Summary
Detta dokument syftar till att presentera ett protokoll för att förbereda återvinning endosomer från däggdjursceller med hjälp av sackarosdensitet gradient ultracentrifugation.
Abstract
Endosomal trafficking är en viktig cellulär process som reglerar ett brett spektrum av biologiska händelser. Proteiner internaliseras från plasmamembranet och transporteras sedan till de tidiga endosomerna. De internaliserade proteinerna kan överföras till lysosomen för nedbrytning eller återvinnas tillbaka till plasmamembranet. En robust endocytisk återvinningsväg krävs för att balansera avlägsnandet av membranmaterial från endocytos. Olika proteiner rapporteras reglera vägen, inklusive ADP-ribosyleringsfaktor 6 (ARF6). Densitetsgradient ultracentrifugation är en klassisk metod för cellfraktionering. Efter centrifugeringen sedimenteras organeller vid deras isopyniska yta. Bråktalen samlas in och används för andra nedströmstillämpningar. Beskrivs här är ett protokoll för att erhålla en återvinning endosome-innehållande fraktion från transfected däggdjursceller med densitet gradient ultracentrifugation. De isolerade fraktionerna utsattes för standard västerländsk blotting för att analysera deras proteininnehåll. Genom att använda denna metod identifierade vi att plasmamembranet inriktning på uppslukande och cellmotilitet 1 (ELMO1), en Ras-relaterade C3 botulinumtoxin substrat 1 (Rac1) guanin nukleotid utbyte faktor, är genom ARF6-medierad endocytic återvinning.
Introduction
Endosomal trafficking är en viktig fysiologisk process som involverar olika biologiska händelser1, till exempel transport av signalreceptorer, jonkanaler och vidhäftningsmolekyler. Proteiner lokaliserade vid plasmamembranet internaliseras av endocytos2. De internaliserade proteinerna sorteras sedan efter den tidiga endosom3. Några av proteinerna är inriktade på lysosomer för nedbrytning4. En betydande mängd proteiner återvinns dock tillbaka till cellytan genom snabb återvinning och långsamma återvinningsprocesser. Vid snabb återvinning lämnar proteiner de tidiga endosomerna och återvänder direkt till plasmamembranet. Omvänt, i långsam återvinning, sorteras proteiner först till det endocytiska återvinningsutrymmet och transporteras sedan tillbaka till plasmamembranet. Olika lastproteiner, till exempel clathrin, retromerkomplex, retrieverkomplex och Wiskott-Aldrich syndromprotein och SCAR Homologue (WASH) komplex, deltar i sådana membranåtervinningsprocesser4,5,6,7,8,9. Balansen mellan endocytos och återvinningshändelse är avgörande för cellens överlevnad och bidrar till olika cellulära händelser10, till exempel cell vidhäftning, cellmigration, cellpolaritet och signaltransduktion.
ARF6, en liten GTPase, är en rapporterad regulator av endocytisk handel7,11,12. Av intresse har olika forskargrupper illustrerat vikten av ARF6 i endocytisk återvinning13,14,15,16,17. Studien syftar till att undersöka sambandet mellan ARF6-medierad neuritutväxt och endocytisk återvinning. Den tidigare rapporten tyder på att aktiveringen av ARF6 är uppströms till Rac1-aktivitet genom att agera på ELMO1-dedicator av cytokines 1 (DOCK180) komplex18. Hur ARF6 utlöser ELMO1-DOCK180 medierad Rac1-signalering är dock fortfarande oklart. Densitet gradient ultracentrifugation användes för att undersöka rollen av ARF6-medierad endocytic återvinning i en sådan process. Genom att använda det erhölls den återvinningsinnehållande fraktionen från cell lysates19. Fraktionen utsattes för western blotting för proteininnehållsanalys. Immunoblot resultaten visade att under förekomsten av FE65, en hjärnan-berikad adapter protein, aktiva ARF6 avsevärt ökade nivån av ELMO1 i återvinning endosome-innehållande fraktion. Följande protokoll omfattar förfaranden för 1) transfekterande däggdjursceller. 2. Förbereda proverna och densitetsgradientkolumnerna. och (3) erhållande av den återvinningshaltiga fraktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Däggdjurscellkultur och transfektion
- Platta 2 x 106 celler i en 100 mm odlingsskål. Använd fyra rätter för varje transfekt.
OBS: Antalet celler som krävs kan variera för olika cellinjer. Optimering kan vara nödvändig innan du går vidare till isoleringssteget. - Nästa dag transfekterar du cellerna med Lipofectamine enligt tillverkarens instruktioner.
2. Cellskörd
- Kassera odlingsmediet 48 h efter transfektion.
- Tvätta cellerna med iskall PBS (10 mM natriumfosfater, 2,68 mM kaliumklorid, 140 mM natriumklorid) två gånger.
- Tillsätt 1 ml iskall PBS+ (PBS kompletterad med 0, 5x proteashämmande cocktail och 0,5x fosfatashämmare cocktail) till varje maträtt.
- Samla cellerna med en cellskraga och överför cellupphängningen till ett 15 ml centrifugrör.
- Pellet cellerna genom centrifugering med en svängskopa rotor vid 400 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten och återanvänd cellpellet försiktigt i 5 ml homogeniseringsbuffert (HB; 250 mM sackaros, 3 mM imidazol vid pH 7,4, 1 mM EDTA kompletterat med 0, 03 mM cykloheximid, 1x proteashämmare cocktail och 1x fosfatashämmare cocktail).
- Samla cellerna genom centrifugering vid 1 300 x g i 10 minuter.
- Återsuspend cellpelleten i 1 ml HB.
- Homogenisera cellerna med en Dounce homogenisator för 15-20 slag.
OBS: Andra homogeniseringsmetoder, till exempel genom att skicka provet genom en spruta, kan användas. Homogenisering effektivitet kan avslöjas genom att observera homogenatet under en fas-kontrast mikroskop. - Överför homogenatet till ett 2 ml centrifugeringsrör.
OBS: Skörda 50 μL homogenat med 12,5 μL 5x provbuffert och märk det som total lysat. - Tillsätt 0,7 ml HB homogenatet.
- Snurra det utspädda homogenatet vid 2 000 x g i 10 min vid 4 °C.
OBS: Pelleten innehåller kärnor och obrutna celler. - Samla 1,5 ml supernatant och upprepa steg 2,12 en gång.
- Samla 1,4 ml supernatant och märka den som post-nukleär supernatant (PNS).
3. Förberedelse av densitetsgradientkolonn
- Överför 1,2 ml PNS till ett ultracentrifugerör.
- Tillsätt 1 ml 62 % sackaroslösning (2,351 M sackaros, 3 mM imidazol vid pH 7,4) till provet och blanda väl genom skonsam pipettering.
OBS: Den resulterande lösningen är en 40,6% sackaroslösning. - Tillsätt 3,3 ml 35 % sackaroslösning (1,177 M sackaros, 3 mM imidazol vid pH 7,4) försiktigt ovanpå provet.
- Tillsätt 2,2 ml 25 % sackaroslösning (0,806 M sackaros, 3 mM imidazol vid pH 7,4) försiktigt ovanpå sackaroslösningen på 35 %.
OBS: Brytningsindexet för 62%, 40,6%, 35% och 25% sackaroslösningar vid rumstemperatur är 1,44, 1,40, 1,39 respektive 1,37. Sackaroslösningarnas brytningsindex kan kontrolleras med en refraktometer för att säkerställa experimentets precision och konsekvens. - Fyll ultracentrifugeringsröret med HB.
OBS: Förvara tillfälligt den förberedda densitetsgradientkolonnen vid 4 °C.
4. Fraktionering och återvinning av återvinningsfrågeinnehållande fraktion
- Centrifugera kolonnen vid 210 000 x g i 3 timmar vid 4 °C.
- Samla 12 fraktioner (1 ml vardera) noggrant, med början från toppen av lutningen.
OBS: Återvinningsendosomerna bör hittas i gränssnittet mellan 35% och 25% sackaroslösningar. De insamlade fraktionerna kan snäppas i flytande kväve och lagras vid -80 °C. - Späd alla fraktioner med 1 ml utspädningsbuffert (3 mM imidazol vid pH 7,4, 1 mM EDTA).
- Centrifugera det utspädda provet vid 100 000 x g i 1 h vid 4 °C.
- Aspirera på supernatanten och tillsätt 50 μL 1x provbuffert för att skörda fraktionerna.
- Analysera proteininnehållet i fraktionerna genom western blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter fraktionering av de oöversatta HEK293 cellerna genom densitet gradient ultracentrifugation, samlades 12 fraktioner från toppen av gradienten. De skördade fraktionerna späddes ut med utspädningsbufferten i förhållandet 1:1 och utsattes för en andra centrifugeringsomgång. Proverna utsattes sedan för western blotting för att analysera deras proteininnehåll. Som visas i figur 1detekteras återvinningsmarkören Rab11 i fraktion 720. Andra subcellulära markörer, inklusive β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 och Lamp1, undersöktes också. En positiv EES1-signal detekteras också i bråkdel 7. Bandintensiteterna gapdh, COX IV och Rab11 i både fraktion 7 och PNS mättes med ImageLab programvara (Bio-Rad). Brytpunkternas intensitetsförhållanden i bråk 7 till PNS beräknades och uttrycktes i ett stapeldiagram ± SD.
De tidigare studierna tyder på att ARF6 och ELMO1 interagerar med FE65 för att främja Rac1-medierad neurit utväxt21,22. Eftersom ARF6 är en regulator för endocytisk återvinning och ELMO1 plasma membran inriktning är avgörande för den efterföljande Rac1 aktivering, är det en hypotes att FE65 ansluter ARF6 och ELMO1 för att medla handeln med ELMO1 till plasmamembranet. Därför användes denna metod för att undersöka ELMO1-nivån i de isolerade återvinningsendosomerna. HEK293 celler transfected med antingen ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L eller ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. Inga ändringar hittades i ELMO1-distributionen med ARF6 Q67L och FE65 överuttryck(figur 2A). Därefter jämfördes ELMO1-nivån i del 7 (Rab11-positiv) mellan olika transfekteringar. Mängden ELMO1 i fraktionen visar sig höjas efter samomvandningen av ARF6 Q67L. Ytterligare ökning av ELMO1-nivån observeras när både ARF6 Q67L och FE65 uttrycks tillsammans (figur 2B). Omvänt minskade knockouten av FE65 den ARF6-medierade ELMO1-anrikningen i bråkdel 7(figur 2C).
Figur 1: Återvinning endosomer finns i bråkdel 7 efter densitet gradient ultracentrifugation. OtransfectedDerade HEK293 celler var fraktionerade och protein innehållet i de erhållna fraktionerna analyserades med västra blotting. Rab11 detekteras i fraktion 7 med en anti-Rab11 antikropp (1:500). Andra subcellulära markörer upptäcktes med sina specifika antikroppar, inklusive β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10,000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500) och Lamp1 (1:1000). Bråkdel 1 är den mindre täta översta fraktionen, medan bråkdel 12 är den tätare bottenfraktionen. Stapeldiagrammet visar förhållandet mellan GAPDH, COX IV och Rab11 i bråkdel 7 till PNS ± SD. Denna siffra har ändrats från Chan, W. W. R. et al.22. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Fe65-uttryck främjar ARF6-medierad endocytisk återvinning av ELMO1. (A) Cellerna som transfekterades med antingen ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L eller ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 fraktionerades med hjälp av densitetsgradient ultracentrifugation. Alla fraktioner utsattes för western blotting för att analysera distributionerna av ELMO1, ARF6 Q67L och FE65. Bråkdel 1 är den mindre täta översta fraktionen, medan bråkdel 12 är den tätare bottenfraktionen. (B) Den Rab11-positiva fraktionen 7 från olika transfektioner analyserades med western blotting för att utvärdera nivåerna av ELMO1 och ARF6 Q67L. Mängden ELMO1 i del 7 var förhöjd när cellerna var samtransfekterande med ARF6 Q67L. Samuttryck av ARF6 Q67L och FE65 ökar ytterligare mängden ELMO1 i fraktionen. C) Wildtype HEK293 transfected med ELMO1 eller ELMO1 + ARF6 Q67L, medan FE65 KO HEK293 transfected med ELMO1 + ARF6 Q67L. ARF6-medierad ELMO1-berikning i fr 7 minskade signifikant i FE65 KO-celler. (B-C) Återvinning endosome markör Rab11 (1:500) och cytosol markör GAPDH (1:10,000) undersöktes. ELMO1, FE65 och ARF6 Q67L upptäcktes med anti-ELMO1 B-7 (1:1000), anti-FE65 E-20 (1:1000) respektive anti-myc 9B11 (1:5000). Den relativa nivån på ELMO1 i del 7 uttrycktes som densitometriska kvoten för ELMO1 i fraktion 7/total ELMO1. Data för stapeldiagrammet erhölls från tre oberoende experiment. Enkelriktad ANOVA med Bonferroni post hoc-test användes för statistisk analys. *p < 0,001. Resultaten är genomsnittlig vikförändring ± SD22. Denna siffra har ändrats från Chan, W. W. R. et al.22. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovanstående protokoll beskriver förfarandena för att isolera återvinning endosomer från odlade celler genom ultracentrifugation. Tillförlitligheten hos denna metod har visats av den senaste publikationen22, som bevisar att återvinning endosomer framgångsrikt isoleras från andra organeller (figur 1), såsom Golgi-apparaten och mitokondrier. Vissa kritiska steg måste uppmärksammas för att få ett bra separationsresultat. Vid beredning av sackaroslösningarna rekommenderas att validera lösningarnas brytningsindex med en refraktometer. Brytningsindexet för 62%, 35% och 25% sackaroslösningar vid rumstemperatur är 1,44, 1,39 respektive 1,37. Luftbubblor bör också undvikas från lutningen. Förekomsten av bubblor i kolonnen kan störa lutningens kontinuitet. Tvättmedel bör undvikas i homogeniseringsprocessen eftersom de skadar membranet av organeller. Detta leder till frisättning av proteiner från membranbundna organeller och kan leda till allvarlig kontaminering. Dessutom bör alla homogeniseringsverktyg förkylas före användning för att undvika proteinnedbrytning under homogenisering. När lutningen har förberetts bör den användas så snart som möjligt. Även om den beredda lutningen tillfälligt kunde lagras vid 4 °C (1-2 h), kan långvarig lagring störa densitetsgradienten på grund av diffusion.
Sackaros är ett allmänt använt gradientmedium på grund av dess enkla tillgänglighet. Faktum är att det finns många andra alternativ, inklusive Percoll och Ficoll-40023,24. Dessa medier har olika fysiska egenskaper jämfört med sackaros. Till exempel har Percoll lägre osmolaritet och viskositet än sackaros. Dessa möjliggör snabb bandning av partiklar med lägre centrifugalkrafter. Ficoll-400 har en lägre permeabilitet mot membran än sackaros på grund av dess höga molekylvikt och låga innehåll av dialyserbart material. Därför kan byte av gradientmedium uppnå en högre endosom isoleringseffektivitet.
Förutom densitetsgradient ultracentrifugation kan andra metoder användas för cellfraktionering, inklusive fritt flödeselektrofores (FFE)25,fluorescensaktiverad organellsortering (FAOS)26och immunisolation27. FFE är en vätskefasseparationsmetod. Provet flödar genom separationsbufferten under påverkan av ett elektriskt fält vinkelrätt mot flödesriktningen. Avböjningsnivåer för olika organeller varierar beroende på deras ytladdningar25. FAOS använder vanligtvis en fluorescerande tagg eller antikropp för att märka specifik organell och följs sedan av flödescytometri för isoleringen28,29. Immunisolation är beroende av att upptäcka specifika antigener på ytan av den riktade organellen och efterföljande utfällning av antikroppar30.
När man jämför med dessa alternativ har densitetsgradient ultracentrifugation sina egna fördelar. Först och främst kan en distributionsprofil av det intresserade proteinet erhållas genom att utföra västerländsk blotting med de isolerade fraktionerna (figur 2A). Eventuella förändringar i protein subcellulär lokalisering kan lätt upptäckas. Dessutom är ultracentrifuge ett standardinstrument i de flesta institut, och det tekniska kravet för drift av centrifugen är lågt. Däremot krävs en flödescytometer och ett specifikt elektroforessystem för isoleringsprocessen av FAOS respektive FFE. Det krävs ingen specifik utrustning för immunisolation. Det används dock främst för att isolera endosomer från ett litet antal celler. Beredningsskalan av ultracentrifugation är större än immunisolation. Dessutom är en antikropp med hög specificitet nödvändig för immunisolation31. Dessutom kan tvättmedels- och hög salthaltig buffert inte användas i tvättstegen för att säkerställa endosomernas integritet. Detta kan leda till hög bakgrund och minska renheten hos den isolerade organellen31.
Eftersom densitet gradient ultracentrifugation separerar organeller baserat på densitet, är dess viktigaste begränsning att lösa makt mot organeller med liknande densitet. Som framgår av figur 1detekteras både Rab11 och EES1 i bråkdel 7 på grund av de liknande fysiska egenskaperna hos återvinning och tidiga endosomer. Ytterligare analyser behövs för att bekräfta förändringarna i nivån på det riktade proteinet i återvinningsendosomen. I den tidigare studien utfördes co-immunostaining på ELMO1 och Rab11 i cellerna22. Förutom att utföra andra analyser kan vissa åtgärder vidtas för att övervinna detta problem. En kontinuerlig densitetsgradient kan lösa organeller med mindre densitetsskillnader32. Avkastningen i en kontinuerlig gradient är dock betydligt lägre än för en diskontinuerlig gradient. Det är möjligt att manipulera endosomens densitet genom att förbehandla cellerna med latexpärlor33. Pärlor internaliseras av cellerna via endocytos. Densiteten hos pärlor som innehåller endosomer reduceras avsevärt och kan separeras från andra organeller. Vanligtvis kan tillägg av en annan nivå av isolering avsevärt förbättra isoleringen av organeller med liknande densiteter. Utför till exempel immunisolation från den isolerade fraktionen34. Genom att använda en specifik antikropp kan återvinningsendosomer separeras från föroreningarna. Fluorescerande märkta antikroppar och sonder, i kombination med flödescytometrianalys, kan också användas för exakt endosom isolering28. FFE är också tillämpligt för att separera organeller med liknande densitet baserat på deras ytladdning25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter med innehållet i denna artikel.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Research Grants Council Hong Kong, CUHK direct grant scheme, United College endowment fund och TUYF Charitable Trust. Siffrorna i detta arbete anpassades från vår tidigare publikation, "ARF6-Rac1 signal-mediated neurit utväxt förstärks av neuronal adapter FE65 genom orkestrerande ARF6 och ELMO1" publicerad i FASEB Journal i oktober 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).
