البروتين الخاصة بها. كما هو مبين في الشكل 1، يتم الكشف عن علامة إعادة التدوير الاندوسوم Rab11 في كسر 720. كما تم بحث علامات فرعية أخرى، بما في ذلك β-COP، COX IV، GAPDH، EEA1، Rab7، و Lamp1. كما يتم الكشف عن إشارة EEA1 إيجابية في الكسر 7 كذلك. تم قياس كثافة النطاق من GAPDH ، COX IV ، و Rab11 في كل من الكسر 7 وPNS مع برنامج ImageLab (Bio-Rad). تم حساب نسب كثافة العلامات في الكسر 7 إلى PNS وتم التعبير عنها في مخطط شريطي ± SD.

وتشير الدراسات السابقة إلى أن ARF6 و ELMO1 تتفاعل مع FE65 لتعزيز Rac1 بوساطة نيوريت نمو21،22. وبما أن ARF6 هو منظم لإعادة التدوير الإندوسيتيك واستهداف غشاء البلازما ELMO1 أمر بالغ الأهمية لتنشيط Rac1 اللاحق ، فمن المفترض أن FE65 يربط ARF6 و ELMO1 للتوسط في الاتجار ELMO1 إلى غشاء البلازما. لذلك ، تم استخدام هذه الطريقة للتحقيق في مستوى ELMO1 في الإنوسومات المعزولة لإعادة التدوير. تم تحويل خلايا HEK293 إما مع ELMO1، ELMO1 + ARF6 Q67L، أو ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. لم يتم العثور على أية تغييرات في توزيع ELMO1 مع ARF6 Q67L و FE65 الإفراط في التعبير(الشكل 2A). بعد ذلك، تمت مقارنة مستوى ELMO1 في الكسر 7 (Rab11-positive) بين عمليات العدوى المختلفة. تم العثور على كمية ELMO1 في الكسر لرفع بعد transfection المشترك من ARF6 Q67L. ويلاحظ زيادة أخرى في مستوى ELMO1 عندما يتم التعبير عن كل من ARF6 Q67L و FE65(الشكل 2B). وعلى العكس من ذلك، فإن خروج المغلوب من FE65 قلل من إثراء ELMO1 بوساطة ARF6 في الكسر 7(الشكل 2C).

Figure 1
الشكل 1:تم العثور على إعادة تدوير الاندوسومات في الكسر 7 بعد الطرد الفائق الانحدار الكثافة. تم تجزئة خلايا HEK293 غير المصابة وتم تحليل محتويات البروتين في الكسور التي تم الحصول عليها مع النشاف الغربي. تم الكشف عن Rab11 في الكسر 7 مع الأجسام المضادة Rab11 (1:500). تم الكشف عن علامات فرعية أخرى مع أجسامها المضادة المحددة، بما في ذلك β-COP (1:1000)، COX IV (1:1000)، GAPDH (1:10،000)، EEA1 (1:1000)، Rab7 (1:500)، و Lamp1 (1:1000). الكسر 1 هو الكسر العلوي الأقل كثافة، بينما الكسر 12 هو الكسر السفلي الأكثر كثافة. يظهر المخطط الشريطي نسبة GAPDH و COX IV و Rab11 في الكسر 7 إلى PNS ± SD. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشان، و. و. ر. وآخرون22. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التعبير عن FE65 يعزز إعادة تدوير الغدد الصماء بوساطة ARF6 من ELMO1. (أ) تم تجزئة الخلايا المصابة إما ELMO1 أو ELMO1 + ARF6 Q67L أو ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 باستخدام الطرد الفائق الانحدار الكثافة. وقد تعرضت جميع الكسور للنشاف الغربي لتحليل توزيعات ELMO1 و ARF6 Q67L و FE65. الكسر 1 هو الكسر العلوي الأقل كثافة، بينما الكسر 12 هو الكسر السفلي الأكثر كثافة. (ب)تم تحليل الكسر 7 إيجابية Rab11 من transfections مختلفة مع النشاف الغربية لتقييم مستويات ELMO1 و ARF6 Q67L. تم رفع كمية ELMO1 في الكسر 7 عندما كانت الخلايا تشارك في العدوى مع ARF6 Q67L. يزيد التعبير المشترك عن ARF6 Q67L و FE65 من كمية ELMO1 في الكسر. (ج) تم نقل النوع البري HEK293 مع ELMO1 أو ELMO1 + ARF6 Q67L ، في حين تم تحويل FE65 KO HEK293 مع ELMO1 + ARF6 Q67L. وقد تضاءل إثراء ELMO1 بوساطة ARF6 في الجزء 7 بشكل كبير في خلايا FE65 KO. (ب-ج) تم فحص علامة إعادة تدوير الاندوسوم Rab11 (1:500) وعلامة السيتوسول GAPDH (1:10,000). تم الكشف عن ELMO1 و FE65 و ARF6 Q67L مع المضادة ELMO1 B-7 (1:1000)، ومكافحة FE65 E-20 (1:1000)، ومكافحة myc 9B11 (1:5000)، على التوالي. تم التعبير عن المستوى النسبي ل ELMO1 في الكسر 7 كنسبة الكثافة ل ELMO1 في الكسر 7/total ELMO1. تم الحصول على بيانات المخطط الشريطي من ثلاث تجارب مستقلة. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Bonferroni اللاحق للتحليل الإحصائي. *p < 0.001. النتائج هي متوسط أضعاف التغيير ±SD 22. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشان، و. و. ر. وآخرون22. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يحدد البروتوكول أعلاه إجراءات عزل الاندوسومات المعاد تدويرها عن الخلايا المستزرعة عن طريق الطرد المركزي الفائق. وقد ثبت موثوقية هذه الطريقة من خلال أحدث نشر22، مما يثبت أن إعادة تدوير الاندوسومات يتم عزلها بنجاح من العضيات الأخرى(الشكل 1)، مثل جهاز غولجي والميتوكوندريا. وينبغي إيلاء الاهتمام لبعض الخطوات الحاسمة للحصول على نتيجة فصل جيدة. أثناء إعداد حلول السكروز ، يوصى بالتحقق من صحة الفهارس الانكسارية للحلول باستخدام مقياس الانكسار. مؤشر الانكسار من 62٪، 35٪، و 25٪ حلول السكروز في درجة حرارة الغرفة هي 1.44، 1.39، و 1.37، على التوالي. أيضا، ينبغي تجنب فقاعات الهواء من التدرج. قد يؤدي وجود فقاعات في العمود إلى تعطيل استمرارية التدرج. يجب تجنب المنظفات في عملية التجانس لأنها تضر غشاء العضيات. وهذا يؤدي إلى إطلاق البروتينات من العضيات المرتبطة بالغشاء ويمكن أن يؤدي إلى تلوث شديد. أيضا، يجب أن يتم تبريد جميع أدوات التجانس قبل استخدامها لتجنب تدهور البروتين أثناء التجانس. بمجرد إعداد التدرج، يجب استخدامه في أقرب وقت ممكن. وعلى الرغم من أن التدرج المعد يمكن تخزينه مؤقتا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية (1-2 ساعة)، فإن التخزين المطول قد يتداخل مع تدرج الكثافة بسبب الانتشار.

السكروز هو وسيلة التدرج المستخدمة على نطاق واسع بسبب سهولة توافرها. في الواقع، هناك العديد من البدائل الأخرى، بما في ذلك Percoll وفيكول-40023،24. هذه الوسائط لها خصائص فيزيائية مختلفة بالمقارنة مع السكروز. على سبيل المثال، لدى Percoll تناضح و لزوجة أقل من السكروز. وتسمح هذه الجسيمات بالانطاق السريع باستخدام قوى طرد مركزي أقل. Ficoll-400 لديه نفاذية أقل نحو الأغشية من السكروز بسبب وزنه الجزيئي العالي والمحتوى المنخفض من المواد القابلة للطلب. ولذلك، تغيير المتوسطة الانحدار قد يحقق كفاءة عزل الاندوسوم أعلى.

وبصرف النظر عن الكثافة الانحدار الطرد الفائق، يمكن استخدام أساليب أخرى كتجزئة الخلية، بما في ذلك التدفق الحر الكهربائي (FFE)25،والفلورسينس تنشيط فرز العضيات (FAOS)26،والصعق المناعي27. FFE هو وسيلة فصل المرحلة السائلة. تتدفق العينة عبر حاجز الفصل تحت تأثير حقل كهربائي عمودي على اتجاه التدفق. تختلف مستويات انحراف العضيات المختلفة استنادا إلى الشحنات السطحية25. تستخدم FAOS عادة علامة فلورية أو جهازا مضادا لتسمية عضو معين ثم يتبعه قياس التدفق الخلويللعزلة 28و29. يعتمد العلاج المناعي على اكتشاف مستضدات محددة على سطح العضية المستهدفة وهطول الأمطار اللاحق بواسطة الأجسام المضادة30.

عند المقارنة مع هذه البدائل، فإن الطرد الفائق الانحدار الكثافة له مزاياه الخاصة. أولا وقبل كل شيء، يمكن الحصول على ملف توزيع البروتين المهتمة عن طريق أداء النشاف الغربية مع الكسور المعزولة(الشكل 2A). يمكن بسهولة اكتشاف أي تغييرات في توطين البروتين دون الخلوي. كما أن أجهزة الطرد المركزي الفائق أداة قياسية في معظم المعاهد، كما أن المتطلبات التقنية لتشغيل أجهزة الطرد المركزي منخفضة. وعلى النقيض من ذلك، يلزم وجود مقياس للخلايا التدفقية ونظام محدد للكهربائية لعملية عزل منظمة الأغذية والزراعة ومنظمة الأغذية والزراعة على التوالي. لا توجد معدات محددة مطلوبة للانسول المناعي. ومع ذلك، فإنه يستخدم أساسا لعزل الاندوسومات من عدد قليل من الخلايا. مقياس إعداد الطرد المركزي الفائق أكبر من مقياس المناعة. الى جانب ذلك ، الأجسام المضادة ذات خصوصية عالية ضرورية للانسول المناعي31. وعلاوة على ذلك، لا يمكن استخدام العازلة التي تحتوي على الملح والمنظفات العالية في خطوات الغسيل لضمان سلامة الانسومات. وهذا قد يؤدي إلى خلفية عالية والحد من نقاء organelle معزولة31.

وبما أن الطرد الفائق الانحدار للكثافة يفصل العضيات على أساس الكثافة، فإن أهم قيوده هو حل القوة تجاه العضيات ذات الكثافة المماثلة. كما هو مبين في الشكل 1، يتم الكشف عن كل من Rab11 و EEA1 في الكسر 7 بسبب الخصائص الفيزيائية المماثلة لإعادة التدوير وال endosomes المبكر. هناك حاجة إلى مزيد من المقايسات لتأكيد التغيرات في مستوى البروتين المستهدف في إندوسوم إعادة التدوير. في الدراسة السابقة، تم إجراء التخسين المناعي المشترك على ELMO1 و Rab11 في الخلايا22. وبالإضافة إلى إجراء عمليات فحص أخرى، يمكن اتخاذ بعض التدابير للتغلب على هذه المشكلة. يمكن لتدرج الكثافة المستمر حل العضيات مع اختلافات الكثافة الطفيفة32. ومع ذلك، العائد في تدرج مستمر أقل بكثير من التدرج متقطع. فمن الممكن للتلاعب كثافة الإندوسوم عن طريق ما قبل علاج الخلايا مع حبات اللاتكس33. يتم استيعاب الخرز من قبل الخلايا عن طريق بطانة الرحم. يتم تقليل كثافة الخرز التي تحتوي على الاندوسومات بشكل كبير ويمكن فصلها عن العضيات الأخرى. عادة، إضافة مستوى آخر من العزلة يمكن أن تحسن بشكل كبير عزل العضيات مع كثافات مماثلة. على سبيل المثال، إجراء الاعياء المناعي من الكسر المعزول34. باستخدام الأجسام المضادة محددة، يمكن فصل إعادة تدوير الاندوسومات من الملوثات. ويمكن أيضا أن تستخدم الأجسام المضادة المسموعة ذات الفلورسنت والمسابير، جنبا إلى جنب مع تحليل قياس التدفق الخلوي، لعزل الاندوسوم الدقيق28. ينطبق FFE أيضا لفصل العضيات ذات الكثافات المماثلة استنادا إلى الشحنة السطحية25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من أموال من مجلس منح البحوث في هونغ كونغ، وخطة المنح المباشرة CUHK، وصندوق الهبات التابع للكلية المتحدة، والصندوق الاستئماني الخيري التابع ل TUYF. تم اقتباس الأرقام في هذا العمل من منشورنا السابق ، "ARF6-Rac1 إشارة بوساطة نمو neurite هو potentiated من قبل محول الخلايا العصبية FE65 من خلال تنسيق ARF6 و ELMO1" المنشورة في مجلة FASEB في أكتوبر 2020.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm Beckman Coulter 347287
100 mm tissue culture dish SPL 20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm Beckman Coulter C14277
5x Sample Buffer GenScript MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 4850S Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide Sigma-Aldrich C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL DWK Life Sciences 357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose HyClone SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7) Santa Cruz Biotechnology SC-271519 Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
FE65 antibody (E-20) Santa Cruz Biotechnology SC-19751 Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade HyClone SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) Ambion AM4300 Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software Bio-Rad Measurement of band intensity
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody Sigma G6160 Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb Cell Signaling Technology 2276S Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Calbiochem 4010-OP
Optima L-100 XP Beckman Coulter 392050
Optima MAX-TL Beckman Coulter A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media Gibco 31985070
PBS Tablets Gibco 18912014
PhosSTOP Roche 4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody Proteintech 20229-1-AP Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose Affymetrix AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 172، ARF6، الطرد الفائق الانحدار الكثافة، الكسر، Rab11، إعادة تدوير الإندوسوم، السكروز
كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, W. W. R., Zhai, Y. Q., Lau, K. … More

Chan, W. W. R., Zhai, Y. Q., Lau, K. F. Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (172), e62621, doi:10.3791/62621 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter