Summary
이 논문은 자당 밀도 그라데이션 초원심 분리를 사용하여 포유류 세포에서 종양을 재활용하는 것을 준비하기위한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로합니다.
Abstract
내적 인신 매매는 광범위한 생물학적 사건을 규제하는 필수적인 세포 과정입니다. 단백질은 플라즈마 막에서 내면화된 다음 초기 내분으로 운반됩니다. 내부화된 단백질은 분해를 위해 리소솜으로 이동하거나 플라즈마 멤브레인으로 다시 재활용될 수 있습니다. 강력한 내세포 재활용 경로는 내분비증에서 멤브레인 물질의 제거의 균형을 위해 필요합니다. 다양한 단백질은 ADP-리보실화 인자 6(ARF6)을 포함하는 통로를 조절하는 것으로 보고된다. 밀도 그라데이션 초원심분리는 세포 분획을 위한 고전적인 방법입니다. 원심분리 후, 세포기관은 이소피닉 표면에 퇴적됩니다. 분수는 다른 다운스트림 응용 프로그램에 수집되고 사용됩니다. 여기에 기재된 프로토콜은 밀도 그라데이션 초원심분리를 사용하여 전감염된 포유류 세포로부터 내분 함유 분획을 재활용하는 프로토콜이다. 격리된 분획은 단백질 함량을 분석하기 위한 표준 서양 블로팅을 실시하였다. 이 방법을 채택함으로써, 우리는 ras 관련 C3 보툴리눔 독소 기판 1 (Rac1) 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자인 삼장 막표적이 ARF6 매개 내분비성 재활용을 통해 확인하였다.
Introduction
내피 인신 매매는 다양한 생물학적 사건1,예를 들어 신호 수용체, 이온 채널 및 접착 분자의 운송을 연루시키는 필수적인 생리학적 과정입니다. 플라즈마 멤브레인에서 국소화된 단백질은 내분비2에 의해 내면화된다. 내부화된 단백질은 초기 내분3에의해 정렬됩니다. 단백질 중 일부는 분해4용리소좀을 대상으로 한다. 그러나, 단백질의 상당수는 빠른 재활용 및 느린 재활용 프로세스에 의해 세포 표면으로 다시 재활용됩니다. 빠른 재활용에서 단백질은 초기 내분모를 떠나 플라즈마 막으로 직접 돌아갑니다. 반대로, 느린 재활용에서 단백질은 먼저 내막 재활용 구획으로 분류된 다음 다시 플라즈마 멤브레인으로 운반됩니다. 다양한 화물 단백질은 예를 들어, 클래트린, 레트로머 복합체, 리트리버 복합체 및 Wiskott-Aldrich 증후군 단백질 및 SCAR 호모글로그(WASH) 복합체, 이러한 멤브레인 재활용공정4,5,6,7,8,9에참여한다. 내분비및 재활용 이벤트의 균형은 세포 생존에 매우 중요하며, 예를 들어 세포 접착, 세포 이동, 세포 극성 및 신호 변환과 같은 다양한 세포이벤트(10)에기여합니다.
ARF6, 작은 GTPase, 내피 인신 매매의 보고 된 레귤레이터7,11,12. 관심있는, 다양한 연구 그룹은 내용 재활용13,14,15,16,17에서ARF6의중요성을설명했다. 이 연구는 ARF6 매개 중성염 아웃성장과 내세포 재활용 사이의 관계를 조사하는 것을 목표로합니다. 이전 보고서는 ARF6의 활성화가 사이토카네시스 1 (DOCK180) 복합18의ELMO1-헌납기에 작용하여 Rac1 활동에 상류되는 것을 시사한다. 그러나 ARF6가 ELMO1-DOCK180 중재 된 Rac1 신호를 어떻게 유발하는지는 불분명합니다. 밀도 그라데이션 초원심분리는 이러한 과정에서 ARF6 매개 내막 재활용의 역할을 조사하기 위해 사용되었다. 이를 이용하여, 재활용 내성 함유 분획은세포용액(19)으로부터수득하였다. 분획은 단백질 함량 분석을 위한 서양 블로팅을 실시하였다. 면역블롯 결과는 FE65, 뇌가 풍부한 어댑터 단백질의 존재 하에서 활성 ARF6가 실질적으로 내모성 함유 분획을 재활용하는 ELMO1의 수준을 증가시켰다는 것을 밝혔습니다. 다음 프로토콜은 포유류 세포를 (1) 횡단하는 절차에 대한 절차를 포함한다; (2) 샘플 및 밀도 그라데이션 컬럼을 준비; 및 (3) 재활용 내분 함유 분획을 획득한다.
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Protocol
1. 포유류 세포 배양 및 형질
- 100mm 배양 접시에 2 x 106 셀을 접시. 각 트랜스페션에 4가지 요리를 사용하십시오.
참고: 필요한 세포 수는 셀주에 따라 다를 수 있습니다. 격리 단계로 진행하기 전에 최적화가 필요할 수 있습니다. - 다음 날, 제조 업체의 지침에 따라 리포펙 타민으로 세포를 변형.
2. 세포 수확
- 배양 배지 48h 후 형질 전환을 폐기하십시오.
- 얼음처럼 차가운 PBS(10mM 나트륨 인산염, 염화 2.68m, 염화 나트륨 140m)로 세포를 두 번 세척합니다.
- 각 접시에 1mL의 얼음 차가운 PBS+ (0.5 배 프로테아제 억제제 칵테일과 0.5 배 인산 억제제 칵테일로 보충된 PBS)를 추가하십시오.
- 세포 스크레이퍼로 세포를 수집하고 세포 현탁액을 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.
- 5 분 동안 400 x g에서 스윙 버킷 로터를 사용하여 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
- 상체를 버리고 5mL의 균질화 완충제(HB; 250m 자당, pH 7.4에서 3mM 이미다졸, 1mM EDTA0.03m 사이클로헥시미드, 1x 프로테아제 억제제 칵테일, 1x 포세파테스 억제제)로 부드럽게 세포 펠릿을 회수한다.
- 10 분 동안 1,300 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.
- HB의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 15-20 스트로크용 두스 균질화로 세포를 균질화합니다.
참고: 다른 균질화 방법, 예를 들어, 주사기를 통해 샘플을 전달, 사용될 수있다. 균질화 효율은 위상 대비 현미경하에서 균주전을 관찰함으로써 드러나게 될 수 있다. - 2mL 원심분리 튜브로 균동화를 전달합니다.
참고: 5배 샘플 버퍼의 12.5 μL을 사용하여 50 μL의 동종을 수확하고 총 lysate로 레이블을 지정합니다. - 동종모네이트에 0.7mL의 HB를 추가합니다.
- 4°C에서 10분 동안 희석된 균질을 2,000 x g에서 10분 동안 회전합니다.
참고: 펠릿에는 핵과 깨지지 않은 세포가 포함되어 있습니다. - 상체 1.5mL을 수집하고 한 번 2.12 단계를 반복하십시오.
- 상체 1.4mL을 수집하고 핵 후 수퍼나티(PNS)로 레이블을 지정합니다.
3. 밀도 그라데이션 열 준비
- PNS1.2mL을 초원심분리기 튜브로 옮기다.
- 62% 자당 용액(2.351M 자당, pH 7.4m imidazole 3m)의 1mL을 샘플에 넣고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞는다.
참고: 결과 솔루션은 40.6% 자당 솔루션입니다. - 3.3mL의 자당 용액(1.177M 자당, pH 7.4m imidazole 3m)을 시료 위에 조심스럽게 넣습니다.
- 2.2mL의 25% 자당 용액(0.806M 자당, pH 7.4m imidazole 3m)을 35% 자당 용액 위에 조심스럽게 넣습니다.
참고: 실온에서 62%, 40.6%, 35%, 25%의 굴절률은 각각 1.44, 1.40, 1.39, 1.37입니다. 자당 솔루션의 굴절 인덱스는 실험의 정밀도와 일관성을 보장하기 위해 회부계로 확인할 수 있습니다. - HB로 초원심분리튜브를 채웁니다.
참고: 준비된 밀도 그라데이션 컬럼을 4°C에 임시로 저장합니다.
4. 재활용 내분 함유 분획의 분획 및 회수
- 4°C에서 3h에 대해 210,000 x g의 컬럼을 원심분리합니다.
- 그라데이션 의 상단에서 시작하여 12분획(각 1mL)을 신중하게 수집합니다.
참고: 재활용 내분은 35%에서 25% 자당 솔루션 사이의 인터페이스에서 찾아야 합니다. 수집된 분획은 액체 질소에서 스냅 동결및 -80°C에 저장될 수 있다. - 희석 버퍼 1mL(pH 7.4, 1mM EDTA에서 3mM imidazole)로 모든 분획을 희석하십시오.
- 4°C에서 1h에 대해 100,000 x g의 희석된 시료원심분리기.
- 수퍼네티를 흡인하고 1x 샘플 버퍼의 50 μL을 추가하여 분수를 수확합니다.
- 서양 블로팅에 의해 분획의 단백질 함량을 분석합니다.
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Representative Results
밀도 그라데이션 극심분리에 의해 비감염된 HEK293 세포를 분수한 후, 그라데이션의 상단에서 시작하여 12개의 분획이 수집되었다. 수확된 분획은 희석 버퍼로 희석하여 1:1 비율로 희석하고 두 번째 원심분리를 실시하였다. 견본은 그 때 그들의 단백질 내용물 분석을 위한 서쪽 얼룩을 복종했습니다. 도 1에도시된 바와 같이, 재활용 내성 마커 Rab11은 분수 720에서검출된다. β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 및 Lamp1을 포함한 다른 세포 전세포 마커도 조사되었습니다. 양수 EEA1 신호도 분수 7에서도 검출됩니다. GAPDH, COX IV 및 Rab11의 밴드 강도는 분수 7과 PNS 모두에서 ImageLab 소프트웨어(Bio-Rad)로 측정되었습니다. 7에서 PNS로 마커의 강도 비율이 계산되고 SD± 바 차트로 표현되었다.
이전 연구는 ARF6및 ELMO1이 RAC1 매개 뉴라이트 아웃성장을 촉진하기 위해 FE65와 상호 작용한다는 것을건의한다21,22. ARF6는 내생물 재활용의 조절제이며 ELMO1 플라즈마 멤브레인 표적화는 후속 Rac1 활성화에 매우 중요하며, FE65는 ARF6 및 ELMO1을 연결하여 ELMO1의 인신 매매를 플라즈마 멤브레인에 중재한다는 가설이 있습니다. 따라서, 이 방법은 격리된 재활용 내성에서 ELMO1 수준을 조사하기 위해 사용되었다. HEK293 세포는 ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L 또는 ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65로 전감염되었다. ARF6 Q67L 및 FE65 과발현(그림2A)을통해 ELMO1 분포에서 변경 사항이 발견되지 않았습니다. 다음으로, 분수 7(Rab11-positive)의 ELMO1 수준은 다른 형질사이비교하였다. 분획에서 ELMO1의 양은 ARF6 Q67L의 공동 배분 후 상승하는 것으로 나타났다. ELMO1 레벨의 추가 증가는 ARF6 Q67L 및 FE65가 모두 공동 표현될 때 관찰됩니다(도2B). 반대로, FE65의 녹아웃은 분수7(도 2C)에서ARF6 중재 ELMO1 농축을 감소시켰다.
그림 1: 재활용 내분은 밀도 그라데이션 초원심분리 후 분수 7에서 발견된다. 비감염된 HEK293 세포는 분획되었고 얻어진 분획에서 단백질 함량을 서양 블로팅으로 분석하였다. Rab11은 항라브11 항체(1:500)를 가진 분수 7에서 검출된다. 그밖 세포세포 마커는 β COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10,000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500), 및 Lamp1 (1:1000)를 포함하여 그들의 특정 항체로 검출되었습니다. 분수 1은 밀도가 적은 상단 분획이며 분수(12)는 밀도가 높은 바닥 분획입니다. 막대 차트는 GapDH, COX IV 및 Rab11의 비율을 7대 PNS ± SD의 비율을 보여줍니다. 이 수치는 찬, W. W. R. 외22에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: FE65의 발현은 ELMO1의 ARF6 매개 내막 재활용을 촉진합니다. (A)ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, 또는 ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65가 밀도 그라데이션 초원심분리를 사용하여 분획하였다. 모든 분획은 ELMO1, ARF6 Q67L 및 FE65의 분포를 분석하기 위한 서부 블로팅을 실시하였다. 분수 1은 밀도가 적은 상단 분획이며 분수(12)는 밀도가 높은 바닥 분획입니다. (B)상이한 형질에서 Rab11 양성 분수 7은 ELMO1 및 ARF6 Q67L의 수준을 평가하기 위해 서양 블로팅으로 분석되었다. 분획 7에서 ELMO1의 양은 세포가 ARF6 Q67L과 공존할 때 상승하였다. ARF6 Q67L 및 FE65의 공동 발현은 분획에서 ELMO1의 양을 더욱 증가시킵니다. (C)와일드타입 HEK293은 ELMO1 또는 ELMO1 + ARF6 Q67L로 전감염된 반면 FE65 KO HEK293은 ELMO1 + ARF6 Q67L로 전감염되었다. FE65 KO 세포에서 7분수의 ARF6 매개 ELMO1 농축액이 현저히 감소하였다. (B-C) 재활용 내성 마커 Rab11 (1:500) 및 사이토솔 마커 GAPDH (1:10,000)가 조사되었다. ELMO1, FE65 및 ARF6 Q67L은 각각 항 ELMO1 B-7(1:1000), 항 FE65 E-20(1:1000), 항myc 9B11(1:5000)으로 검출되었다. 분수 7에서 ELMO1의 상대적 수준은 분수 7/총 ELMO1에서 ELMO1의 밀도 비율로 표현되었다. 막대 차트에 대한 데이터는 세 가지 독립적 인 실험에서 얻어졌다. 본페로니 포스트 호크 테스트를 사용한 단방향 ANOVA는 통계 분석을 위해 사용되었습니다. *p < 0.001. 결과는 SD22±접기 변경을 의미합니다. 이 수치는 찬, W. W. R. 외22에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위의 프로토콜은 초원심분리에 의한 배양된 세포로부터의 재활용 내모를 분리하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 방법의 신뢰성은 최신간행물(22)에의해 입증되었으며, 재활용 내성들이 골기 장치 및 미토콘드리아와 같은 다른 세포기관으로부터 성공적으로 분리되었음을 입증하였다(그림1). 좋은 분리 결과를 얻기 위해 몇 가지 중요한 단계는주의를 기울여야합니다. 자당 솔루션을 준비하는 동안, 리프라도미터를 사용하여 솔루션의 굴절률을 검증하는 것이 좋습니다. 실온에서 62%, 35%, 자당 25%의 굴절률은 각각 1.44, 1.39, 1.37입니다. 또한, 기포는 그라데이션에서 피해야한다. 열에 거품이 있으면 그라데이션의 연속성을 방해할 수 있습니다. 그들은 세포기관의 막을 손상하기 때문에 세제는 균질화 과정에서 피해야한다. 이것은 막 단단 세포기관에서 단백질의 방출로 이끌어 내고 가혹한 오염귀착될 수 있었습니다. 또한, 모든 균질화 도구는 균질화 중 단백질 분해를 피하기 위해 사용하기 전에 미리 냉각되어야합니다. 그라데이션이 준비되면 가능한 한 빨리 사용해야 합니다. 준비된 그라데이션은 일시적으로 4°C(1-2h)에 저장될 수 있지만, 장기간 저장은 확산으로 인한 밀도 그라데이션을 방해할 수 있다.
Sucrose는 가용성이 용이하기 때문에 널리 사용되는 그라데이션 매체입니다. 사실, 페르콜과 피콜-40023,24를포함한 다른 많은 대안이 있습니다. 이러한 미디어는 자당과 비교할 때 다른 물리적 특성을 가지고 있습니다. 예를 들어, Percoll은 자당보다 진동성과 점도가 낮습니다. 이를 통해 낮은 원심력을 사용하여 입자를 빠르게 밴딩할 수 있습니다. Ficoll-400은 분자량이 높고 투석 가능한 물질의 함량이 낮기 때문에 자당보다 멤브레인에 대한 투과성이 낮습니다. 따라서 그라데이션 배지를 변경하면 내인성 절연 효율이 높아질 수 있다.
밀도 그라데이션 초원심분리이외에, 자유유량 전기포전(FFE)25,형광 활성화 소넬 선별(FAOS)26,및 면역격리(27)를 포함한세포 분획에 다른 방법을 사용할 수 있다. FFE는 액체 상 분리 방법입니다. 샘플은 유동 방향에 수직인 전기장의 영향으로 분리 버퍼를 통해 흐른다. 다른 소기관의 편향 수준은 표면충전(25)에따라 다릅니다. FAOS는 일반적으로 형광 태그 또는 항체를 사용하여 특정 세포기관에 라벨을 붙인 다음 격리28,29에대한 유동 세포측정을 한다. 면역 격리는 표적 세포기관의 표면상에 특정 항원 검출에 의존하고 있으며, 이후의 강수량은항체(30)에의한 것입니다.
이러한 대안과 비교할 때 밀도 그라데이션 초원심분리는 고유한 장점이 있습니다. 우선, 관심 있는 단백질의 분포 프로파일은 고립된 분획(도2A)으로서양 블로팅을 수행함으로써 얻을 수 있다. 단백질 세포 세포 소세포화의 모든 변화는 쉽게 검출 될 수있다. 또한 초원심분리기는 대부분의 기관에서 표준 계측기이며 원심분리기 작동을 위한 기술적 요구 사항은 낮습니다. 대조적으로, FAOS 및 FFE의 격리 공정에 각각 유동 세포계 및 특정 전기포전계 시스템이 필요합니다. 면역 격리에 필요한 특정 장비는 없습니다. 그러나, 그것은 주로 세포의 작은 수에서 내구를 격리에 사용. 초원심분리의 제제 척도는 면역분리보다 크다. 게다가, 면역격리(31)에대해 특이성이 높은 항체가 필요하다. 또한, 세제 및 높은 염분 함유 버퍼는 내종의 무결성을 보장하기 위해 세척 단계에서 사용할 수 없습니다. 이는 높은 배경으로 유도하고 격리된세포기관(31)의순도를 감소시킬 수 있다.
밀도 그라데이션 초원심분리는 밀도에 기초한 세포기관을 분리하기 때문에 밀도가 비슷한 세포기관을 향한 전력을 해결하는 것이 가장 중요한 한계입니다. 도 1에도시된 바와 같이, Rab11과 EEA1은 재활용과 초기 내종의 유사한 물리적 특성으로 인해 분수 7에서 검출됩니다. 추가 적인 소하는 재활용 내의 표적 단백질의 수준에 있는 변경을 확인하기 위하여 필요합니다. 이전 연구에서는, ELMO1 및 Rab11에 대한 공동 면역 스테인닝이세포(22)에서수행되었다. 다른 어설커를 수행하는 것 외에도 이 문제를 극복하기 위한 몇 가지 조치를 채택할 수 있습니다. 연속 밀도 그라데이션은 밀도차이(32)로소기관을 해결할 수 있습니다. 그러나 연속 그라데이션의 수율은 불연속 그라데이션보다 현저히 낮습니다. 라텍스구슬(33)으로세포를 사전 치료함으로써 내종의 밀도를 조작할 수 있다. 구슬은 내분비증을 통해 세포에 의해 내면화된다. 내형을 포함하는 구슬의 밀도는 현저하게 감소되고 그밖 세포기관에서 분리될 수 있습니다. 일반적으로 다른 수준의 격리를 추가하면 유사한 밀도를 가진 세포기관의 격리가 크게 향상될 수 있습니다. 예를 들어, 격리된분획(34)으로부터면역분리를 수행한다. 특정 항체를 사용함으로써, 내모를 재활용하는 것은 오염 물질로부터 분리될 수 있다. 유동 세포분석과 결합된 형광표지 항체 및 프로브는 정확한 내피절연(28)에도사용될 수 있다. FFE는 또한 표면충전(25)에따라 유사한 밀도를 가진 세포기관을 분리하는 데 적용됩니다.
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Disclosures
저자는 이 문서의 내용과 이해상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 연구 보조금 위원회 홍콩, CUHK 직접 보조금 제도, 유나이티드 대학 인다우먼트 기금 및 TUYF 자선 신탁의 기금으로 지원되었습니다. 이 작품의 수치는 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 "ARF6-Rac1 시그널링 매개 중계 중성염 아웃성장이 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 ARF6 6 및 ELMO1을 통해 뉴런 어댑터 FE65에 의해 전능적이다"라는 이전 간행물에서 채택되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
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