Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

Published: June 30, 2021 doi: 10.3791/62621
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה נועד להציג פרוטוקול להכנת אנדוזומים למיחזור מתאי יונקים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית הדרגתית של צפיפות סוכרוז.

Abstract

סחר אנדוסומלי הוא תהליך תאי חיוני המסדיר מגוון רחב של אירועים ביולוגיים. חלבונים מופנמים מקרום הפלזמה ולאחר מכן מועברים לאנדוזומים המוקדמים. החלבונים המופנמים יכולים להיות מועברים ליזוזום להשפלה או ממוחזר בחזרה לקרום הפלזמה. מסלול מיחזור אנדוציטי חזק נדרש כדי לאזן את הסרת חומרי הממברנה מאנדוציטוזיס. חלבונים שונים מדווחים כדי לווסת את המסלול, כולל גורם ADP-ריבוסילציה 6 (ARF6). אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות היא שיטה קלאסית לפירוק תאים. לאחר הצנטריפוגה, אברונים הם משקעים על פני השטח האיזופקניים שלהם. השברים נאספים ומשמשים עבור יישומים אחרים במורד הזרם. מתואר כאן פרוטוקול להשגת שבר המכיל אנדוזום ממחזור מתאי יונקים שהודבקו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות. השברים המבודדים היו נתונים לכתמים מערביים סטנדרטיים לניתוח תכולת החלבון שלהם. על ידי שימוש בשיטה זו, זיהינו כי מיקוד קרום הפלזמה של בלוע תנועתיות תא 1 (ELMO1), מצע רעלן בוטולינום C3 הקשורים לראס 1 (Rac1) גורם החלפת נוקלאוטידים גואנין, הוא באמצעות מיחזור אנדוציטי בתיווך ARF6.

Introduction

סחר אנדוסומלי הוא תהליך פיזיולוגי חיוני המסבך אירועים ביולוגיים שונים1, למשל, הובלה של קולטני איתות, תעלות יונים ומולקולות הידבקות. חלבונים מקומיים בקרום הפלזמה מופנמים על ידי אנדוציטוזיס2. החלבונים המופנמים ממוינים לאחר מכן על ידי אנדוזום מוקדם3. חלק מהחלבונים מיועדים ליזוזומים להשפלה4. עם זאת, כמות משמעותית של חלבונים ממוחזרים בחזרה לפני השטח של התא על ידי מיחזור מהיר ותהליכי מיחזור איטיים. במיחזור מהיר, חלבונים לעזוב את אנדוזומים המוקדמים ולחזור ישירות קרום הפלזמה. לעומת זאת, במיחזור איטי, חלבונים ממוינים תחילה לתא המיחזור האנדיוציטי ולאחר מכן מועברים בחזרה לקרום הפלזמה. חלבוני מטען שונים, למשל, קלתרין, קומפלקס רטרומר, קומפלקס רטריבר וחלבון תסמונת ויסקוט-אולדריץ ', ותסביך SCAR Homologue (WASH), משתתפים בתהליכי מיחזור ממברנה כאלה4,5,6,7,8,9. האיזון של אירוע אנדוציטוזיס ומיחזור הוא חיוני להישרדות התא ותורם לאירועים תאיים שונים10, למשל, הידבקות תאים, נדידת תאים, קוטביות התא, טרנסדוקציה של אותות.

ARF6, GTPase קטן, הוא רגולטור דיווח של סחר אנדוציטי7,11,12. מעניין, קבוצות מחקר שונות המחישו את החשיבות של ARF6 במיחזור אנדוציטי13,14,15,16,17. מטרת המחקר היא לחקור את הקשר בין תולדת הנויריט בתיווך ARF6 לבין מיחזור אנדוציטי. הדו"ח הקודם מציע כי ההפעלה של ARF6 היא במעלה הזרם לפעילות Rac1 באמצעות פועל על ELMO1-dedicator של ציטוקינזיס 1 (DOCK180)קומפלקס 18. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד ARF6 מפעיל את איתות Rac1 המתווך של ELMO1-DOCK180. צפיפות הדרגתית אולטרה צנטריפוגה הועסק כדי לחקור את התפקיד של ARF6 בתיווך מיחזור אנדוציטי בתהליך כזה. באמצעות זה, השבר המכיל אנדוזום מיחזור הושג מ lysates התא19. השבר היה נתון לכתמים מערביים לניתוח תכולת חלבון. תוצאות החיסון חשפו כי תחת נוכחותו של FE65, חלבון מתאם מועשר במוח, ARF6 פעיל הגדיל באופן משמעותי את רמת ELMO1 בשבר המכיל אנדוזום מיחזור. הפרוטוקול הבא כולל את הנהלים ל(1) תאים יונקים; (2) הכנת הדגימות ועמודות מעבר צבע בצפיפות; ות (3) קבלת השבר המכיל אנדוזום למיחזור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים של יונקים וזיהוי

  1. צלחת 2 x 106 תאים בצלחת תרבית 100 מ"מ. השתמש בארבע מנות עבור כל transfection.
    הערה: מספר התאים הנדרשים עשוי להשתנות עבור שורות תאים שונות. ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה לפני שתמשיך לשלב הבידוד.
  2. למחרת, להעביר את התאים עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן.

2. קציר תאים

  1. השלך את המדיום התרבותי 48 שעות לאחר טרנספקט.
  2. לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח (10 mM נתרן פוספטים, 2.68 mM אשלגן כלורי, 140 mM נתרן כלורי) פעמיים.
  3. הוסיפו 1 מ"ל של PBS קר כקרח+ (PBS בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 0.5x וקוקטייל מעכב פוספטאז 0.5x) לכל מנה.
  4. לאסוף את התאים עם מגרד תא ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
  5. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה באמצעות רוטור דלי נדנדה ב 400 x g במשך 5 דקות.
  6. השליכו את הסופרנט והדביקו מחדש את גלולה התא בעדינות ב-5 מ"ל של חוצץ הומוגניזציה (HB; 250 מ"מ סוכרוז, 3 מ"מ imidazole ב-pH 7.4, 1 mM EDTA בתוספת 0.03 מ"מ cycloheximide, קוקטייל מעכב פרוטאז 1x וקוקטייל מעכב פוספטאז 1x).
  7. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1,300 x g במשך 10 דקות.
  8. resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של HB.
  9. הומוגניזציה התאים עם הומוגניזר Dounce עבור 15-20 משיכות.
    הערה: שיטות הומוגניזציה אחרות, למשל, העברת המדגם דרך מזרק, ניתן להשתמש. יעילות ההומוגניזציה יכולה להתגלות על ידי התבוננות בהומוגנט תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
  10. מעבירים את ההומוגנית לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.
    הערה: קציר 50 μL של הומוגניאט עם 12.5 μL של 5x מאגר מדגם ולתייג אותו כמו ליסייט הכולל.
  11. הוסף 0.7 מ"ל של HB להומוגניט.
  12. סובב את ההומוגנאט מדולל ב 2,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: הכדור מכיל גרעינים ותאים רצוף.
  13. לאסוף 1.5 מ"ל של supernatant ולחזור על שלב 2.12 פעם אחת.
  14. לאסוף 1.4 מ"ל של supernatant ולתייג אותו כמו לאחר גרעין supernatant (PNS).

3. הכנת עמודות הדרגתיות בצפיפות

  1. העבר 1.2 מ"ל של PNS לצינור אולטרה צנטריפוגה.
  2. הוסיפו 1 מ"ל לתמיסת סוכרוז 62% (2.351 M סוכרוז, 3 מ"מ imidazole ב- pH 7.4) וערבבו היטב על ידי צנרת עדינה.
    הערה: הפתרון המתקבל הוא פתרון סוכרוז של 40.6%.
  3. הוסף 3.3 מ"ל של פתרון סוכרוז 35% (1.177 M סוכרוז, 3 mM imidazole ב pH 7.4) בזהירות על גבי המדגם.
  4. הוסף 2.2 מ"ל של 25% תמיסה סוכרוז (0.806 M סוכרוז, 3 mM imidazole ב pH 7.4) בזהירות על גבי פתרון 35% סוכרוז.
    הערה: המדד השבירה של 62%, 40.6%, 35% ו-25% פתרונות סוכרוז בטמפרטורת החדר הם 1.44, 1.40, 1.39 ו-1.37, בהתאמה. ניתן לבדוק את האינדקסים השבירה של פתרונות הסורוז עם שבירה כדי להבטיח את הדיוק והעקביות של הניסוי.
  5. מלא את צינור האולטרה-צנטריפוגה ב-HB.
    הערה: אחסן באופן זמני את עמודת מעבר הצבע של הצפיפות המוכנה ב- 4 °C (70 °F).

4. שבר והתאוששות של שבר המכיל אנדוזום מיחזור

  1. צנטריפוגות את העמודה ב 210,000 x g עבור 3 שעות ב 4 °C (70 °F).
  2. אסוף 12 שברים (1 מ"ל כל אחד) בזהירות, החל מראש מעבר הצבע.
    הערה: יש למצוא את אנדוזומים המיחזור בממשק בין 35% ל -25% פתרונות סוכרוז. השברים שנאספו יכולים להיות קפואים בחנקן נוזלי ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.
  3. לדלל את כל השברים עם 1 מ"ל של חוצץ דילול (3 mM imidazole ב pH 7.4, 1 mM EDTA).
  4. צנטריפוגה מדגם מדולל ב 100,000 x גרם עבור 1 שעה ב 4 °C (70 °F).
  5. שאפו את supernatant ולהוסיף 50 μL של חוצץ מדגם 1x כדי לקצור את השברים.
  6. לנתח את תכולת החלבון בשברים על ידי סופג מערבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר פירוק תאי HEK293 הלא נגועים על-ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, נאספו 12 שברים החל מראש מעבר הצבע. השברים שנקטפו דוללו עם מאגר הדילול ביחס של 1:1 ונחשפו לסיבוב שני של צנטריפוגה. הדגימות היו נתונות אז סופג מערבי לניתוח תכולת החלבון שלהם. כפי שמוצג באיור 1, סמן המיחזור של Rab11 מזוהה בשבר 720. סמנים תת-תאיים אחרים, כולל β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 ו- Lamp1, נחקרו גם הם. אות EEA1 חיובי מזוהה גם בשבר 7. עוצמות הרצועה של GAPDH, COX IV ו- Rab11 הן בשבר 7 והן ב- PNS נמדדו באמצעות תוכנת ImageLab (Bio-Rad). יחסי העוצמה של הסמנים בשבר 7 ל- PNS חושבו והתבטאו בתרשים עמודות ± SD.

המחקרים הקודמים מראים כי ARF6 ו- ELMO1 אינטראקציה עם FE65 כדי לקדם ראט 21 בתיווךנורייט גדל 21,22. מאז ARF6 הוא רגולטור של מיחזור אנדוציטי ומיקוד קרום פלזמה ELMO1 הוא קריטי להפעלת Rac1 הבאה, הוא ההשערה כי FE65 מחבר ARF6 ו ELMO1 כדי לתווך את הסחר של ELMO1 לקרום הפלזמה. לכן, שיטה זו שימשה כדי לחקור את רמת ELMO1 ב endosomes מיחזור מבודד. תאי HEK293 הועברו עם ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, או ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. לא נמצאו שינויים בהפצת ELMO1 עם ביטוי יתר ARF6 Q67L ו- FE65 (איור 2A). לאחר מכן, רמת ELMO1 בשבר 7 (Rab11-חיובי) הושוו בין transfections שונים. כמות ELMO1 בשבר נמצאה כדי להעלות לאחר transfection משותף של ARF6 Q67L. עלייה נוספת ברמת ELMO1 נצפתה כאשר הן ARF6 Q67L והן FE65 באים לידי ביטוי משותף (איור 2B). לעומת זאת, נוקאאוט של FE65 הפחית את העשרת ELMO1 בתיווך ARF6 בשבריר 7 (איור 2C).

Figure 1
איור 1: אנדוזומים למיחזור נמצאים בשבריר 7 לאחר אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות. תאי HEK293 לא נגועים נותקו ותכולת החלבון בשברים שהושגו נותחה עם סופג מערבי. Rab11 מזוהה בשבריר 7 עם נוגדן נגד Rab11 (1:500). סמנים תת-תאיים אחרים התגלו עם הנוגדנים הספציפיים שלהם, כולל β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10,000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500) ומנורה1 (1:1000). שבר 1 הוא השבר העליון הפחות צפוף, בעוד שבר 12 הוא השבר התחתון הצפוף יותר. תרשים העמודות מציג את היחס בין GAPDH, COX IV ו- Rab11 בשבר 7 ל- PNS ± SD. נתון זה שונה מצ'אן, ו.ו. ר ואח'22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ביטוי FE65 מקדם מיחזור אנדוציטי בתיווך ARF6 של ELMO1. (A) התאים שהודבקו עם ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, או ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 נותקו באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה הדרגתית של צפיפות. כל השברים היו נתונים לכתמים מערביים לניתוח ההפצות של ELMO1, ARF6 Q67L ו- FE65. שבר 1 הוא השבר העליון הפחות צפוף, בעוד שבר 12 הוא השבר התחתון הצפוף יותר. (B)שבר 7 חיובי Rab11 מן transfections שונים נותח עם סופג מערבי כדי להעריך את הרמות של ELMO1 ו ARF6 Q67L. כמות ELMO1 בשבר 7 הייתה גבוהה כאשר התאים היו שיתוף transfecting עם ARF6 Q67L. ביטוי משותף של ARF6 Q67L ו- FE65 מגדיל עוד יותר את כמות ELMO1 בשבר. (C)Wildtype HEK293 היה transfected עם ELMO1 או ELMO1 + ARF6 Q67L, ואילו FE65 KO HEK293 היה transfected עם ELMO1 + ARF6 Q67L. העשרת ELMO1 בתיווך ARF6 בשבר 7 פחתה באופן משמעותי בתאי FE65 KO. (B-C) מיחזור סמן אנדוזום Rab11 (1:500) וסמן ציטוסול GAPDH (1:10,000) נחקרו. ELMO1, FE65 ו- ARF6 Q67L זוהו עם אנטי אלמו1 B-7 (1:1000), אנטי FE65 E-20 (1:1000) ואנטי תמד"א 9B11 (1:5000), בהתאמה. הרמה היחסית של ELMO1 בשבר 7 באה לידי ביטוי כיחס הצפיפות של ELMO1 בשבר 7 / סה"כ ELMO1. הנתונים עבור תרשים העמודות התקבלו משלושה ניסויים עצמאיים. ANOVA בכיוון אחד עם בונפרוני לאחר מבחן הוק הועסק לניתוח סטטיסטי. *p < 0.001. התוצאות הן שינוי קיפול ממוצע ± SD22. נתון זה שונה מצ'אן, ו.ו. ר ואח'22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול לעיל מתאר את הנהלים לבידוד אנדוזומים של מיחזור תרבית על-ידי אולטרה-צנטריפוגה. האמינות של שיטה זו הוכח על ידי הפרסום האחרון22, המוכיח כי מיחזור אנדוזומים מבודדים בהצלחה אברונים אחרים (איור 1), כגון מנגנון Golgi ומיטוכונדריה. יש לשים לב לכמה צעדים קריטיים להשגת תוצאת הפרדה טובה. בעת הכנת פתרונות סוכרוז, מומלץ לאמת את אינדקסי השבירה של הפתרונות עם שבירה. המדד השבירה של פתרונות הסורוז 62%, 35% ו-25% בטמפרטורת החדר הם 1.44, 1.39 ו-1.37, בהתאמה. כמו כן, יש להימנע מבועות אוויר מהדרג. נוכחות של בועות בעמודה עלולה לשבש את ההמשכיות של מעבר הצבע. יש להימנע מדטרגנטים בתהליך ההומוגניזציה מכיוון שהם פוגעים בממברנה של אברונים. זה מוביל לשחרור חלבונים אברונים הקשורים לממברנה ועלול לגרום לזיהום חמור. כמו כן, כל הכלים הומוגניזציה צריך להיות מקורר מראש לפני השימוש כדי למנוע השפלת חלבון במהלך הומוגניזציה. לאחר הכנת מעבר הצבע, יש להשתמש בו בהקדם האפשרי. למרות שניתן לאחסן באופן זמני את מעבר הצבע המוכן ב- 4 °C (1-2 שעות), אחסון ממושך עלול להפריע למעבר הצבע של הצפיפות עקב דיפוזיה.

סוכרוז הוא מדיום הדרגתי בשימוש נרחב בגלל הזמינות הקלה שלו. למעשה, ישנן חלופות רבות אחרות, כולל פרקול ופיקול-40023,24. למדיה זו יש תכונות פיזיות שונות בהשוואה ל סוכרוז. לדוגמה, פרקול יש אוסמולריות נמוכה יותר וצמיגות מאשר סוכרוז. אלה מאפשרים פסים מהירים של חלקיקים באמצעות כוחות צנטריפוגליים נמוכים יותר. Ficoll-400 יש חדירות נמוכה יותר כלפי ממברנות מאשר סוכרוז בגלל המשקל המולקולרי הגבוה שלה ותכולה נמוכה של חומר חיוג. לכן, שינוי המדיום ההדרגתי עשוי להשיג יעילות בידוד אנדוזום גבוהה יותר.

מלבד צפיפות הדרגתית אולטרה מרכזית, שיטות אחרות יכולות לשמש לפירוק תאים, כולל אלקטרופורזה בזרימה חופשית (FFE)25, מיון אברונים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FAOS)26,וחיסון27. FFE היא שיטת הפרדת שלב נוזלי. המדגם זורם דרך מאגר ההפרדה בהשפעת שדה חשמלי בניצב לכיוון הזרימה. רמות הסטה של אברונים שונים משתנות בהתאם למטעני פני השטח שלהם25. FAOS משתמש בדרך כלל בתג פלואורסצנטי או בנוגדן כדי לסמן אברונים ספציפיים ולאחר מכן ציטומטריית זרימה לבידוד28,29. אימונואיסולציה מסתמכת על גילוי אנטיגנים ספציפיים על פני השטח של האורגן הממוקד והמ משקעים הבאים על ידי נוגדנים30.

בהשוואה לחלופות אלה, לצפיפות הדרגתית אולטרה-צנטריפוגה יש יתרונות משלה. קודם כל, ניתן להשיג פרופיל הפצה של החלבון המעוניין על ידי ביצוע כתמים מערביים עם השברים המבודדים (איור 2A). כל שינוי בחלבון לוקליזציה תת-תאית יכול להיות מזוהה בקלות. כמו כן, ultracentrifuge הוא מכשיר סטנדרטי ברוב המכונים, ואת הדרישה הטכנית להפעלת הצנטריפוגה נמוכה. לעומת זאת, ציטומטר זרימה ומערכת אלקטרופורזה ספציפית נדרשים לתהליך הבידוד של FAOS ו- FFE, בהתאמה. אין ציוד ספציפי הנדרש לחיסון. עם זאת, הוא משמש בעיקר לבידוד אנדוזומים ממספר קטן של תאים. סולם ההכנה של אולטרה צנטריפוגה גדול יותר מזה של חיסון. חוץ מזה, נוגדן עם ספציפיות גבוהה יש צורך חיסוני31. יתר על כן, לא ניתן להשתמש במאגר דטרגנט ומכיל מלח גבוה בשלבי הכביסה כדי להבטיח את שלמות האנדוזומים. זה עלול להוביל לרקע גבוה ולהפחית את הטוהר של אברון מבודד31.

מאז אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית צפיפות מפרידה אברונים בהתבסס על צפיפות, המגבלה המשמעותית ביותר שלה היא של פתרון כוח כלפי אברונים עם צפיפות דומה. כפי שניתן לראות באיור 1, הן Rab11 והן EEA1 מזוהות בשבריר 7 בגלל התכונות הפיזיות הדומות של מיחזור ואנדוזום מוקדם. יש צורך בבחונים נוספים כדי לאשר את השינויים ברמת החלבון הממוקד באנדוזום המיחזור. במחקר הקודם, חיסון משותף על ELMO1 ו Rab11 בוצע בתאים22. בנוסף לביצוע בדיקות אחרות, ניתן לנקוט צעדים מסוימים כדי להתגבר על בעיה זו. שיפוע צפיפות רציף יכול לפתור אברונים עם הבדלי צפיפות מינוריים32. עם זאת, התשואה במעבר הדרגתי רציף נמוכה משמעותית מזו של מעבר צבע לא רציפות. ניתן לתפעל את הצפיפות של אנדוזום על ידי טיפול מראש בתאים עם חרוזי לטקס33. החרוזים מופנמים על ידי התאים באמצעות אנדוציטוזיס. צפיפות החרוזים המכילים אנדוזומים מופחתת באופן משמעותי וניתן להפרידם לאברונים אחרים. בדרך כלל, הוספת רמה נוספת של בידוד יכול לשפר באופן משמעותי את הבידוד של אברונים עם צפיפות דומה. לדוגמה, לבצע חיסונים מן השבר המבודד34. באמצעות נוגדן מסוים, ניתן להפריד אנדוזומים ממחזור מהמזהמים. נוגדנים וגשושיות עם תווית פלואורסצנטית, בשילוב עם ניתוח ציטומטריית זרימה, יכולים לשמש גם לבידוד אנדוזום מדויק28. FFE ישים גם להפרדת אברונים עם צפיפות דומה בהתבסס על מטען פני השטח שלהם25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים עם תוכן מאמר זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממועצת מענקי המחקר בהונג קונג, תוכנית המענקים הישירים של CUHK, קרן ההקדש של מכללת יונייטד וקרן הצדקה TUYF. הנתונים בעבודה זו הותאמו מהפרסום הקודם שלנו, "ARF6-Rac1 איתות-תיווך נורייט גדל הוא potentiated על ידי מתאם עצבי FE65 באמצעות תזמור ARF6 ו ELMO1" שפורסם בכתב העת FASEB באוקטובר 2020.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm Beckman Coulter 347287
100 mm tissue culture dish SPL 20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm Beckman Coulter C14277
5x Sample Buffer GenScript MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 4850S Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide Sigma-Aldrich C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL DWK Life Sciences 357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose HyClone SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7) Santa Cruz Biotechnology SC-271519 Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
FE65 antibody (E-20) Santa Cruz Biotechnology SC-19751 Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade HyClone SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) Ambion AM4300 Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software Bio-Rad Measurement of band intensity
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody Sigma G6160 Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb Cell Signaling Technology 2276S Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Calbiochem 4010-OP
Optima L-100 XP Beckman Coulter 392050
Optima MAX-TL Beckman Coulter A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media Gibco 31985070
PBS Tablets Gibco 18912014
PhosSTOP Roche 4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody Proteintech 20229-1-AP Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose Affymetrix AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).

Tags

ביוכימיה גיליון 172 ARF6 אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות שבר Rab11 מיחזור אנדוזום סוכרוז
צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, W. W. R., Zhai, Y. Q., Lau, K. … More

Chan, W. W. R., Zhai, Y. Q., Lau, K. F. Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (172), e62621, doi:10.3791/62621 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter