Summary
Bu makale, sakkaroz yoğunluğu gradyan ultracentrifugation kullanarak memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozomlarının hazırlanması için bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.
Abstract
Endosomal kaçakçılık, çok çeşitli biyolojik olayları düzenleyen önemli bir hücresel süreçtir. Proteinler plazma zarından içselleştirilir ve daha sonra erken endozomlara taşınır. İçselleştirilmiş proteinler bozulma için lizozomlara iletilebilir veya plazma zarı geri dönüştürülebilir. Membran malzemelerinin endositozdan uzaklaştırılmasını dengelemek için sağlam bir endositotik geri dönüşüm yolu gereklidir. ADP-ribosilasyon faktörü 6 (ARF6) dahil olmak üzere çeşitli proteinlerin yolu düzenlediği bildirilmektedir. Yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme hücre fraksiyonasyonu için klasik bir yöntemdir. Santrifüjlemeden sonra organeller izopik yüzeylerine çökeltilir. Kesirler toplanır ve diğer aşağı akış uygulamaları için kullanılır. Burada, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonunu kullanarak transfected memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozom içeren bir fraksiyon elde etmek için bir protokol açıklanmıştır. İzole fraksiyonlar, protein içeriklerini analiz etmek için standart Batı şişkinliğine maruz kaldı. Bu yöntemi kullanarak, Ras ile ilişkili bir C3 botulinum toksin substratı 1 (Rac1) guanin nükleotid değişim faktörü olan yutkunma ve hücre hareketliliği 1 'in (ELMO1) plazma zarının hedeflenmesinde ARF6 aracılı endosit geri dönüşümünden geçtiğini belirledik.
Introduction
Endosomal kaçakçılık, çeşitli biyolojik olayları bulaştıran temel bir fizyolojik süreçtir1, örneğin, sinyal reseptörlerinin, iyon kanallarının ve yapışma moleküllerinin taşınması. Plazma membranda lokalize proteinler endositoz ile içselleştirilir2. İçselleştirilmiş proteinler daha sonra erken endozom3ile sıralanır. Bazı proteinler bozulma için lizozomlara yöneliktir4. Bununla birlikte, hızlı geri dönüşüm ve yavaş geri dönüşüm işlemleri ile önemli miktarda protein hücre yüzeyine geri dönüştürülmektedir. Hızlı geri dönüşümde proteinler erken endozomları bırakır ve doğrudan plazma zarlarına geri döner. Tersine, yavaş geri dönüşümde proteinler önce endosit geri dönüşüm bölmesine sıralanır ve daha sonra plazma zarı ile geri taşınır. Clathrin, retromer kompleksi, retriever kompleksi ve Wiskott-Aldrich sendromu proteini ve SCAR Homologue (WASH) kompleksi gibi çeşitli kargo proteinleri, bu tür membran geri dönüşümsüreçlerine katılır 4,5,6,7 ,8,9. Endositoz ve geri dönüşüm olayının dengesi hücre sağkalımı için çok önemlidir ve çeşitli hücresel olaylara katkıda bulunur10, örneğin, hücre yapıştırma, hücre göçü, hücre polaritesi ve sinyal transdüksiyon.
Küçük bir GTPase olan ARF6, endosit kaçakçılığı7, 11,12'nin bildirilen bir düzenleyicisi. İlgi çekici olan, çeşitli araştırma grupları ARF6'nın endosit geri dönüşümünde önemini göstermiş13,14,15,16,17. Çalışma, ARF6 aracılı neurit büyümesi ve endosit geri dönüşümü arasındaki ilişkiyi araştırmayı amaçlamaktadır. Önceki rapor, ARF6'nın aktivasyonunun, sitokinoz 1 (DOCK180) kompleksi 18'in ELMO1-ayırıcısına göre hareketederekRac1 etkinliğine kadar olduğunu göstermektedir. Ancak ARF6'nın ELMO1-DOCK180 aracılı Rac1 sinyalini nasıl tetiklediği belirsizliğini koruyor. Arf6 aracılı endosit geri dönüşümün bu süreçteki rolünü araştırmak için yoğunluk gradyan ultracentrifugation kullanıldı. Bunu kullanarak, geri dönüşüm endozom içeren fraksiyon hücre lizatları19elde edildi. Fraksiyon protein içeriği analizi için Batı şişkinliğine maruz kaldı. İmmünoblot sonuçları, beyin bakımından zenginleştirilmiş bir adaptör proteini olan FE65'in varlığı altında, aktif ARF6'nın geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonda ELMO1 seviyesini önemli ölçüde artırdığını ortaya koydu. Aşağıdaki protokol, (1) memeli hücrelerinin transfecting prosedürlerini içerir; (2) örneklerin ve yoğunluk degrade sütunlarının hazırlanması; ve (3) geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonu elde etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Memeli hücre kültürü ve transfeksiyon
- Plaka 2 x 106 hücre 100 mm kültür çanasında. Her transfection için dört yemek kullanın.
NOT: Gerekli hücre sayısı farklı hücre hatları için değişebilir. İzolasyon adımına geçmeden önce optimizasyon gerekebilir. - Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre hücreleri Lipofectamine ile transfect.
2. Hücre hasadı
- Kültür ortamını 48 saat post-transfection atın.
- Hücreleri buz gibi PBS (10 mM sodyum fosfat, 2,68 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür) ile iki kez yıkayın.
- Her yemeğe 1 mL buz gibi PBS+ (0,5x proteaz inhibitörü kokteyli ve 0,5x fosfataz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş PBS) ekleyin.
- Hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayın ve hücre süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- 5 dakika boyunca 400 x g'da bir salıncak kova rotor kullanarak hücreleri santrifüjleme ile pelet.
- Süpernatantı atın ve hücre peletini 5 mL homojenizasyon tamponunda (HB; 250 mM sakkaroz, pH 7.4'te 3 mM imidazol, 0.03 mM sikloeximid, 1x proteaz inhibitörü kokteyli ve 1x fosfataz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 1 mM EDTA).
- Hücreleri 10 dakika boyunca 1.300 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
- Hücre peletini 1 mL HB'de yeniden kullanın.
- Hücreleri 15-20 vuruş için bir Dounce homojenizatör ile homojenize edin.
NOT: Örneğin, örneği bir şırınnadan geçirmek gibi diğer homojenizasyon yöntemleri kullanılabilir. Homojenizasyon verimliliği, homojenatın faz kontrastlı bir mikroskop altında gözlemlenmesiyle ortaya çıkabilir. - Homojenatı 2 mL santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: 50 μL homojenatı 12,5 μL 5x numune tamponu ile hasat edin ve toplam lysate olarak etiketleyin. - Homojeneye 0,7 mL HB ekleyin.
- Seyreltilmiş homojenatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün.
NOT: Pelet çekirdek ve kırılmamış hücreler içerir. - Süpernatant 1,5 mL toplayın ve 2,12 adımını bir kez yineleyin.
- Süpernatanttan 1,4 mL toplayın ve nükleer sonrası süpernatant (PNS) olarak etiketleyin.
3. Yoğunluk gradyan kolon hazırlama
- 1,2 mL PNS'yi ultracentrifuge tüpüne aktarın.
- Numuneye 1 mL% 62 sakkaroz çözeltisi (2.351 M sakkaroz, pH 7.4'te 3 mM imidazol) ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın.
NOT: Eldeki çözüm% 40,6 sakkaroz çözeltisidir. - Numunenin üzerine dikkatlice %35 sakkaroz çözeltisinin (1.177 M sakkaroz, pH 7.4'te 3 mM imidazol) 3.3 mL'sini ekleyin.
- %35 sakkaroz çözeltisinin üzerine 2,2 mL%25 sakkaroz çözeltisi (0,806 M sakkaroz, pH 7,4'te 3 mM imidazol) dikkatlice ekleyin.
NOT: Oda sıcaklığındaki %62, %40,6, %35 ve %25 sakkaroz çözeltilerinin kırılma indisi sırasıyla 1,44, 1,40, 1,39 ve 1,37'dir. Sakkaroz çözeltilerinin kırılma indeksleri, deneyin hassasiyetini ve tutarlılığını sağlamak için bir refraktometre ile kontrol edilebilir. - Ultracentrifugation tüpünü HB ile doldurun.
NOT: Hazırlanan yoğunluk degrade sütununu geçici olarak 4 °C'de saklayın.
4. Geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonun fraksiyonasyonu ve geri kazanımı
- Sütunu 4 °C'de 3 saat boyunca 210.000 x g'da santrifüj edin.
- Degradenin üstünden başlayarak 12 kesir (her biri 1 mL) dikkatlice toplayın.
NOT: Geri dönüşüm endozomları arayüzde %35 ile %25 sakkaroz çözeltileri arasında bulunmalıdır. Toplanan fraksiyonlar sıvı nitrojen içinde çıtlatılabilir ve -80 °C'de saklanabilir. - Tüm fraksiyonları 1 mL seyreltme tamponu ile seyreltin (pH 7.4'te 3 mM imidazol, 1 mM EDTA).
- Seyreltilmiş numuneyi 100.000 x g'da 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı aspire edin ve fraksiyonları toplamak için 50 μL 1x numune tamponu ekleyin.
- Fraksiyonlardaki protein içeriğini batı şişkinliği ile analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İletilmemiş HEK293 hücrelerini yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonu ile kesirlendikten sonra, degradenin üstünden başlayarak 12 fraksiyon toplandı. Hasat edilen fraksiyonlar seyreltme tamponu ile 1:1 oranında seyreltildi ve ikinci bir santrifüjleme turuna tabi tutuldu. Numuneler daha sonra protein içeriklerini analiz etmek için batı şişkinliğine maruz kaldı. Şekil 1'degösterildiği gibi, geri dönüşüm endozom işaretçisi Rab11 kesir 720'detespit edilir. β-COP, COX IV, GAPDH, AEA1, Rab7 ve Lamp1 gibi diğer hücre altı belirteçleri de araştırıldı. Pozitif bir AÇA1 sinyali de kesir 7'de tespit edilir. GAPDH, COX IV ve Rab11'in hem fraksiyon 7 hem de PNS'deki bant yoğunlukları ImageLab yazılımı (Bio-Rad) ile ölçüldü. 7. kesri 7'deki işaretleyicilerin PNS'ye olan yoğunluk oranları hesaplandı ve SD ± bir çubuk grafikte ifade edildi.
Önceki çalışmalar, ARF6 ve ELMO1'in Rac1 aracılı neurit büyümesini teşvik etmek için FE65 ile etkileşime girdiğini göstermektedir21,22. ARF6 endosit geri dönüşümün bir düzenleyicisi olduğundan ve ELMO1 plazma membran hedeflemesi sonraki Rac1 aktivasyonu için kritik olduğundan, FE65'in ELMO1'in plazma zarı ile ticaretine aracılık etmek için ARF6 ve ELMO1'i birbirine bağladığı varsayılıyor. Bu nedenle, izole edilmiş geri dönüşüm endozomlarındaki ELMO1 seviyesini araştırmak için bu yöntem kullanıldı. HEK293 hücrelerine ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L veya ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 bulaştı. ARF6 Q67L ve FE65 overexpression ile ELMO1 dağıtımında herhangi bir değişiklik bulunamadı (Şekil 2A). Daha sonra, kesir 7'deki ELMO1 düzeyi (Rab11-pozitif) farklı transeksiyonlar arasında karşılaştırıldı. Kesirdeki ELMO1 miktarının ARF6 Q67L'nin eş transfeksiyonu sonrasında yükseltilmesi bulunmuştur. Hem ARF6 Q67L hem de FE65 birlikte ifade edildiğinde ELMO1 seviyesinde daha fazla artış gözlenir (Şekil 2B). Tersine, FE65'in nakavt edilmesi ARF6 aracılı ELMO1 zenginleştirmesini kesir 7'de azalttı (Şekil 2C).
Şekil 1: Geri dönüşüm endozomları, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonundan sonra fraksiyon 7'de bulunur. İletilmemiş HEK293 hücreleri fraksiyone edildi ve elde edilen fraksiyonlardaki protein içeriği batı şişkinliği ile analiz edildi. Rab11, 7. fraksiyonda anti-Rab11 antikoru (1:500) ile tespit edilir. β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10.000), AÇA1 (1:1000), Rab7 (1:500) ve Lamp1 (1:1000) dahil olmak üzere diğer hücre altı belirteçleri spesifik antikorları ile tespit edildi. Kesir 1 daha az yoğun üst fraksiyon iken, kesir 12 daha yoğun alt fraksiyondur. Çubuk grafik, GAPDH, COX IV ve Rab11'in ±7. Bu rakam Chan, W. W. R. ve ark.22'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: FE65 ekspresyonu, ELMO1'in ARF6 aracılı endositik geri dönüşümünü teşvik eder. (A) ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L veya ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 ile enfekte olan hücreler yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme kullanılarak kesirlenmiştir. Tüm fraksiyonlar ELMO1, ARF6 Q67L ve FE65'in dağılımlarını analiz etmek için batı blottingine maruz kaldı. Kesir 1 daha az yoğun üst fraksiyon iken, kesir 12 daha yoğun alt fraksiyondur. (B) Elmo1 ve ARF6 Q67L seviyelerini değerlendirmek için farklı transfeksiyonlardan Rab11-pozitif fraksiyon 7 Batı şişkinliği ile analiz edildi. Hücreler ARF6 Q67L ile birlikte transfekte olurken fraksiyon 7'deki ELMO1 miktarı yükseldi. ARF6 Q67L ve FE65'in birlikte ifade edilen kısmı ELMO1 miktarını daha da artırır. (C) Wildtype HEK293 ELMO1 veya ELMO1 + ARF6 Q67L ile, FE65 KO HEK293 ise ELMO1 + ARF6 Q67L ile transfekte edildi. Fraksiyon 7'deki ARF6 aracılı ELMO1 zenginleştirme FE65 KO hücrelerinde önemli ölçüde azaldı. (B-C) Geri dönüşüm endozom işaretleyicisi Rab11 (1:500) ve sitozol işaretleyici GAPDH (1:10.000) araştırıldı. ELMO1, FE65 ve ARF6 Q67L sırasıyla anti-ELMO1 B-7 (1:1000), anti-FE65 E-20 (1:1000) ve anti-myc 9B11 (1:5000) ile saptandı. Kesir 7'deki ELMO1'in göreli düzeyi, ELMO1'in kesir 7/toplam ELMO1'deki densitometrik oranı olarak ifade edildi. Çubuk grafik için veriler üç bağımsız deneyden elde edildi. İstatistiksel analiz için Bonferroni post hoc testi ile tek yönlü ANOVA kullanıldı. *s < 0.001. Sonuçlar SD22± kat değişimi anlamına gelir. Bu rakam Chan, W. W. R. ve ark.22'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki protokol, kültürlü hücrelerden geri dönüşüm endozomlarını ultracentrifugation ile izole etme prosedürlerini özetlemektedir. Bu yöntemin güvenilirliği en son yayınla gösterilmiştir 22 Geri dönüşüm endozomlarının Golgi aparatı ve mitokondri gibi diğer organellerdenbaşarıylaizole edildiğini kanıtlayan22. İyi bir ayrılık sonucu elde etmek için bazı kritik adımlara dikkat edilmesi gerekir. Sakkaroz çözeltileri hazırlanırken, çözeltilerin kırılma indekslerinin bir refraktometre ile doğrulandırılması önerilir. Oda sıcaklığındaki %62, %35 ve %25 sakkaroz çözeltilerinin kırılma indisi sırasıyla 1,44, 1,39 ve 1,37'dir. Ayrıca, hava kabarcıkları degradeden kaçınılmalıdır. Sütundaki kabarcıkların varlığı degradenin sürekliliğini bozabilir. Deterjanlar organellerin zarlarına zarar verdiği için homojenizasyon işleminden kaçınılmalıdır. Bu, membran bağlı organellerden proteinlerin salınmasına yol açar ve ciddi kirlenmeye neden olabilir. Ayrıca homojenizasyon sırasında protein bozulmasını önlemek için tüm homojenizasyon araçları kullanımdan önce önceden soğutulmalıdır. Degrade hazırlandıktan sonra en kısa sürede kullanılmalıdır. Hazırlanan degrade geçici olarak 4 °C'de (1-2 saat) depolanabilse de, uzun süreli depolama difüzyon nedeniyle yoğunluk gradyanını etkileyebilir.
Sakkaroz, kolay kullanılabilirliği nedeniyle yaygın olarak kullanılan bir gradyan ortamıdır. Aslında, Percoll ve Ficoll-40023,24dahil olmak üzere birçok alternatif vardır. Bu ortamlar sakkarozla karşılaştırıldığında farklı fiziksel özelliklere sahiptir. Örneğin, Percoll sakkarozdan daha düşük ozmolariteye ve viskoziteye sahiptir. Bunlar, daha düşük santrifüj kuvvetleri kullanarak parçacıkların hızlı bantlamasına izin verir. Ficoll-400, yüksek moleküler ağırlığı ve düşük diyalzable malzeme içeriği nedeniyle sakkarozdan daha düşük geçirgenliğe sahiptir. Bu nedenle, degrade ortamını değiştirmek daha yüksek bir endozom izolasyon verimliliği elde edebilir.
Yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme dışında, serbest akışlı elektroforez (FFE)25, floresan aktif organel sıralama (FAOS)26ve immünozolasyon27dahil olmak üzere hücre fraksiyonasyonu için başka yöntemler de kullanılabilir. FFE sıvı faz ayırma yöntemidir. Numune, akış yönüne dik bir elektrik alanının etkisi altında ayırma tamponu boyunca akar. Farklı organellerin sapma seviyeleri yüzey yüklerine göre değişir25. FAOS genellikle belirli organel etiketlemek için floresan bir etiket veya antikor kullanır ve ardından izolasyon için akış sitometrisi28,29. İmmünoisolasyon, hedeflenen organel yüzeyindeki spesifik antijenlerin tespit edilmesine ve daha sonra antikorlar tarafından çökeltmeye dayanır30.
Bu alternatiflerle karşılaştırıldığında, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjlemenin kendi avantajları vardır. Her şeyden önce, izole fraksiyonlarla Batı şişkinliği yapılarak ilgili proteinin bir dağılım profili elde edilebilir (Şekil 2A). Protein subsellüler lokalizasyonundaki herhangi bir değişiklik kolayca tespit edilebilir. Ayrıca, ultracentrifuge çoğu enstitüde standart bir araçtır ve santrifüjün çalıştırulduğunda teknik gereksinim düşüktür. Buna karşılık, FAOS ve FFE'nin izolasyon süreci için sırasıyla bir akış sitometresi ve belirli bir elektroforezi sistemi gereklidir. İmmünizolasyon için özel bir ekipman gerekmez. Bununla birlikte, esas olarak endozomları az sayıda hücreden izole etmek için kullanılır. Ultrasantrifüjasyonun hazırlık ölçeği immünoisolasyondan daha büyüktür. Ayrıca, immünoisolasyon için yüksek özgüllüğe sahip bir antikor gereklidir31. Ayrıca, endozomların bütünlüğünü sağlamak için yıkama adımlarında deterjan ve yüksek tuz içeren tampon kullanılamaz. Bu, yüksek arka plana yol açabilir ve izole organel31'insaflığını azaltabilir.
Yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonu organelleri yoğunluğa göre ayırdığı için, en önemli sınırlaması benzer yoğunluğa sahip organellere yönelik gücün çözülmesidir. Şekil 1'degösterildiği gibi, geri dönüşüm ve erken endozomların benzer fiziksel özellikleri nedeniyle hem Rab11 hem de AEA1 kesir 7'de tespit edilir. Geri dönüşüm endozomunda hedeflenen protein seviyesindeki değişiklikleri doğrulamak için daha fazla teste ihtiyaç vardır. Bir önceki çalışmada, ELMO1 ve Rab11 üzerinde eş-immünostaininghücrelerde 22. Diğer tahlillerin yapılmasına ek olarak, bu sorunun üstesinden gelmek için bazı önlemler de benimsenebilir. Sürekli yoğunluk gradyanı, küçük yoğunluk farklılıkları olan organelleri çözebilir32. Bununla birlikte, sürekli bir degradedeki verim, süreksiz bir degradeden önemli ölçüde daha düşüktür. Endozom yoğunluğunu lateks boncuklarla önceden tedavi ederek manipüle etmek mümkündür33. Boncuklar endositoz yoluyla hücreler tarafından içselleştirilir. Endozom içeren boncukların yoğunluğu önemli ölçüde azalır ve diğer organellerden ayrılabilir. Genellikle, başka bir izolasyon seviyesi eklemek, benzer yoğunluklara sahip organellerin izolasyonunu önemli ölçüde artırabilir. Örneğin, izole fraksiyondan immünoisolasyon gerçekleştirin34. Belirli bir antikor kullanılarak, geri dönüşüm endozomları kirleticilerden ayrılabilir. Floresan etiketli antikorlar ve problar, akış sitomemetri analizi ile birlikte hassas endozom izolasyonu için de kullanılabilir28. FFE, yüzey yüküne göre benzer yoğunluklara sahip organelleri ayırmak için de geçerlidir25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Araştırma Hibeleri Konseyi Hong Kong, CUHK doğrudan hibe programı, United College bağış fonu ve TUYF Hayır Kurumu'ndan fonlarla desteklendi. Bu çalışmadaki rakamlar, Ekim 2020'de FASEB Dergisi'nde yayınlanan "ARF6-Rac1 sinyal aracılı neurit büyümesi, nöronal adaptör FE65 tarafından ARF6 ve ELMO1'i düzenleyerek güçlenmiştir" adlı önceki yayınımızdan uyarlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).
