Summary
Este artículo tiene como objetivo presentar un protocolo para la preparación de endosomas de reciclaje de células de mamíferos utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa.
Abstract
El tráfico endosomal es un proceso celular esencial que regula una amplia gama de eventos biológicos. Las proteínas se internalizan desde la membrana plasmática y luego se transportan a los endosomas tempranos. Las proteínas internalizadas podrían ser transitadas al lisosoma para su degradación o recicladas de vuelta a la membrana plasmática. Se requiere una vía de reciclaje endocítica robusta para equilibrar la eliminación de materiales de membrana de la endocitosis. Se informa que varias proteínas regulan la vía, incluido el factor de ribosilación ADP 6 (ARF6). La ultracentrifugación por gradiente de densidad es un método clásico para el fraccionamiento celular. Después de la centrifugación, los orgánulos se sedimentan en su superficie isopícnica. Las fracciones se recogen y se utilizan para otras aplicaciones posteriores. Aquí se describe un protocolo para obtener una fracción de reciclaje que contiene endosomas de células de mamíferos transfectadas utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad. Las fracciones aisladas fueron sometidas a Western blotting estándar para analizar su contenido proteico. Al emplear este método, identificamos que la orientación de la membrana plasmática de la envoltura y la motilidad celular 1 (ELMO1), un sustrato de toxina botulínica C3 relacionada con Ras 1 (Rac1) factor de intercambio de nucleótidos de guanina, es a través del reciclaje endocítico mediado por ARF6.
Introduction
El tráfico endosomal es un proceso fisiológico esencial que implica diversos eventos biológicos1,por ejemplo, el transporte de receptores de señalización, canales iónicos y moléculas de adhesión. Las proteínas localizadas en la membrana plasmática se internalizan porendocitosis 2. Las proteínas internalizadas se clasifican por el endosoma temprano3. Algunas de las proteínas están dirigidas a los lisosomas para su degradación4. Sin embargo, una cantidad significativa de proteínas se reciclan de vuelta a la superficie celular mediante procesos de reciclaje rápido y reciclaje lento. En el reciclaje rápido, las proteínas abandonan los endosomas tempranos y regresan directamente a la membrana plasmática. Por el contrario, en el reciclaje lento, las proteínas se clasifican primero al compartimiento de reciclaje endocítico y luego se transportan de regreso a la membrana plasmática. Varias proteínas de carga, por ejemplo, clatrina, complejo de retrómeros, complejo retriever y proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich, y complejo SCAR Homologue (WASH), participan en tales procesos de reciclaje demembranas 4,5,6,7,8,9. El equilibrio del evento de endocitosis y reciclaje es crucial para la supervivencia celular y contribuye a varios eventos celulares10,por ejemplo, la adhesión celular, la migración celular, la polaridad celular y la transducción de señales.
ARF6, una pequeña GTPasa, es un regulador reportado del tráfico endocítico7,11,12. De interés, diversos grupos de investigación han ilustrado la importancia de ARF6 en el reciclaje endocítico13,14,15,16,17. El estudio tiene como objetivo investigar la relación entre el crecimiento de neuritas mediado por ARF6 y el reciclaje endocítico. El informe anterior sugiere que la activación de ARF6 es aguas arriba de la actividad de Rac1 al actuar sobre ELMO1-dedicador del complejo citocinesis 1 (DOCK180)18. Sin embargo, la forma en que ARF6 desencadena la señalización Rac1 mediada por ELMO1-DOCK180 sigue sin estar clara. Se empleó la ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el papel del reciclaje endocítico mediado por ARF6 en dicho proceso. Mediante el uso de esto, la fracción que contiene endosoma de reciclaje se obtuvo a partir de lisados celulares19. La fracción fue sometida a Western blotting para el análisis del contenido de proteínas. Los resultados de immunoblot revelaron que bajo la presencia de FE65, una proteína adaptadora enriquecida con cerebro, ARF6 activo aumentó sustancialmente el nivel de ELMO1 en la fracción que contiene endosomas de reciclaje. El siguiente protocolo incluye los procedimientos para (1) transfectar células de mamíferos; (2) preparación de las muestras y columnas de gradiente de densidad; y (3) la obtención de la fracción que contiene endosoma de reciclaje.
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Protocol
1. Cultivo y transfección de células de mamíferos
- Placa 2 x 106 celdas en una placa de cultivo de 100 mm. Use cuatro platos para cada transfección.
NOTA: El número de celdas necesarias puede variar para diferentes líneas celulares. La optimización puede ser necesaria antes de proceder al paso de aislamiento. - Al día siguiente, transfecte las células con lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Cosecha de células
- Desechar el medio de cultivo 48 h después de la transfección.
- Lave las células con PBS helado (fosfatos de sodio de 10 mM, cloruro de potasio de 2,68 mM, cloruro de sodio de 140 mM) dos veces.
- Agregue 1 ml de PBS+ helado (PBS suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa 0.5x y cóctel inhibidor de la fosfatasa 0.5x) a cada plato.
- Recoja las células con un raspador celular y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml.
- Pellet las células por centrifugación utilizando un rotor de cucharón oscilante a 400 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular suavemente en 5 ml de tampón de homogeneización (HB; 250 mM de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4, 1 mM de EDTA suplementado con 0.03 mM de cicloheximida, 1x cóctel inhibidor de la proteasa y 1x cóctel inhibidor de la fosfatasa).
- Recoger las células por centrifugación a 1.300 x g durante 10 min.
- Resuspend el pellet celular en 1 mL de HB.
- Homogeneizar las células con un homogeneizador Dounce para 15-20 golpes.
NOTA: Se podrían utilizar otros métodos de homogeneización, por ejemplo, pasar la muestra a través de una jeringa. La eficiencia de homogeneización podría revelarse observando el homogeneizado bajo un microscopio de contraste de fase. - Transfiera el homogeneizado a un tubo de centrifugación de 2 ml.
NOTA: Cosechar 50 μL de homogeneizado con 12,5 μL de tampón de muestra 5x y etiquetarlo como lisado total. - Añadir 0,7 ml de HB al homogeneizado.
- Girar el homogeneizado diluido a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C.
NOTA: El pellet contiene núcleos y células ininterrumpidas. - Recoja 1,5 ml del sobrenadante y repita el paso 2,12 una vez.
- Recolectar 1,4 ml del sobrenadante y etiquetarlo como sobrenadante postnuclear (SNP).
3. Preparación de la columna de gradiente de densidad
- Transfiera 1,2 ml de SNP a un tubo de ultracentrífuga.
- Añadir 1 ml de solución de sacarosa al 62% (2.351 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7,4) a la muestra y mezclar bien mediante pipeteo suave.
NOTA: La solución resultante es una solución de sacarosa al 40,6%. - Agregue 3.3 ml de solución de sacarosa al 35% (1.177 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4) cuidadosamente en la parte superior de la muestra.
- Agregue 2.2 ml de solución de sacarosa al 25% (0.806 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4) cuidadosamente sobre la solución de sacarosa al 35%.
NOTA: El índice de refracción de las soluciones de sacarosa al 62%, 40.6%, 35% y 25% a temperatura ambiente es de 1.44, 1.40, 1.39 y 1.37, respectivamente. Los índices de refracción de las soluciones de sacarosa se pudieron comprobar con un refractómetro para garantizar la precisión y la consistencia del experimento. - Llene el tubo de ultracentrifugación con HB.
NOTA: Almacene temporalmente la columna de gradiente de densidad preparada a 4 °C.
4. Fraccionamiento y recuperación de la fracción que contiene endosomas de reciclaje
- Centrifugar la columna a 210.000 x g durante 3 h a 4 °C.
- Recolecte 12 fracciones (1 ml cada una) cuidadosamente, comenzando desde la parte superior del gradiente.
NOTA: Los endosomas de reciclaje deben encontrarse en la interfaz entre soluciones de sacarosa al 35% y al 25%. Las fracciones recogidas pueden congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C. - Diluir todas las fracciones con 1 mL de tampón de dilución (3 mM de imidazol a pH 7.4, 1 mM EDTA).
- Centrifugar la muestra diluida a 100.000 x g durante 1 h a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante y agregue 50 μL de 1x tampón de muestra para cosechar las fracciones.
- Analizar el contenido de proteínas en las fracciones mediante western blotting.
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Representative Results
Después de fraccionar las células HEK293 no transfectadas por ultracentrifugación por gradiente de densidad, se recolectaron 12 fracciones a partir de la parte superior del gradiente. Las fracciones cosechadas se diluyeron con el tampón de dilución en una proporción de 1:1 y se sometieron a una segunda ronda de centrifugación. Las muestras se sometieron a western blotting para analizar su contenido de proteínas. Como se muestra en la Figura 1,el marcador de endosoma de reciclaje Rab11 se detecta en la fracción 720. También se investigaron otros marcadores subcelulares, incluidos β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 y Lamp1. También se detecta una señal POSITIVA EEA1 en la fracción 7. Las intensidades de banda de GAPDH, COX IV y Rab11 tanto en la fracción 7 como en PNS se midieron con el software ImageLab (Bio-Rad). Las relaciones de intensidad de los marcadores en la fracción 7 a PNS se calcularon y expresaron en un gráfico de barras ± SD.
Los estudios previos sugieren que ARF6 y ELMO1 interactúan con FE65 para promover el crecimiento de neuritas mediado por Rac121,22. Dado que ARF6 es un regulador del reciclaje endocítico y la orientación de la membrana plasmática ELMO1 es crítica para la posterior activación de Rac1, se plantea la hipótesis de que FE65 conecta ARF6 y ELMO1 para mediar en el tráfico de ELMO1 a la membrana plasmática. Por lo tanto, este método se empleó para investigar el nivel de ELMO1 en los endosomas de reciclaje aislados. Las células HEK293 fueron transfectadas con ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, o ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. No se encontraron cambios en la distribución de ELMO1 con sobreexpresión de ARF6 Q67L y FE65 (Figura 2A). A continuación, se comparó el nivel de ELMO1 en la fracción 7 (Rab11-positivo) entre diferentes transfecciones. Se encuentra que la cantidad de ELMO1 en la fracción se eleva después de la co-transfección de ARF6 Q67L. Se observa un aumento adicional en el nivel de ELMO1 cuando tanto ARF6 Q67L como FE65 se coexpresan (Figura 2B). Por el contrario, la eliminación de FE65 disminuyó el enriquecimiento de ELMO1 mediado por ARF6 en la fracción 7(Figura 2C).
Figura 1:Los endosomas de reciclaje se encuentran en la fracción 7 después de la ultracentrifugación del gradiente de densidad. Se fraccionaron células HEK293 no transfectadas y se analizó el contenido proteico en las fracciones obtenidas con western blotting. Rab11 se detecta en la fracción 7 con un anticuerpo anti-Rab11 (1:500). Se detectaron otros marcadores subcelulares con sus anticuerpos específicos, incluidos β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10.000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500) y Lamp1 (1:1000). La fracción 1 es la fracción superior menos densa, mientras que la fracción 12 es la fracción inferior más densa. El gráfico de barras muestra la relación de GAPDH, COX IV y Rab11 en la fracción 7 a PNS ± SD. Esta figura ha sido modificada a partir de Chan, W. W. R. et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:La expresión de FE65 promueve el reciclaje endocítico mediado por ARF6 de ELMO1. (A) Las células transfectadas con ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, o ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 se fraccionaron utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad. Todas las fracciones fueron sometidas a western blotting para analizar las distribuciones de ELMO1, ARF6 Q67L y FE65. La fracción 1 es la fracción superior menos densa, mientras que la fracción 12 es la fracción inferior más densa. (B) La fracción 7 Rab11 positiva de diferentes transfecciones se analizó con Western blotting para evaluar los niveles de ELMO1 y ARF6 Q67L. La cantidad de ELMO1 en la fracción 7 se elevó cuando las células se coinfectaron con ARF6 Q67L. La coexpresión de ARF6 Q67L y FE65 aumenta aún más la cantidad de ELMO1 en la fracción. (C) Wildtype HEK293 fue transfectado con ELMO1 o ELMO1 + ARF6 Q67L, mientras que FE65 KO HEK293 fue transfectado con ELMO1 + ARF6 Q67L. El enriquecimiento de ELMO1 mediado por ARF6 en la fracción 7 disminuyó significativamente en las células KO FE65. (B-C) Se sondearon el marcador de endosoma de reciclaje Rab11 (1:500) y el marcador de citosol GAPDH (1:10.000). ELMO1, FE65 y ARF6 Q67L se detectaron con anti-ELMO1 B-7 (1:1000), anti-FE65 E-20 (1:1000) y anti-myc 9B11 (1:5000), respectivamente. El nivel relativo de ELMO1 en la fracción 7 se expresó como la relación densitométrica del ELMO1 en la fracción 7/ELMO1 total. Los datos para el gráfico de barras se obtuvieron de tres experimentos independientes. Se empleó ANOVA unidireccional con prueba post hoc de Bonferroni para el análisis estadístico. *p < 0,001. Los resultados son el cambio de pliegue medio ± SD22. Esta figura ha sido modificada a partir de Chan, W. W. R. et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo anterior describe los procedimientos para aislar el reciclaje de endosomas de células cultivadas por ultracentrifugación. La fiabilidad de este método ha sido demostrada por la última publicación22,demostrando que el reciclaje de endosomas se aísla con éxito de otros orgánulos(Figura 1),como el aparato de Golgi y las mitocondrias. Se debe prestar atención a algunos pasos críticos para obtener un buen resultado de separación. Al preparar las soluciones de sacarosa, se recomienda validar los índices de refracción de las soluciones con un refractómetro. El índice de refracción de las soluciones de sacarosa al 62%, 35% y 25% a temperatura ambiente es de 1,44, 1,39 y 1,37, respectivamente. Además, las burbujas de aire deben evitarse del gradiente. La presencia de burbujas en la columna puede interrumpir la continuidad del gradiente. Los detergentes deben evitarse en el proceso de homogeneización ya que dañan la membrana de los orgánulos. Esto conduce a la liberación de proteínas de orgánulos unidos a la membrana y podría resultar en una contaminación severa. Además, todas las herramientas de homogeneización deben enfriarse previamente antes de su uso para evitar la degradación de proteínas durante la homogeneización. Una vez que se prepara el gradiente, debe usarse lo antes posible. Aunque el gradiente preparado podría almacenarse temporalmente a 4 °C (1-2 h), el almacenamiento prolongado puede interferir con el gradiente de densidad debido a la difusión.
La sacarosa es un medio degradado ampliamente utilizado debido a su fácil disponibilidad. De hecho, hay muchas otras alternativas, incluyendo Percoll y Ficoll-40023,24. Estos medios tienen diferentes propiedades físicas en comparación con la sacarosa. Por ejemplo, Percoll tiene una osmolaridad y viscosidad más bajas que la sacarosa. Estos permiten el anillamiento rápido de partículas utilizando fuerzas centrífugas más bajas. Ficoll-400 tiene una menor permeabilidad hacia las membranas que la sacarosa debido a su alto peso molecular y bajo contenido de material dializable. Por lo tanto, cambiar el medio de gradiente puede lograr una mayor eficiencia de aislamiento del endosoma.
Además de la ultracentrifugación por gradiente de densidad, se pueden utilizar otros métodos para el fraccionamiento celular, incluida la electroforesis de flujo libre(FFE) 25,la clasificación de orgánulos activada por fluorescencia (FAOS)26y la inmunoaislación27. FFE es un método de separación en fase líquida. La muestra fluye a través del tampón de separación bajo la influencia de un campo eléctrico perpendicular a la dirección del flujo. Los niveles de deflexión de los diferentes orgánulos varían en función de sus cargas superficiales25. FAOS generalmente utiliza una etiqueta fluorescente o anticuerpo para etiquetar orgánulos específicos y luego seguido de citometría de flujo para el aislamiento28,29. La inmunoaislación se basa en la detección de antígenos específicos en la superficie del orgánulo objetivo y la posterior precipitación por anticuerpos30.
Al comparar con estas alternativas, la ultracentrifugación por gradiente de densidad tiene sus propias ventajas. En primer lugar, se puede obtener un perfil de distribución de la proteína interesada realizando Western blotting con las fracciones aisladas (Figura 2A). Cualquier cambio en la localización subcelular de proteínas podría detectarse fácilmente. Además, la ultracentrífuga es un instrumento estándar en la mayoría de los institutos, y el requisito técnico para operar la centrífuga es bajo. Por el contrario, se requiere un citómetro de flujo y un sistema de electroforesis específico para el proceso de aislamiento de FAOS y FFE, respectivamente. No se requiere equipo específico para la inmunoaislación. Sin embargo, se utiliza principalmente para aislar endosomas de un pequeño número de células. La escala de preparación de la ultracentrifugación es mayor que la del inmunoaislamiento. Además, es necesario un anticuerpo con alta especificidad para la inmunoaislación31. Además, el tampón con alto contenido de detergente y sal no se puede utilizar en las etapas de lavado para garantizar la integridad de los endosomas. Esto puede conducir a un fondo alto y reducir la pureza del orgánulo aislado31.
Dado que la ultracentrifugación por gradiente de densidad separa los orgánulos en función de la densidad, su limitación más significativa es la de resolver el poder hacia orgánulos con densidad similar. Como se muestra en la Figura 1,tanto Rab11 como EEA1 se detectan en la fracción 7 debido a las propiedades físicas similares del reciclaje y los endosomas tempranos. Se necesitan más ensayos para confirmar los cambios en el nivel de la proteína objetivo en el endosoma de reciclaje. En el estudio anterior, la coinmunotinción en ELMO1 y Rab11 se realizó en las células22. Además de realizar otros ensayos, se pueden adoptar algunas medidas para superar este problema. Un gradiente de densidad continuo puede resolver orgánulos con pequeñas diferencias de densidad32. Sin embargo, el rendimiento en un gradiente continuo es significativamente menor que el de un gradiente discontinuo. Es posible manipular la densidad del endosoma tratando previamente las células con perlas delátex 33. Las perlas son internalizadas por las células a través de la endocitosis. La densidad de las perlas que contienen endosomas se reduce significativamente y se puede separar de otros orgánulos. Por lo general, agregar otro nivel de aislamiento podría mejorar significativamente el aislamiento de orgánulos con densidades similares. Por ejemplo, realizar el inmunoaislamiento a partir de la fracción aislada34. Mediante el uso de un anticuerpo específico, los endosomas de reciclaje se pueden separar de los contaminantes. Los anticuerpos y sondas marcados con fluorescentes, combinados con el análisis de citometría de flujo, también podrían usarse para el aislamiento preciso de endosomas28. FFE también es aplicable para separar orgánulos con densidades similares en función de su carga superficial25.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong, el esquema de subvenciones directas de CUHK, el fondo de dotación de United College y el TUYF Charitable Trust. Las figuras de este trabajo fueron adaptadas de nuestra publicación anterior, "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" publicado en faseb Journal en octubre de 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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