Summary
Dette papir har til formål at præsentere en protokol til forberedelse af genanvendelse endosomes fra pattedyr celler ved hjælp af saccharosetæthed gradient ultracentrifugering.
Abstract
Endosomal handel er en vigtig cellulær proces, der regulerer en bred vifte af biologiske begivenheder. Proteiner internaliseres fra plasmamembranen og transporteres derefter til de tidlige endoomer. De internaliserede proteiner kan overføres til lysosomet til nedbrydning eller genbruges tilbage til plasmamembranen. En robust endoytisk genbrugsvej er nødvendig for at afbalancere fjernelsen af membranmaterialer fra endokytose. Forskellige proteiner rapporteres at regulere vejen, herunder ADP-ribosylation faktor 6 (ARF6). Tæthedsgradient ultracentrifugering er en klassisk metode til cellefraktionering. Efter centrifugeringen er organeller sedimenteret på deres isopykiske overflade. Brøkene indsamles og bruges til andre downstream-applikationer. Beskrevet her er en protokol for at opnå en genanvendelse endosome-holdige fraktion fra transfected pattedyr celler ved hjælp af tæthed gradient ultracentrifugering. De isolerede fraktioner blev udsat for standard vestlige blotting for at analysere deres proteinindhold. Ved at anvende denne metode, identificerede vi, at plasmamembran målretning af opslugt og celle motilitet 1 (ELMO1), en Ras-relaterede C3 botulinum toksin substrat 1 (Rac1) guanine nukleotid udveksling faktor, er gennem ARF6-medieret endokritisk genanvendelse.
Introduction
Endosomal handel er en vigtig fysiologisk proces, der implicerer forskellige biologiske hændelser1, for eksempel transport af signalering receptorer, ion kanaler, og vedhæftning molekyler. Proteiner lokaliseret på plasmamembranen internaliseres ved endokytose2. De internaliserede proteiner sorteres derefter efter den tidlige endosome3. Nogle af proteinerne er målrettet mod lysosomer til nedbrydning4. Men en betydelig mængde proteiner genbruges tilbage til celleoverfladen ved hurtig genanvendelse og langsomme genanvendelsesprocesser. Ved hurtig genanvendelse forlader proteiner de tidlige endoomer og vender direkte tilbage til plasmamembranen. Omvendt sorteres proteiner først i langsom genanvendelse til det endoytiske genbrugsrum og transporteres derefter tilbage til plasmamembranen. Forskellige lastproteiner, for eksempel clathrin, retromer kompleks, retriever kompleks og Wiskott-Aldrich syndrom protein, og SCAR Homologue (WASH) kompleks, deltage i sådanne membran genanvendelse processer4,5,6,7,8,9. Balancen i endokytose og genanvendelse begivenhed er afgørende for celle overlevelse og bidrager til forskellige cellulære begivenheder10, for eksempel, celle vedhæftning, celle migration, celle polaritet, og signal transduktion.
ARF6, en lille GTPase, er en rapporteret regulator for endokritisk handel7,11,12. Af interesse har forskellige forskergrupper illustreret betydningen af ARF6 i endokritisk genanvendelse13,14,15,16,17. Undersøgelsen har til formål at undersøge forholdet mellem ARF6-medieret neurit udvækst og endokritisk genanvendelse. Den tidligere rapport tyder på, at aktiveringen af ARF6 er opstrøms til Rac1 aktivitet ved at handle på ELMO1-dedicator af cytokinesis 1 (DOCK180) kompleks18. Det er dog fortsat uklart, hvordan ARF6 udløser ELMO1-DOCK180-medieret Rac1-signalering. Density gradient ultracentrifugering blev anvendt til at undersøge den rolle, ARF6-medieret endokritisk genanvendelse i en sådan proces. Ved at bruge dette blev genanvendelses-endosome-holdige fraktion opnået fra cellelytter19. Fraktionen blev udsat for vestlig blotting for proteinindhold analyse. Immunoblot-resultaterne viste, at under tilstedeværelse af FE65, et hjerneberiget adapterprotein, øgede aktiv ARF6 betydeligt elmo1-niveauet i genanvendelses-endosomeholdig fraktion. Følgende protokol omfatter procedurerne for (1) transfecting pattedyrceller; 2) udarbejdelse af prøverne og densitetsgradientkolonnerne og (3) opnåelse af den genanvendelses-endosomeholdige fraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pattedyrs cellekultur og transfekt
- Plade 2 x 106 celler i en 100 mm kulturret. Brug fire retter til hver transfekt.
BEMÆRK: Antallet af celler, der kræves, kan variere for forskellige cellelinjer. Optimering kan være nødvendig, før du går videre til isolationstrinnet. - Den næste dag, transfect cellerne med Lipofectamin i henhold til producentens anvisninger.
2. Cellehøst
- Kassér kulturmediet 48 timer efter transfection.
- Cellerne vaskes med iskold PBS (10 mM natriumphosphater, 2,68 mM kaliumchlorid, 140 mM natriumchlorid) to gange.
- Tilsæt 1 mL iskold PBS+ (PBS suppleret med 0,5x proteasehæmmercocktail og 0,5x fosfatasehæmmercocktail) til hver skål.
- Saml cellerne med en celleskraber og overfør celleaffjedringen til et 15 mL centrifugerør.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved hjælp af en sving spand rotor på 400 x g i 5 min.
- Kassér supernatanten og genbrug cellepillen forsigtigt i 5 mL homogeniseringsbuffer (HB; 250 mM saccharose, 3 mM imidazole ved pH 7,4, 1 mM EDTA suppleret med 0,03 mM cycloheximidimid, 1x protease inhibitor cocktail og 1x fosfatase hæmmer cocktail).
- Saml cellerne ved centrifugering ved 1.300 x g i 10 min.
- Brug cellepillen igen i 1 minut HB.
- Homogeniser cellerne med en Dounce homogenisator til 15-20 slag.
BEMÆRK: Andre homogeniseringsmetoder, f.eks. ved at overføre prøven gennem en sprøjte, kan anvendes. Homogeniseringseffektiviteten kunne afsløres ved at observere homogenatet under et fasekontrastmikroskop. - Homogenatet overføres til et 2 mL centrifugeringsrør.
BEMÆRK: Høst 50 μL homogenat med 12,5 μL 5x prøvebuffer og mærk det som total lysat. - Der tilsættes 0,7 mL HB til homogenatet.
- Spin det fortyndede homogenat ved 2.000 x g i 10 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Pellet indeholder kerner og ubrudte celler. - Saml 1,5 mL af supernatanten, og gentag trin 2.12 én gang.
- Saml 1,4 mL af supernatanten og mærk den som PNS (Post-Nuclear Supernatant).
3. Forberedelse af tæthedsgradientkolonne
- Overfør 1,2 mL PNS til et ultracentrifugrør.
- Prøven tilsættes 1 mL 62 % saccharoseopløsning (2,351 M saccharose, 3 mM imidazole ved pH 7.4) og blandes godt ved skånsom pipettering.
BEMÆRK: Den resulterende opløsning er en 40,6% saccharoseopløsning. - Der tilsættes 3,3 mL 35 % saccharoseopløsning (1,177 M saccharose, 3 mM imidazole ved pH 7,4) forsigtigt oven på prøven.
- Tilsæt 2,2 mL 25% saccharoseopløsning (0,806 M saccharose, 3 mM imidazole ved pH 7,4) forsigtigt oven på 35% saccharoseopløsningen.
BEMÆRK: Brydningsindekset på 62%, 40,6%, 35% og 25% saccharoseopløsninger ved stuetemperatur er henholdsvis 1,44, 1,40, 1,39 og 1,37. Brydningsindekserne for saccharoseopløsningerne kunne kontrolleres med et refraktometer for at sikre eksperimentets præcision og konsistens. - Fyld ultracentrifugeringsrøret med HB.
BEMÆRK: Opbevar midlertidigt den forberedte densitetsgradientkolonne ved 4 °C.
4. Fraktionering og nyttiggørelse af genanvendelses-endosome-holdige fraktion
- Centrifugere kolonnen ved 210.000 x g i 3 timer ved 4 °C.
- Saml 12 brøker (1 mL hver) omhyggeligt, startende fra toppen af gradienten.
BEMÆRK: Genbrugsendosomerne skal findes på grænsefladen mellem 35% og 25% saccharoseopløsninger. De indsamlede fraktioner kan snap-fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C. - Fortynd alle fraktioner med 1 mL fortyndingsbuffer (3 mM imidazole ved pH 7,4, 1 mM EDTA).
- Centrifuge den fortyndede prøve ved 100.000 x g i 1 time ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten og tilsæt 50 μL 1x prøvebuffer for at høste fraktionerne.
- Analyser proteinindholdet i fraktioner ved vestlig blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter at have fraktioneret de uoversendte HEK293-celler ved densitetsgradient ultracentrifugering blev der indsamlet 12 fraktioner startende fra toppen af gradienten. De høstede fraktioner blev fortyndet med fortyndingsbufferen i et 1:1-forhold og udsat for en anden centrifugeringsrunde. Prøverne blev derefter udsat for vestlige blotting for at analysere deres proteinindhold. Som vist i figur 1registreres genbrugsmarkøren Rab11 i fraktion 720. Andre subcellulære markører, herunder β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 og Lamp1, blev også undersøgt. Der registreres også et positivt EØS1-signal i fraktion 7. Båndintensiteterne GAPDH, COX IV og Rab11 i både fraktion 7 og PNS blev målt med ImageLab-software (Bio-Rad). Intensitetsforholdet for markører i brøk 7 til PNS blev beregnet og udtrykt i et søjlediagram ± SD.
De tidligere undersøgelser tyder på , at ARF6 og ELMO1 interagerer med FE65 for at fremme Rac1-medieret neurit udvækst21,22. Da ARF6 er en regulator for endoytisk genanvendelse, og ELMO1 plasmamembranmålretning er afgørende for den efterfølgende Rac1-aktivering, er det en hypotese, at FE65 forbinder ARF6 og ELMO1 for at mægle i handelen med ELMO1 til plasmamembranen. Derfor blev denne metode anvendt til at undersøge ELMO1-niveauet i de isolerede genanvendelsesendoomer. HEK293 celler blev transfected med enten ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, eller ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. Der blev ikke fundet ændringer i ELMO1-distributionen med ARF6 Q67L og FE65 overekspression (figur 2A). Dernæst blev ELMO1-niveauet i fraktion 7 (Rab11-positivt) sammenlignet mellem forskellige transinfektioner. Mængden af ELMO1 i fraktionen viser sig at hæve efter co-transfection af ARF6 Q67L. Yderligere stigning i ELMO1-niveauet observeres, når både ARF6 Q67L og FE65 er co-udtrykt (Figur 2B). Omvendt mindskede knockout af FE65 den ARF6-medierede ELMO1-berigelse i brøkdel 7 (figur 2C).
Figur 1: Genbrug endosomes findes i fraktion 7 efter densitet gradient ultracentrifugering. Uoversatte HEK293-celler blev fraktioneret, og proteinindholdet i de opnåede fraktioner blev analyseret med vestlig blotting. Rab11 påvises i fraktion 7 med et anti-Rab11 antistof (1:500). Andre subcellulære markører blev påvist med deres specifikke antistoffer, herunder β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10.000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500) og Lamp1 (1:1000). Brøk 1 er den mindre tætte topfraktion, mens brøk 12 er den tættere bundfraktion. Søjlediagrammet viser forholdet mellem GAPDH, COX IV og Rab11 i brøkdel 7 til PNS ± SD. Dette tal er blevet ændret fra Chan, W. W. R. et al.22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ekspression af FE65 fremmer ARF6-medieret endokritisk genanvendelse af ELMO1. (A) Cellerne transfected med enten ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L eller ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 blev fraktioneret ved hjælp af tæthedsgradient ultracentrifugering. Alle fraktioner blev udsat for vestlige blotting for at analysere distributionerne af ELMO1, ARF6 Q67L og FE65. Brøk 1 er den mindre tætte topfraktion, mens brøk 12 er den tættere bundfraktion. (B) Rab11-positiv fraktion 7 fra forskellige transinfektioner blev analyseret med vestlige blotting at evaluere niveauet af ELMO1 og ARF6 Q67L. Mængden af ELMO1 i fraktion 7 blev forhøjet, da cellerne var co-transfecting med ARF6 Q67L. Co-udtryk af ARF6 Q67L og FE65 øger yderligere mængden af ELMO1 i fraktionen. (C) Wildtype HEK293 blev overført med ELMO1 eller ELMO1 + ARF6 Q67L, mens FE65 KO HEK293 blev overført med ELMO1 + ARF6 Q67L. Den ARF6-medierede ELMO1-berigelse i fraktion 7 faldt betydeligt i FE65 KO-celler. (B-C) Genbrug endosome markør Rab11 (1:500) og cytosol markør GAPDH (1:10.000) blev undersøgt. ELMO1, FE65 og ARF6 Q67L blev opdaget med henholdsvis anti-ELMO1 B-7 (1:1000), anti-FE65 E-20 (1:1000) og anti-myc 9B11 (1:5000). Elmo1's relative niveau i fraktion 7 blev udtrykt som det densitometriske forhold mellem ELMO1 i brøkdel 7/total ELMO1. Data for søjlediagrammet blev indhentet fra tre uafhængige eksperimenter. Envejs ANOVA med Bonferroni post hoc-test blev anvendt til statistisk analyse. *p < 0,001. Resultaterne er gennemsnitlige fold ændring ± SD22. Dette tal er blevet ændret fra Chan, W. W. R. et al.22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovenstående protokol skitserer procedurerne for isolering af genanvendelsesenomer fra dyrkede celler ved ultracentrifugering. Pålideligheden af denne metode er blevet påvist ved den seneste publikation22, der beviser, at genanvendelse endosomes er med succes isoleret fra andre organeller (figur 1), såsom Golgi apparatet og mitokondrier. Nogle kritiske skridt skal være opmærksomme på for at opnå et godt adskillelsesresultat. Under tilberedningen af saccharoseopløsningerne anbefales det at validere brydningsindekserne for løsningerne med et refraktometer. Brydningsindekset på 62%, 35% og 25% saccharoseopløsninger ved stuetemperatur er henholdsvis 1,44, 1,39 og 1,37. Luftbobler bør også undgås fra gradienten. Tilstedeværelsen af bobler i kolonnen kan forstyrre kontinuiteten i gradienten. Vaskemidler bør undgås i homogeniseringsprocessen, da de beskadiger membranen af organeller. Dette fører til frigivelse af proteiner fra membranbundne organeller og kan resultere i alvorlig forurening. Alle homogeniseringsværktøjer skal også forkøles før brug for at undgå proteinforringelse under homogenisering. Når gradienten er forberedt, skal den anvendes så hurtigt som muligt. Selv om den forberedte gradient midlertidigt kan lagres ved 4 °C (1-2 h), kan langvarig opbevaring forstyrre tæthedens gradient på grund af diffusion.
Saccharose er et meget udbredt gradientmedium på grund af dets nemme tilgængelighed. Faktisk er der mange andre alternativer, herunder Percoll og Ficoll-40023,24. Disse medier har forskellige fysiske egenskaber sammenlignet med saccharose. For eksempel har Percoll lavere osmolaritet og viskositet end saccharose. Disse tillader hurtig banding af partikler ved hjælp af lavere centrifugalkræfter. Ficoll-400 har en lavere gennemtrængelighed mod membraner end saccharose på grund af sin høje molekylvægt og lave indhold af dialyzable materiale. Derfor kan ændring af gradientmediet opnå en højere endosome isolationseffektivitet.
Bortset fra densitetsgradient ultracentrifugering kan andre metoder anvendes til cellefraktionering, herunder frit flowelektroforese (FFE)25, fluorescensaktiveret organellesortering (FAOS)26og immunisolation27. FFE er en flydende fase separation metode. Prøven strømmer gennem adskillelsesbufferen under påvirkning af et elektrisk felt vinkelret på strømningsretningen. Afbøjningsniveauer for forskellige organeller varierer afhængigt af deres overfladeafgifter25. FAOS anvender normalt et fluorescerende mærke eller antistof til at mærke specifikke organelle og derefter efterfulgt af flowcytometri tilisolationen 28,29. Immunisolation er afhængig af at detektere specifikke antigener på overfladen af den målrettede organelle og efterfølgende nedbør ved antistoffer30.
Når man sammenligner med disse alternativer, har tæthedsgradient ultracentrifugering sine egne fordele. Først og fremmest kan en distributionsprofil af det interesserede protein opnås ved at udføre vestlig blotting med de isolerede fraktioner (Figur 2A). Eventuelle ændringer i protein subcellulær lokalisering kunne let påvises. Også ultracentrifuge er et standardinstrument i de fleste institutter, og det tekniske krav til drift af centrifugen er lavt. I modsætning hertil kræves et flowcytometer og et specifikt elektroforesesystem til henholdsvis isoleringsprocessen for FAOS og FFE. Der kræves ikke specifikt udstyr til immunisolation. Det bruges dog hovedsageligt til at isolere endosomes fra et lille antal celler. Forberedelsesskalaen af ultracentrifugering er større end immunisolation. Desuden er et antistof med høj specificitet nødvendigt for immunisolation31. Desuden kan der ikke anvendes buffer med vaskemiddel og højt saltindhold i vasketrinene for at sikre endosomernes integritet. Dette kan føre til høj baggrund og reducere renheden af den isolerede organelle31.
Da densitetsgradient ultracentrifugering adskiller organeller baseret på densitet, er dens mest signifikante begrænsning at løse magt mod organeller med lignende tæthed. Som vist i figur 1registreres både Rab11 og EEA1 i fraktion 7 på grund af de tilsvarende fysiske egenskaber ved genanvendelse og tidlige endoomer. Yderligere analyser er nødvendige for at bekræfte ændringerne i niveauet af det målrettede protein i genanvendelsesendosomet. I den tidligere undersøgelse blev co-immunstaining på ELMO1 og Rab11 udført i cellerne22. Ud over at udføre andre analyser, kan nogle foranstaltninger vedtages for at løse dette problem. En kontinuerlig densitetsgradient kan løse organeller med mindre densitetsforskelle32. Udbyttet i en kontinuerlig gradient er imidlertid betydeligt lavere end for en diskontinuerlig gradient. Det er muligt at manipulere endosomets massefylde ved at forbehandle cellerne med latexperler33. Perlerne internaliseres af cellerne via endokytose. Tætheden af de perler, der indeholder endosomes, reduceres betydeligt og kan adskilles fra andre organeller. Normalt kan tilføjelse af et andet isolationsniveau forbedre isoleringen af organeller med lignende tætheder betydeligt. Udfør for eksempel immunisolation fra den isolerede fraktion34. Ved at bruge et bestemt antistof kan genanvendelsesendosom adskilles fra forurenende stofferne. Fluorescerende-mærkede antistoffer og sonder, kombineret med flowcytometrianalyse, kan også anvendes til præcis endosome isolation28. FFE gælder også for adskillelse af organeller med lignende tætheder baseret på deres overfladeladning25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter med indholdet af denne artikel.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Research Grants Council Hong Kong, CUHK direkte tilskudsordning, United College begavelse fond, og TUYF Charitable Trust. Tallene i dette arbejde er tilpasset fra vores tidligere publikation, "ARF6-Rac1 signalmedieret neurit udvækst er potentiated af neuronal adapter FE65 gennem orkestrering ARF6 og ELMO1" offentliggjort i FASEB Journal i oktober 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).
