Summary
本論文は、ショ糖密度勾配超遠心化を用いて哺乳動物細胞からの子宮体をリサイクルする方法を提示することを目的とする。
Abstract
内皮の人身売買は、生物学的事象の広い範囲を調節する不可欠な細胞プロセスです。タンパク質は、原形質膜から内在化し、初期の子宮間体に輸送されます。インターロナイズされたタンパク質は、分解のためにリソソームに通過したり、細胞膜にリサイクルすることができます。エンドサイトーシスからの膜材料の除去のバランスをとるためには、堅牢なエンドサイト循環型の循環経路が必要です。ADP-リボシル化因子6(ARF6)を含む様々なタンパク質が経路を調節すると報告されている。密度勾配超遠心分離は、細胞分画の古典的な方法である。遠心分離後、オルガネラはイソピクセンの表面で沈み込む。分数は収集され、他のダウンストリーム・アプリケーションに使用されます。ここで説明するプロトコルは、密度勾配超遠心分離を用いて、トランスフェクションされた哺乳動物細胞からendosome含有分率をリサイクルして得るプロトコルである。単離された分画を、それらのタンパク質内容物を分析するための標準的なウエスタンブロッティングを行った。この方法を用いることで、Ras関連C3ボツリヌス毒素基質1(Rac1)グアニンヌクレオチド交換因子である巻込みおよび細胞運動性1(ELMO1)の細胞膜ターゲティングが、ARF6媒介性エンドサイトリサイクルを介してであることを同定した。
Introduction
内経性の人身売買は、様々な生物学的事象1、例えば、シグナル伝達受容体、イオンチャネル、および接着分子の輸送を含む必須の生理学的プロセスである。血漿膜に局在するタンパク質は、エンドサイトーシス2によって内在化される。その後、内部化されたタンパク質は初期の内期3によってソートされる。タンパク質の一部は分解のためにリソソームを標的としている。しかし、大量のタンパク質は、高速リサイクルと低速リサイクルプロセスによって細胞表面にリサイクルされます。高速リサイクルでは、タンパク質は初期の子宮体を離れ、原形質膜に直接戻ります。逆に、遅いリサイクルでは、タンパク質はまずエンドサイトリサイクルコンパートメントに分類され、次に形質膜に戻されます。種々のカーゴタンパク質は、例えば、クラトリン、レトロマー複合体、レトリバー複合体及びウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質、及びSCARホモローグ(WASH)複合体、4、5、6、7、8、9等の膜リサイクルプロセスに関与する。エンドサイトーシスとリサイクルイベントのバランスは、細胞の生存に不可欠であり、例えば、細胞接着、細胞移動、細胞極性、およびシグナル伝達などの様々な細胞事象10に寄与する。
ARF6は、小さなGTPaseで、内視鏡7、11、12の報告されたレギュレータです。関心のある研究グループは、内視鏡リサイクルにおけるARF6の重要性を図示しています13,14,15,16, 17.この研究は、ARF6媒介性神経突起成長とエンドサイトリサイクルとの関係を調査することを目的としている。前の報告は、ARF6の活性化がサイトカネシス1(DOCK180)複合体18のELMO1-ディディケーターに作用してRac1活性に上流であることを示唆している。しかし、ARF6がどのようにELMO1-DOCK180仲介Rac1シグナリングを引き起こすかは不明です。このような過程におけるARF6媒介型エントサイトリサイクルの役割を調査するために、密度勾配超遠心分離が採用された。それを用いることによって、細胞ライセート19から循環性のendosome含有分率が得られた。分画を、タンパク質含量分析用のウェスタンブロッティングを行った。免疫ブロットの結果は、脳に富んだアダプタータンパク質であるFE65の存在下で、活性ARF6が、エンドーソーム含有分率のリサイクルにおけるELMO1のレベルを実質的に増加させたことを明らかにした。以下のプロトコルには、(1)哺乳類細胞をトランスフェクトするための手順が含まれています。(2) サンプルと密度勾配列の準備(3)循環性のendosome含有分率を得る。
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Protocol
哺乳類細胞培養とトランスフェクション
- 100mm培養皿に2 x106 細胞をプレート。トランスフェクションごとに4つの料理を使用してください。
注: 必要なセルの数は、セルの行によって異なる場合があります。分離の手順に進む前に最適化が必要な場合があります。 - 翌日, メーカーの指示に従ってリポフェクタミンで細胞をトランスフェクト.
2. 細胞の収穫
- 培養後48時間の培養培地を廃棄する。
- 氷冷PBS(10 mMリン酸ナトリウム、2.68mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム)で細胞を2回洗浄します。
- 1 mLの氷冷PBS+(0.5xプロテアーゼ阻害剤カクテルと0.5xホスファターゼ阻害剤カクテルを加えたPBS)を各料理に加えます。
- 細胞スクレーパーで細胞を収集し、細胞懸濁液を15 mL遠心分離管に移します。
- 400xgで5分間スイングバケットローターを用いて遠心分離により細胞をペレット化した。
- 上澄み液を捨て、細胞ペレットを5mLの均質化バッファー(HB;250 mMスクロース、pH 7.4で3mMイミダゾール、0.03 mMシクロヘキシミド、1xプロテアーゼ阻害剤、1xホスファターゼカクテル阻害剤を添加した1 mM EDTA)で穏やかに再懸濁します。
- 10分間1,300xgで遠心分離して細胞を回収します。
- HBの1 mLで細胞ペレットを再懸濁する。
- 15-20ストロークのためのDounceホモジナイザーで細胞を均質化します。
注: 他のホモジナイゼーション方法(例えば、サンプルを注射器を通す)を使用することができます。均質化効率は、相コントラスト顕微鏡下でホモゲン酸を観察することによって明らかにすることができる。 - ホモゲン酸を2 mL遠心チューブに移します。
注:5xサンプルバッファーの12.5 μLで50μLのホモゲン酸を収穫し、トータルリセートとしてラベル付けしてください。 - 0.7 mLのHBをホモジネートに加えます。
- 希釈したホモゲネートを2,000 x g で4°Cで10分間回転させます。
注:ペレットには核と切れ目のない細胞が含まれています。 - 上清の1.5mLを収集し、ステップ2.12を一度繰り返します。
- 上清の1.4mLを収集し、ポスト核上清(PNS)としてラベル付けします。
3. 密度勾配カラムの準備
- 1.2 mLのPNSを超遠心チューブに移します。
- サンプルに62%スクロース溶液(2.351 Mショ糖、pH 7.4で3 mMイミダゾール)の1 mLを加え、穏やかなピペットでよく混ぜます。
注:結果として得られたソリューションは40.6%のスクロース溶液です。 - サンプルの上に3.3 mLの35%スクロース溶液(1.177 Mスクロース、pH 7.4で3 mMイミダゾール)を慎重に加えます。
- 25%スクロース溶液(0.806 Mショ糖、pH 7.4で3 mMイミダゾール)の2.2 mLを慎重に加え、35%スクロース溶液の上に添加します。
注:室温での62%、40.6%、35%、および25%のスクロース溶液の屈折率は、それぞれ1.44、1.40、1.39、1.37です。スクロース溶液の屈折率は、実験の精度と一貫性を確保するために、屈折計で確認することができます。 - 超遠心チューブをHBで満たします。
注:準備された密度勾配列を4°Cに一時的に保管してください。
4. 分画と循環性の分画の回収
- 4°Cで3時間210,000 x g でカラムを遠心分離します。
- 12 分の部分 (それぞれ 1 mL) を慎重に収集し、グラデーションの上から開始します。
注:リサイクル内生は、35%から25%のスクロースソリューションの間のインターフェースで見つけられる必要があります。回収された分率は液体窒素でスナップ凍結し、-80°Cで保存することができる。 - 希釈バッファーの 1 mL ですべての分画を希釈します (3 mM イミダゾール pH 7.4, 1 mM EDTA)。
- 4°Cで1時間100,000xgで希釈したサンプルを遠心分離する。
- 上清を吸引し、50 μLの1xサンプルバッファーを加え、分画を収穫します。
- 分画中のタンパク質内容物をウェスタンブロッティングで分析します。
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Representative Results
非トランスフェクトされたHEK293細胞を密度勾配超遠心分離により分画した後、勾配の上から12個の画分を採取した。収穫された分率を希釈し、希釈バッファーを1:1比で希釈し、第2回遠心分離を行った。その後、サンプルを、タンパク質の内容物を分析するためのウェスタンブロットを行った。 図1に示すように、循環型の気になるマーカーRab11が分画720で検出される。β-COP、COX IV、GAPDH、EEA1、Rab7、およびLamp1を含む他の細胞下マーカーもプローブされた。正のEEA1信号も画分7でも検出されます。分画7およびPNSの両方のGAPDH、COX IV、およびRab11のバンド強度をImageLabソフトウェア(バイオ・ラッド)で測定した。分数7からPNSのマーカーの強度比を計算し、SD±棒グラフで表した。
これまでの研究では、ARF6とELMO1がFE65と相互作用して、Rac1媒介性神経突起の成長を促進することを示唆している。ARF6は、エンドサイトリサイクルの調節因子であり、ELMO1原形質膜ターゲティングは、その後のRac1活性化に不可欠であるため、FE65はARF6とELMO1を接続してELMO1の人身売買を原形質膜に媒介すると仮定しています。そこで、この方法は、単離リサイクル用エンドーソームにおけるELMO1レベルを調査するために用いた。HEK293細胞は、ELMO1、ELMO1+ARF6 Q67L、またはELMO1+ARF6 Q67L+FE65のいずれかでトランスフェクションした。ARF6 Q67L および FE65 過剰発現を伴う ELMO1 分布に変更は見つかりませんでした (図 2A)。次に、分画7におけるELMO1レベル(Rab11陽性)を、異なるトランスフェクション間で比較した。分画中のELMO1の量は、ARF6 Q67Lの共トランスフェクション後に上昇することが分かります。ARF6 Q67LとFE65の両方が共発現すると、ELMO1レベルのさらなる上昇が観察される(図2B)。逆に、FE65のノックアウトは、ARF6媒介ELMO1の分数7(図2C)のエンリッチメントを減少させた。
図1:循環性の内生体は、密度勾配超遠心化後の分数7に含まれる。 未導入HEK293細胞を分画し、得られた画分中のタンパク質内容物をウェスタンブロッティングで分析した。Rab11は、抗Rab11抗体を用いて画分7で検出される(1:500)。その他の細胞下マーカーは、β-COP(1:1000)、COX IV(1:1000)、GAPDH(1:10,000)、EEA1(1:1000)、Rab7(1:500)、Lamp1(1:1000)を含む特定の抗体で検出された。分数 1 は、より密度の低い上端分率、分数 12 は、より密度の高い底分です。棒グラフは、分画7とSDのPNSに対するギャップス、COX IV、およびRab11の比率を示±。この図はチャン、W.W.R.ら22から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:FE65の発現は、ELMO1のARF6媒介型エントサイトリサイクルを促進する(A)ELMO1、ELMO1+ARF6 Q67L、またはELMO1+ARF6 Q67L+FE65のいずれかにトランスフェクトされた細胞を、密度勾配超遠心分離を用いて分画した。全ての画分は、ELMO1、ARF6 Q67L、およびFE65の分布を分析するためのウェスタンブロッティングを行った。分数 1 は、より密度の低い上端分率、分数 12 は、より密度の高い底分です。(B)異なるトランスフェクションからのRab11陽性画分7をウェスタンブロッティングで分析し、ELMO1およびARF6 Q67Lのレベルを評価した。分画7におけるELMO1の量は、細胞をARF6 Q67Lと共トランスフェクションした際に上昇した。ARF6 Q67LとFE65の共発現は、画分中のELMO1の量をさらに増加させる。(C)野生型 HEK293 は ELMO1 または ELMO1 + ARF6 Q67L でトランスフェクションしたのに対し、FE65 KO HEK293 は ELMO1 + ARF6 Q67L にトランスフェクションした。ARF6媒介ELMO1は、FE65 KO細胞において画分7において有意に減少した。(B-C)循環型マーカーRab11(1:500)およびサイトソルマーカーGAPDH(1:10,000)をリサイクルし、プローブした。エルモ1、FE65、およびARF6 Q67Lは、それぞれ抗ELMO1 B-7(1:1000)、抗FE65 E-20(1:1000)、および抗myc 9B11(1:5000)で検出されました。分数7におけるELMO1の相対レベルを、分数7/総ELMO1におけるELMO1の密度比として表した。棒グラフのデータは、3つの独立した実験から得られた。一方のANOVAとボンフェローニポストホックテストを用いて統計分析を行った。*p < 0.001.結果はSD22±平均折り畳み変化である。この図はチャン、W.W.R.ら22から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
上記のプロトコルは、超遠心分離によって培養細胞から培養された細胞から循環性の内生体を単離するための手順を概説する。この方法の信頼性は最新の刊行22によって実証されており、リサイクル用のエンドーソームがゴルジ装置やミトコンドリアなどの他のオルガネラ(図1)から正常に分離されていることを証明している。いくつかの重要なステップは、良好な分離結果を得るために注意する必要があります。スクロース溶液を調製する間、屈折計で溶液の屈折率を検証することが推奨されます。室温での62%、35%、および25%のスクロース溶液の屈折率は、それぞれ1.44、1.39、および1.37である。また、気泡は勾配から避けるべきです。列に気泡が存在すると、グラデーションの連続性が崩る可能性があります。洗剤はオルガネラの膜に損傷を与えるので、均質化プロセスでは避けるべきです。これは、膜結合型小器官からのタンパク質の放出につながり、重度の汚染をもたらす可能性があります。また、均質化中のタンパク質分解を避けるために、使用前にすべての均質化ツールを事前に冷却する必要があります。グラデーションを準備したら、できるだけ早く使用する必要があります。調製した勾配は4°C(1-2時間)で一時的に保存できますが、長期保存は拡散による密度勾配を妨げる可能性があります。
スクロースは、その容易な可用性のために広く使用されている勾配媒体です。実際には、他の多くの選択肢があります, パーコールとFicoll-40023を含む,24.これらの培地は、スクロースと比較すると物理的特性が異なります。例えば、パーコールはスクロースよりもオスモル度と粘度が低い。これらは、より低い遠心力を使用して粒子の迅速なバンディングを可能にする。Ficoll-400は、その高分子量と透析可能な材料の含有量が低いため、スクロースよりも膜に対する透過性が低い。したがって、勾配媒体を変更すると、より高い内分離効率を達成できる。
密度勾配超遠心分離とは別に、自由流電気泳動(FFE)25、蛍光活性化小器官選別(FAOS)26、および免疫分離27を含む細胞分画に使用できる他の方法。FFEは液相分離法である。サンプルは、流れ方向に垂直な電界の影響を受けて分離バッファーを流れます。異なるオルガネラのたわみレベルは、表面電荷25に基づいて変化する。FAOSは通常、特定のオルガネラを標識するために蛍光タグまたは抗体を使用し、その後、分離28、29のフローサイトメトリーを続ける。免疫分離は、抗体30による標的オルガネラの表面及びその後の沈殿物に特異的な抗原を検出することに依存する。
これらの代替と比較すると、密度勾配超遠心化には独自の利点があります。まず、関心のあるタンパク質の分布プロファイルは、単離された画分でウェスタンブロットを行うことによって得ることができる(図2A)。タンパク質の細胞内局在の変化は、容易に検出することができた。また、超遠心分離機は、ほとんどの機関で標準的な機器であり、遠心分離機を操作するための技術的な要件は低いです。対照的に、フローサイトメーターと特異的な電気泳動システムは、それぞれFAOSとFFEの分離プロセスに必要とされます。免疫分離に必要な特定の装置はありません。しかし、それは主に少数の細胞から内性体を単離するために使用される。超遠心分離の調製スケールは、免疫分離のそれよりも大きい。また、免疫分離31には高い特異性を有する抗体が必要である。さらに、洗浄剤および高塩含有緩衝液は、内食体の完全性を確保するために洗浄工程で使用することができない。これは高い背景につながり、単離されたオルガネラ31の純度を低下させる可能性がある。
密度勾配超遠心分離は密度に基づいてオルガネラを分離するので、その最も重要な制限は、同じ密度のオルガネラに向かって力を解決することです。 図1に示すように、Rab11とEEA1の両方が、リサイクルと初期のエンドーソームの同様の物理的性質のために、分画7で検出されます。リサイクル用のendosomeにおける標的タンパク質のレベルの変化を確認するために、さらなるアッセイが必要である。前の研究では、ELMO1およびRab11に対する共免疫染色を細胞22で行った。他のアッセイを行うほか、この問題を克服するためのいくつかの対策を採用することができる。連続的な密度勾配は、小さな密度差32を持つオルガネラを解決することができます。ただし、連続グラデーションの収率は、不連続勾配の利回りよりも大幅に低くなります。ラテックスビーズ33で細胞を前処理することにより、子宮内因の密度を操作することが可能である。ビーズはエンドサイトーシスを介して細胞によって内在化される。エンドーソームを含むビーズの密度は著しく減少し、他のオルガネラから分離することができる。通常、別のレベルの分離を加えることは、同様の密度を持つオルガネラの分離を有意に改善する可能性がある。例えば、単離された分画34から免疫分離を行う。特定の抗体を使用することにより、抗菌剤を汚染物から分離することができる。蛍光標識抗体およびプローブは、フローサイトメトリー分析と組み合わせて、精密な内シド分離28にも使用できる。FFEは、表面電荷25に基づいて、類似の密度を有するオルガネラを分離するためにも適用可能である。
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Disclosures
著者らは、この記事の内容と利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、研究助成金評議会香港、CUHK直接助成金制度、ユナイテッド・カレッジ・エンダウメント・ファンド、TUYF慈善信託からの資金によって支えられました。この研究の数字は、2020年10月にFASEBジャーナルに掲載された「ARF6-Rac1シグナル伝達性神経突起伸長は、ARF6とELMO1のオーケストレーションを通じてニューロンアダプタFE65によって増強される」と述べた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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