Summary
Dit artikel heeft tot doel een protocol te presenteren voor het bereiden van recycling-endosomen uit zoogdiercellen met behulp van sucrose-dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie.
Abstract
Endosomale handel is een essentieel cellulair proces dat een breed scala aan biologische gebeurtenissen reguleert. Eiwitten worden geïnternaliseerd uit het plasmamembraan en vervolgens getransporteerd naar de vroege endosomen. De geïnternaliseerde eiwitten kunnen worden overgebracht naar het lysosoom voor afbraak of worden gerecycled naar het plasmamembraan. Een robuuste endocytische recyclingroute is nodig om de verwijdering van membraanmaterialen van endocytose in evenwicht te brengen. Van verschillende eiwitten wordt gemeld dat ze de route reguleren, waaronder ADP-ribosylatiefactor 6 (ARF6). Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie is een klassieke methode voor celfractionering. Na de centrifugatie worden organellen aan hun isopreienoppervlak gesedimenteerd. De fracties worden verzameld en gebruikt voor andere downstream toepassingen. Hier wordt een protocol beschreven om een recycling endosoombevattende fractie te verkrijgen uit getransfecteerde zoogdiercellen met behulp van dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. De geïsoleerde fracties werden onderworpen aan standaard Western blotting voor het analyseren van hun eiwitgehalte. Door deze methode te gebruiken, identificeerden we dat de plasmamembraantargeting van engulfment en celmotiliteit 1 (ELMO1), een Ras-gerelateerd C3 botulinetoxinesubstraat 1 (Rac1) guanine nucleotide-uitwisselingsfactor, door ARF6-gemedieerde endocytische recycling is.
Introduction
Endosomale handel is een essentieel fysiologisch proces dat verschillende biologische gebeurtenissenimpliceert 1, bijvoorbeeld het transport van signaalreceptoren, ionkanalen en adhesiemoleculen. Eiwitten gelokaliseerd bij het plasmamembraan worden geïnternaliseerd door endocytose2. De geïnternaliseerde eiwitten worden vervolgens gesorteerd op het vroege endosoom3. Sommige eiwitten zijn gericht op lysosomen voor afbraak4. Een aanzienlijke hoeveelheid eiwitten wordt echter teruggevoerd naar het celoppervlak door snelle recycling en langzame recyclingprocessen. Bij snelle recycling verlaten eiwitten de vroege endosomen en keren ze direct terug naar het plasmamembraan. Omgekeerd worden eiwitten bij langzame recycling eerst gesorteerd naar het endocytische recyclingcompartiment en vervolgens teruggevoerd naar het plasmamembraan. Verschillende ladingeiwitten, bijvoorbeeld clathrin, retromeercomplex, retrievercomplex en Wiskott-Aldrich-syndroomeiwit en SCAR Homologue (WASH) -complex, nemen deel aan dergelijke membraanrecyclingprocessen4,5,6,7,8,9. De balans van de endocytose en recyclinggebeurtenis is cruciaal voor celoverleving en draagt bij aan verschillende cellulaire gebeurtenissen10, bijvoorbeeld celadhesie, celmigratie, celpolariteit en signaaltransductie.
ARF6, een kleine GTPase, is een gerapporteerde regulator van endocytische handel7,11,12. Van belang, verschillende onderzoeksgroepen hebben het belang van ARF6 in endocytische recycling13,14,15,16,17geïllustreerd. De studie heeft tot doel de relatie tussen ARF6-gemedieerde neurietuitgroei en endocytische recycling te onderzoeken. Het vorige rapport suggereert dat de activering van ARF6 stroomopwaarts is naar Rac1-activiteit door in te werken op ELMO1-dedicator van cytokinese 1 (DOCK180) complex18. Hoe ARF6 ELMO1-DOCK180 gemedieerde Rac1-signalering activeert, blijft echter onduidelijk. Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie werd gebruikt om de rol van ARF6-gemedieerde endocytische recycling in een dergelijk proces te onderzoeken. Door dat te gebruiken, werd de recycling endosoomhoudende fractie verkregen uit cellysaten19. De fractie werd onderworpen aan Western blotting voor analyse van het eiwitgehalte. De immunoblotresultaten toonden aan dat onder de aanwezigheid van FE65, een met de hersenen verrijkt adaptoreiwit, actieve ARF6 het niveau van ELMO1 in de recycling endosoombevattende fractie aanzienlijk verhoogde. Het volgende protocol omvat de procedures voor (1) transfectie van zoogdiercellen; (2) het voorbereiden van de monsters en de kolommen met dichtheidsgradiënt; en (3) het verkrijgen van de recyclingdosome-bevattende fractie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek en transfectie van zoogdieren
- Plaat 2 x 106 cellen in een 100 mm kweekschaal. Gebruik vier gerechten voor elke transfectie.
OPMERKING: Het aantal benodigde cellen kan variëren voor verschillende cellijnen. Optimalisatie kan nodig zijn voordat u doorgaat naar de isolatiestap. - De volgende dag transfecteer de cellen met Lipofectamine volgens de instructies van de fabrikant.
2. Celoogst
- Gooi het kweekmedium 48 uur na de transfectie weg.
- Was de cellen tweemaal met ijskoude PBS (10 mM natriumfosfaten, 2,68 mM kaliumchloride, 140 mM natriumchloride).
- Voeg 1 ml ijskoude PBS+ (PBS aangevuld met 0,5x proteaseremmercocktail en 0,5x fosfataseremmercocktail) toe aan elk gerecht.
- Verzamel de cellen met een celschraper en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 15 ml.
- Pellet de cellen door centrifugeren met behulp van een zwenkbakrotor op 400 x g gedurende 5 minuten.
- Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel voorzichtig in 5 ml homogenisatiebuffer (HB; 250 mM sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4, 1 mM EDTA aangevuld met 0,03 mM cycloheximide, 1x proteaseremmer cocktail en 1x fosfataseremmer cocktail).
- Verzamel de cellen door centrifugering bij 1.300 x g gedurende 10 minuten.
- Resuspend de celkorrel in 1 ml HB.
- Homogeniseer de cellen met een Dounce homogenisator voor 15-20 slagen.
OPMERKING: Andere homogenisatiemethoden, bijvoorbeeld het passeren van het monster door een spuit, kunnen worden gebruikt. De homogenisatie-efficiëntie kon worden onthuld door het homogenaat te observeren onder een fasecontrastmicroscoop. - Breng het homogenaat over in een centrifugeerbuis van 2 ml.
OPMERKING: Oogst 50 μL homogenaat met 12,5 μL 5x monsterbuffer en label het als totaal lysaat. - Voeg 0,7 ml HB toe aan het homogenaat.
- Spin het verdunde homogenaat gedurende 10 minuten bij 4 °C op 2.000 x g.
OPMERKING: De pellet bevat kernen en ongebroken cellen. - Verzamel 1,5 ml van het supernatant en herhaal stap 2.12 eenmaal.
- Verzamel 1,4 ml van het supernatant en label het als postnucleair supernatant (PNS).
3. Voorbereiding van de dichtheidsgradiëntkolom
- Breng 1,2 ml PNS over in een ultracentrifugebuis.
- Voeg 1 ml 62% sucrose-oplossing (2,351 M sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4) toe aan het monster en meng goed door zachtjes te pipetteren.
OPMERKING: De resulterende oplossing is een 40,6% sucrose-oplossing. - Voeg 3,3 ml 35% sucrose-oplossing (1,177 M sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4) voorzichtig toe aan het monster.
- Voeg voorzichtig 2,2 ml 25% sucrose-oplossing (0,806 M sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4) toe aan de 35% sucrose-oplossing.
OPMERKING: De brekingsindex van de sucrose-oplossingen van 62%, 40,6%, 35% en 25% bij kamertemperatuur is respectievelijk 1,44, 1,40, 1,39 en 1,37. De brekingsindexen van de sacharoseoplossingen kunnen met een refractometer worden gecontroleerd om de precisie en consistentie van het experiment te waarborgen. - Vul de ultracentrifugatiebuis met HB.
OPMERKING: Bewaar de voorbereide kolom met dichtheidsgradiënt tijdelijk bij 4 °C.
4. Fractionering en terugwinning van recycling endosoomhoudende fractie
- Centrifugeer de kolom bij 210.000 x g gedurende 3 uur bij 4 °C.
- Verzamel 12 fracties (elk 1 ml) zorgvuldig, te beginnen vanaf de bovenkant van de helling.
OPMERKING: De recycling-endosomen moeten worden gevonden op het grensvlak tussen 35% en 25% sucrose-oplossingen. De verzamelde fracties kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80 °C. - Verdun alle fracties met 1 ml verdunningsbuffer (3 mM imidazool bij pH 7,4, 1 mM EDTA).
- Centrifugeer het verdunde monster bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Zuig het supernatant op en voeg 50 μL 1x monsterbuffer toe om de fracties te oogsten.
- Analyseer het eiwitgehalte in de fracties door western blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na fractionering van de niet-getransfecteerde HEK293-cellen door middel van ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt, werden 12 fracties verzameld vanaf de bovenkant van de gradiënt. De geoogste fracties werden verdund met de verdunningsbuffer in een verhouding van 1:1 en onderworpen aan een tweede ronde van centrifugatie. De monsters werden vervolgens onderworpen aan western blotting voor het analyseren van hun eiwitgehalte. Zoals weergegeven in figuur 1,wordt de recycling endosoommarker Rab11 gedetecteerd in fractie 720. Andere subcellulaire markers, waaronder β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 en Lamp1, werden ook onderzocht. Een positief EEA1-signaal wordt ook gedetecteerd in fractie 7. De bandintensiteiten van GAPDH, COX IV en Rab11 in zowel fractie 7 als PNS werden gemeten met ImageLab-software (Bio-Rad). De intensiteitsverhoudingen van de markers in fractie 7 tot PNS werden berekend en uitgedrukt in een staafdiagram ± SD.
De vorige studies suggereren dat ARF6 en ELMO1 interageren met FE65 om Rac1-gemedieerde neurietuitgroei21,22te bevorderen. Aangezien ARF6 een regulator is van endocytische recycling en ELMO1 plasmamembraan targeting van cruciaal belang is voor de daaropvolgende Rac1-activering, wordt verondersteld dat FE65 ARF6 en ELMO1 verbindt om de handel van ELMO1 naar het plasmamembraan te bemiddelen. Daarom werd deze methode gebruikt om het ELMO1-niveau in de geïsoleerde recycling-endosomen te onderzoeken. HEK293-cellen werden getransfecteerd met ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L of ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. Er zijn geen wijzigingen gevonden in de ELMO1-distributie met ARF6 Q67L- en FE65-overexpressie(figuur 2A). Vervolgens werd het ELMO1-niveau in fractie 7 (Rab11-positief) vergeleken tussen verschillende transfecties. De hoeveelheid ELMO1 in de fractie blijkt te stijgen na de co-transfectie van ARF6 Q67L. Verdere toename van het ELMO1-niveau wordt waargenomen wanneer zowel ARF6 Q67L als FE65 samen worden uitgedrukt(figuur 2B). Omgekeerd verminderde knock-out van FE65 de ARF6-gemedieerde ELMO1-verrijking in fractie 7 (figuur 2C).
Figuur 1: Recycling-endosomen worden gevonden in fractie 7 na dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Niet-getransfecteerde HEK293-cellen werden gefractioneerd en het eiwitgehalte in de verkregen fracties werd geanalyseerd met western blotting. Rab11 wordt gedetecteerd in fractie 7 met een anti-Rab11-antilichaam (1:500). Andere subcellulaire markers werden gedetecteerd met hun specifieke antilichamen, waaronder β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10.000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500) en Lamp1 (1:1000). Fractie 1 is de minder dichte bovenste fractie, terwijl fractie 12 de dichtere onderste fractie is. Het staafdiagram toont de verhouding van GAPDH, COX IV en Rab11 in fractie 7 tot PNS ± SD. Deze figuur is aangepast van Chan, W. W. R. et al.22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Expressie van FE65 bevordert ARF6-gemedieerde endocytische recycling van ELMO1. (A) De cellen getransfecteerd met ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, of ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 werden gefractioneerd met behulp van dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Alle fracties werden onderworpen aan western blotting voor het analyseren van de verdelingen van ELMO1, ARF6 Q67L en FE65. Fractie 1 is de minder dichte bovenste fractie, terwijl fractie 12 de dichtere onderste fractie is. BDe Rab11-positieve fractie 7 van verschillende transfecties werd geanalyseerd met Western blotting om de niveaus van ELMO1 en ARF6 Q67L te evalueren. De hoeveelheid ELMO1 in fractie 7 was verhoogd wanneer de cellen co-transfecteerden met ARF6 Q67L. Co-expressie van ARF6 Q67L en FE65 verhoogt de hoeveelheid ELMO1 in de fractie verder. (C) Wildtype HEK293 werd getransfecteerd met ELMO1 of ELMO1 + ARF6 Q67L, terwijl FE65 KO HEK293 werd getransfecteerd met ELMO1 + ARF6 Q67L. De ARF6-gemedieerde ELMO1-verrijking in fractie 7 nam significant af in FE65 KO-cellen. (B-C) Recycling endosome marker Rab11 (1:500) en cytosol marker GAPDH (1:10.000) werden onderzocht. ELMO1, FE65 en ARF6 Q67L werden gedetecteerd met respectievelijk anti-ELMO1 B-7 (1:1000), anti-FE65 E-20 (1:1000) en anti-myc 9B11 (1:5000). Het relatieve niveau van ELMO1 in fractie 7 werd uitgedrukt als de densitometrische verhouding van de ELMO1 in fractie 7/totaal ELMO1. Gegevens voor het staafdiagram werden verkregen uit drie onafhankelijke experimenten. Eenrichtings-ANOVA met Bonferroni post hoc test werd gebruikt voor statistische analyse. *p < 0,001. Resultaten zijn gemiddelde vouwverandering ± SD22. Deze figuur is aangepast van Chan, W. W. R. et al.22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bovenstaande protocol schetst de procedures voor het isoleren van recycling-endosomen uit gekweekte cellen door ultracentrifugatie. De betrouwbaarheid van deze methode is aangetoond door de laatste publicatie22, waaruit blijkt dat recycling-endosomen met succes worden geïsoleerd uit andere organellen (figuur 1), zoals het Golgi-apparaat en mitochondriën. Er moet aandacht worden besteed aan enkele kritische stappen voor het verkrijgen van een goed scheidingsresultaat. Bij de bereiding van de sacharoseoplossingen wordt aanbevolen om de brekingsindexen van de oplossingen te valideren met een refractometer. De brekingsindex van de 62%, 35% en 25% sucrose-oplossingen bij kamertemperatuur zijn respectievelijk 1,44, 1,39 en 1,37. Ook moeten luchtbellen uit de helling worden vermeden. De aanwezigheid van bellen in de kolom kan de continuïteit van het verloop verstoren. Detergentia moeten worden vermeden in het homogenisatieproces, omdat ze het membraan van organellen beschadigen. Dit leidt tot het vrijkomen van eiwitten uit membraangebonden organellen en kan leiden tot ernstige besmetting. Ook moeten alle homogeniseergereedschappen voor gebruik worden voorgekoeld om eiwitafbraak tijdens homogenisatie te voorkomen. Zodra de gradiënt is voorbereid, moet deze zo snel mogelijk worden gebruikt. Hoewel de bereide gradiënt tijdelijk bij 4 °C (1-2 uur) kan worden opgeslagen, kan langdurige opslag de dichtheidsgradiënt verstoren als gevolg van diffusie.
Sucrose is een veel gebruikt gradiëntmedium vanwege de gemakkelijke beschikbaarheid. In feite zijn er veel andere alternatieven, waaronder Percoll en Ficoll-40023,24. Deze media hebben verschillende fysische eigenschappen in vergelijking met sucrose. Percoll heeft bijvoorbeeld een lagere osmolariteit en viscositeit dan sucrose. Deze maken een snelle banding van deeltjes mogelijk met behulp van lagere centrifugale krachten. Ficoll-400 heeft een lagere permeabiliteit ten opzichte van membranen dan sucrose vanwege het hoge molecuulgewicht en het lage gehalte aan dialyseerbaar materiaal. Daarom kan het veranderen van het gradiëntmedium een hogere endosoomisolatie-efficiëntie bereiken.
Afgezien van dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, kunnen andere methoden worden gebruikt voor celfractionering, waaronder vrije-stroom elektroforese (FFE)25,fluorescentie-geactiveerde organelsortering (FAOS)26en immuno-isolatatie27. FFE is een vloeibare fase scheidingsmethode. Het monster stroomt door de scheidingsbuffer onder invloed van een elektrisch veld loodrecht op de stroomrichting. Afbuigingsniveaus van verschillende organellen variëren op basis van hun oppervlakteladingen25. FAOS gebruikt meestal een fluorescerende tag of antilichaam om specifiek organel te labelen en vervolgens gevolgd door flowcytometrie voor de isolatie28,29. Immuno-isolatatie is gebaseerd op het detecteren van specifieke antigenen op het oppervlak van het beoogde organel en de daaropvolgende precipitatie door antilichamen30.
In vergelijking met deze alternatieven heeft dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie zijn eigen voordelen. Allereerst kan een distributieprofiel van het geïnteresseerde eiwit worden verkregen door Western blotting uit te voeren met de geïsoleerde fracties (Figuur 2A). Eventuele veranderingen in eiwitsubcellulaire lokalisatie kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd. Ultracentrifuge is ook een standaardinstrument in de meeste instituten en de technische vereisten voor het bedienen van de centrifuge zijn laag. Daarentegen zijn een flowcytometer en een specifiek elektroforesesysteem vereist voor het isolatieproces van respectievelijk FAOS en FFE. Er is geen specifieke apparatuur nodig voor immuno-isolatatie. Het wordt echter voornamelijk gebruikt voor het isoleren van endosomen uit een klein aantal cellen. De bereidingsschaal van ultracentrifugatie is groter dan die van immuno-isolatatie. Bovendien is een antilichaam met hoge specificiteit noodzakelijk voor immuno-isolatatie31. Bovendien kunnen wasmiddel- en zouthoudende buffers niet worden gebruikt in de wasstappen om de integriteit van de endosomen te waarborgen. Dit kan leiden tot een hoge achtergrond en de zuiverheid van het geïsoleerde organel verminderen31.
Aangezien dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie organellen scheidt op basis van dichtheid, is de belangrijkste beperking die van het oplossend vermogen naar organellen met vergelijkbare dichtheid. Zoals weergegeven in figuur 1,worden zowel Rab11 als EEA1 gedetecteerd in fractie 7 vanwege de vergelijkbare fysische eigenschappen van recycling en vroege endosomen. Verdere testen zijn nodig om de veranderingen in het niveau van het beoogde eiwit in het recycling-endosoom te bevestigen. In de vorige studie werd co-immunostaining op ELMO1 en Rab11 uitgevoerd in cellen22. Naast het uitvoeren van andere testen, kunnen enkele maatregelen worden genomen om dit probleem op te lossen. Een continue dichtheidsgradiënt kan organellen met kleine dichtheidsverschillen oplossen32. De opbrengst in een continue gradiënt is echter aanzienlijk lager dan die van een discontinue gradiënt. Het is mogelijk om de dichtheid van het endosoom te manipuleren door de cellen voor te behandelen met latexparels33. De kralen worden geïnternaliseerd door de cellen via endocytose. De dichtheid van de kralen die endosomen bevatten, is aanzienlijk verminderd en kan worden gescheiden van andere organellen. Meestal kan het toevoegen van een ander niveau van isolatie de isolatie van organellen met vergelijkbare dichtheden aanzienlijk verbeteren. Voer bijvoorbeeld immuno-isolatie uit van de geïsoleerde fractie34. Door gebruik te maken van een specifiek antilichaam kunnen recycling endosomen van de verontreinigingen worden gescheiden. Fluorescerend gelabelde antilichamen en sondes, gecombineerd met flowcytometrie-analyse, kunnen ook worden gebruikt voor nauwkeurige endosoomisolatie28. FFE is ook van toepassing voor het scheiden van organellen met vergelijkbare dichtheden op basis van hun oppervlaktelading25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben met de inhoud van dit artikel.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Research Grants Council Hong Kong, CUHK direct grant scheme, United College endowment fund en de TUYF Charitable Trust. De cijfers in dit werk zijn aangepast van onze vorige publicatie, "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" gepubliceerd in het FASEB Journal in oktober 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).
