Summary
Dette dokumentet tar sikte på å presentere en protokoll for å forberede resirkulering endosomer fra pattedyrceller ved hjelp av sukrose tetthet gradient ultracentrifugation.
Abstract
Endosomal menneskehandel er en viktig cellulær prosess som regulerer et bredt spekter av biologiske hendelser. Proteiner internaliseres fra plasmamembranen og transporteres deretter til de tidlige endosomene. De internaliserte proteinene kan overføres til lysosomet for nedbrytning eller resirkuleres tilbake til plasmamembranen. En robust endokytisk resirkuleringsvei er nødvendig for å balansere fjerning av membranmaterialer fra endokytose. Ulike proteiner rapporteres å regulere banen, inkludert ADP-ribosyleringsfaktor 6 (ARF6). Tetthet gradient ultracentrifugation er en klassisk metode for cellefraksjonering. Etter sentrifugeringen sedimenteres organeller på deres isopykliske overflate. Brøkene samles inn og brukes til andre nedstrømsapplikasjoner. Beskrevet her er en protokoll for å få en resirkulering endosomholdig brøkdel fra transfekterte pattedyrceller ved hjelp av tetthet gradient ultracentrifugation. De isolerte fraksjonene ble utsatt for standard vestlig blotting for å analysere proteininnholdet. Ved å bruke denne metoden identifiserte vi at plasmamembranen rettet mot engulfment og cellemotilitet 1 (ELMO1), et Ras-relatert C3 botulinumtoksinsubstrat 1 (Rac1) guanin nukleotidutvekslingsfaktor, er gjennom ARF6-mediert endokytisk resirkulering.
Introduction
Endosomal trafficking er en viktig fysiologisk prosess som impliserer ulike biologiske hendelser1, for eksempel transport av signalreseptorer, ionkanaler og vedheftsmolekyler. Proteiner lokalisert ved plasmamembranen internaliseres ved endokytose2. De internaliserte proteinene sorteres deretter etter tidlig endosom3. Noen av proteinene er rettet mot lysosomer for nedbrytning4. Imidlertid resirkuleres en betydelig mengde proteiner tilbake til celleoverflaten ved rask resirkulering og langsomme resirkuleringsprosesser. Ved rask resirkulering forlater proteiner de tidlige endosomene og går direkte tilbake til plasmamembranen. Omvendt, i langsom resirkulering, blir proteiner først sortert til det endokytiske resirkuleringsrommet og deretter transportert tilbake til plasmamembranen. Ulike lastproteiner, for eksempel klarin, retromerkompleks, retrieverkompleks og Wiskott-Aldrich syndromprotein og SCAR Homologue (WASH) -kompleks, deltar i slike membrangjenvinningsprosesser4,5,6,7,8,9. Balansen mellom endokytose og resirkulering er avgjørende for celleoverlevelse og bidrar til ulike cellulære hendelser10, for eksempel celleadhesjon, cellemigrasjon, cellepolaritet og signaltransduksjon.
ARF6, en liten GTPase, er en rapportert regulator for endokytisk menneskehandel7,11,12. Av interesse har ulike forskningsgrupper illustrert betydningen av ARF6 i endokytisk resirkulering13,14,15,16,17. Studien tar sikte på å undersøke forholdet mellom ARF6-mediert nevrittutvekst og endokytisk resirkulering. Den forrige rapporten antyder at aktiveringen av ARF6 er oppstrøms til Rac1-aktivitet gjennom å handle på ELMO1-dedikator av cytokinesis 1 (DOCK180) kompleks18. Men hvordan ARF6 utløser ELMO1-DOCK180 mediert Rac1-signalering er fortsatt uklart. Tetthet gradient ultracentrifugation ble brukt til å undersøke rollen som ARF6-mediert endokytisk resirkulering i en slik prosess. Ved å bruke det ble resirkuleringen endosomholdig brøkdel hentet fra cellelysene19. Fraksjonen ble utsatt for vestlig blotting for proteininnholdsanalyse. Immunoblotresultatene viste at under tilstedeværelsen av FE65, et hjerneberiket adapterprotein, økte aktiv ARF6 betydelig nivået av ELMO1 i resirkuleringsbelagt brøkdel. Følgende protokoll inkluderer prosedyrene for (1) transfekterende pattedyrceller; (2) forberede prøver og tetthet gradient kolonner; og (3) få resirkulering endosomeholdig brøkdel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pattedyr cellekultur og transfeksjon
- Plate 2 x 106 celler i en 100 mm kulturrett. Bruk fire retter for hver transfeksjon.
MERK: Antall celler som kreves, kan variere for forskjellige cellelinjer. Optimalisering kan være nødvendig før du går videre til isolasjonstrinnet. - Neste dag, transfekt cellene med Lipofectamine i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Cellehøst
- Kast kulturmediet 48 timer etter transfeksjon.
- Vask cellene med iskald PBS (10 mM natriumfosfater, 2,68 mM kaliumklorid, 140 mM natriumklorid) to ganger.
- Tilsett 1 ml iskald PBS+ (PBS supplert med 0,5x proteasehemmercocktail og 0,5x fosfatasehemmercocktail) til hver tallerken.
- Samle cellene med en celleskraper og overfør cellefjæringen til et 15 ml sentrifugerør.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved hjelp av en svingbøtterotor på 400 x g i 5 min.
- Kast den supernatante og resuspend cellepellet forsiktig i 5 ml homogeniseringsbuffer (HB; 250 mM sukrose, 3 mM imidazol ved pH 7,4, 1 mM EDTA supplert med 0,03 mM cycloheximide, 1x proteasehemmercocktail og 1x fosfatasehemmercocktail).
- Samle cellene ved sentrifugering ved 1300 x g i 10 min.
- Resuspend cellepellet i 1 ml HB.
- Homogeniser cellene med en Dounce homogenisator for 15-20 slag.
MERK: Andre homogeniseringsmetoder, for eksempel å sende prøven gjennom en sprøyte, kan brukes. Homogeniseringseffektiviteten kan avsløres ved å observere homogenatet under et fasekontrastmikroskop. - Overfør homogenatet til et 2 ml sentrifugeringsrør.
MERK: Høst 50 μL homogenat med 12,5 μL 5x prøvebuffer og merk den som total lysat. - Tilsett 0,7 ml HB i homogenatet.
- Snurr det fortynnede homogenatet ved 2000 x g i 10 min ved 4 °C.
MERK: Pellet inneholder kjerner og ubrutte celler. - Samle 1,5 ml av supernatanten og gjenta trinn 2.12 en gang.
- Samle 1,4 ml av supernatanten og merk den som post-nukleær supernatant (PNS).
3. Klargjøring av tetthetsgraderingskolonne
- Overfør 1,2 ml PNS til et ultracentrifuge rør.
- Tilsett 1 ml 62 % sukroseoppløsning (2,351 M sukrose, 3 mM imidazol ved pH 7,4) i prøven og bland godt ved skånsom pipettering.
MERK: Den resulterende løsningen er en 40,6% sukroseløsning. - Tilsett 3,3 ml 35 % sukroseoppløsning (1,177 M sukrose, 3 mM imidazol ved pH 7,4) forsiktig oppå prøven.
- Tilsett 2,2 ml 25 % sukroseoppløsning (0,806 M sukrose, 3 mM imidazol ved pH 7,4) forsiktig på toppen av den 35 % sukroseoppløsningen.
MERK: Brytningsindeksen for de 62%, 40,6%, 35% og 25% sukroseløsningene ved romtemperatur er henholdsvis 1,44, 1,40, 1,39 og 1,37. Brytningsindeksene til sukroseløsningene kan kontrolleres med et refraktometer for å sikre presisjonen og konsistensen av eksperimentet. - Fyll opp ultracentrifugation tube med HB.
MERK: Oppbevar den klargjorte tetthetsgradientkolonnen midlertidig ved 4 °C.
4. Fraksjonering og gjenvinning av resirkulering endosomholdig brøkdel
- Sentrifuger kolonnen ved 210.000 x g i 3 timer ved 4 °C.
- Samle 12 brøker (1 ml hver) forsiktig, fra toppen av gradienten.
MERK: Resirkuleringsdosomene finnes i grensesnittet mellom 35% og 25% sukroseløsninger. De oppsamlede fraksjonene kan fryses i flytende nitrogen og lagres ved -80 °C. - Fortynn alle fraksjonene med 1 ml fortynningsbuffer (3 mM imidazol ved pH 7,4, 1 mM EDTA).
- Sentrifuger den fortynnede prøven ved 100 000 x g i 1 time ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten og tilsett 50 μL 1x prøvebuffer for å høste fraksjonene.
- Analyser proteininnholdet i fraksjonene ved vestlig blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter fraksjonering av de utransfected HEK293 cellene ved tetthet gradient ultracentrifugation, 12 brøker ble samlet fra toppen av gradienten. De høstede fraksjonene ble fortynnet med fortynningsbufferen i et 1:1-forhold og utsatt for en andre runde sentrifugering. Prøvene ble deretter utsatt for vestlig blotting for å analysere proteininnholdet. Som vist i figur 1,oppdages resirkuleringsmarkøren Rab11 i brøkdel 720. Andre subcellulære markører, inkludert β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 og Lamp1, ble også undersøkt. Et positivt EØS1-signal oppdages også i brøkdel 7. Båndintensitetene til GAPDH, COX IV og Rab11 i både fraksjon 7 og PNS ble målt med ImageLab-programvare (Bio-Rad). Intensitetsforholdene til markørene i brøkdel 7 til PNS ble beregnet og uttrykt i et stolpediagram ± SD.
De tidligere studiene tyder på at ARF6 og ELMO1 samhandler med FE65 for å fremme Rac1-mediert nevrittutvekst21,22. Siden ARF6 er en regulator for endokytisk resirkulering og ELMO1 plasmamembranmålretting er avgjørende for den påfølgende Rac1-aktiveringen, er det hypoteset at FE65 forbinder ARF6 og ELMO1 for å megle smuglingen av ELMO1 til plasmamembranen. Derfor ble denne metoden brukt til å undersøke ELMO1-nivået i de isolerte resirkulerings-endosomene. HEK293-celler ble transfektert med enten ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L eller ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. Fant ingen endringer i ELMO1-distribusjonen med overtrykk av ARF6 Q67L og FE65 (figur 2A). Deretter ble ELMO1-nivået i brøkdel 7 (Rab11-positiv) sammenlignet mellom forskjellige transfeksjoner. Mengden ELMO1 i fraksjonen er funnet å heve etter co-transfeksjon av ARF6 Q67L. Ytterligere økning i ELMO1-nivået observeres når både ARF6 Q67L og FE65 uttrykkes samtidig (Figur 2B). Omvendt reduserte knockout av FE65 den ARF6-medierte ELMO1-berikelsen i brøkdel 7 (figur 2C).
Figur 1: Resirkulering av endosomer finnes i brøkdel 7 etter tetthetsgradient ultracentrifugation. Utransfected HEK293 celler ble fraksjonert og proteininnholdet i de oppnådde fraksjonene ble analysert med vestlig blotting. Rab11 påviss i fraksjon 7 med anti-Rab11 antistoff (1:500). Andre subcellulære markører ble påvist med deres spesifikke antistoffer, inkludert β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10,000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500) og Lamp1 (1:1000). Brøk 1 er den mindre tette øverste brøken, mens brøk 12 er den tettere nederste brøken. Søylediagrammet viser forholdet mellom GAPDH, COX IV og Rab11 i brøkdel 7 til PNS ± SD. Denne figuren er endret fra Chan, W. W. R. et al.22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Uttrykk for FE65 fremmer ARF6-mediert endokytisk resirkulering av ELMO1. (A) Cellene transfektert med enten ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L eller ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 ble fraksjonert ved hjelp av tetthet gradient ultracentrifugation. Alle fraksjonene ble utsatt for vestlig blotting for å analysere distribusjonene av ELMO1, ARF6 Q67L og FE65. Brøk 1 er den mindre tette øverste brøken, mens brøk 12 er den tettere nederste brøken. (B) Rab11-positiv brøkdel 7 fra forskjellige transfeksjoner ble analysert med vestlig blotting for å evaluere nivåene av ELMO1 og ARF6 Q67L. Mengden ELMO1 i brøkdel 7 ble forhøyet da cellene var co-transfekterende med ARF6 Q67L. Samuttrykket til ARF6 Q67L og FE65 øker mengden ELMO1 ytterligere i brøken. (C) Wildtype HEK293 ble transfektert med ELMO1 eller ELMO1 + ARF6 Q67L, mens FE65 KO HEK293 ble transfektert med ELMO1 + ARF6 Q67L. Den ARF6-medierte ELMO1-berikelsen i brøkdel 7 ble betydelig redusert i FE65 KO-celler. (B-C) Resirkulering endosome markør Rab11 (1:500) og cytosol markør GAPDH (1:10,000) ble undersøkt. ELMO1, FE65 og ARF6 Q67L ble påvist med henholdsvis anti-ELMO1 B-7 (1:1000), anti-FE65 E-20 (1:1000) og anti-myc 9B11 (1:5000). Det relative nivået av ELMO1 i brøkdel 7 ble uttrykt som det densitometriske forholdet mellom ELMO1 i brøkdel 7/total ELMO1. Data for stolpediagrammet ble hentet fra tre uavhengige eksperimenter. Enveis ANOVA med Bonferroni post hoc-test ble brukt til statistisk analyse. *p < 0,001. Resultatene er gjennomsnittlig foldeendring ± SD22. Denne figuren er endret fra Chan, W. W. R. et al.22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovennevnte protokoll skisserer prosedyrene for å isolere resirkuleringsdosomer fra dyrkede celler ved ultracentrifugation. Påliteligheten til denne metoden har blitt demonstrert av den nyeste publikasjonen22, som viser at resirkulering av endosomer er vellykket isolert fra andre organeller (figur 1), for eksempel Golgi-apparatet og mitokondrier. Noen kritiske trinn må tas hensyn til for å oppnå et godt separasjonsresultat. Mens du forbereder sukroseløsningene, anbefales det å validere brytningsindeksene til løsningene med et refraktometer. Brytningsindeksen for de 62%, 35% og 25% sukroseløsningene ved romtemperatur er henholdsvis 1,44, 1,39 og 1,37. Luftbobler bør også unngås fra gradienten. Tilstedeværelsen av bobler i kolonnen kan forstyrre kontinuiteten i gradienten. Vaskemidler bør unngås i homogeniseringsprosessen siden de skader membranen av organeller. Dette fører til frigjøring av proteiner fra membranbundne organeller og kan føre til alvorlig forurensning. Også alle homogeniseringsverktøy bør forhåndskjøles før bruk for å unngå proteinforringelse under homogenisering. Når gradienten er forberedt, bør den brukes så snart som mulig. Selv om den forberedte gradienten midlertidig kan lagres ved 4 °C ( 1-2 t), kan langvarig lagring forstyrre tetthetsgradienten på grunn av diffusjon.
Sukrose er et mye brukt gradientmedium på grunn av sin enkle tilgjengelighet. Det er faktisk mange andre alternativer, inkludert Percoll og Ficoll-40023,24. Disse mediene har forskjellige fysiske egenskaper sammenlignet med sukrose. For eksempel har Percoll lavere osmolaritet og viskositet enn sukrose. Disse tillater rask banding av partikler ved hjelp av lavere sentrifugalkrefter. Ficoll-400 har lavere permeabilitet mot membraner enn sukrose på grunn av sin høye molekylvekt og lave innhold av dialyzable materiale. Derfor kan endring av graderingsmediet oppnå en høyere endosom isolasjonseffektivitet.
Bortsett fra tetthet gradient ultracentrifugation, andre metoder kan brukes for celle fraksjonering, inkludert fristrøm elektroforese (FFE)25, fluorescens-aktivert organelle sortering (FAOS)26, og immunoisolasjon27. FFE er en væskefase separasjonsmetode. Prøven strømmer gjennom separasjonsbufferen under påvirkning av et elektrisk felt vinkelrett på strømningsretningen. Avbøyningsnivåer av forskjellige organeller varierer basert på overflateladningene25. FAOS bruker vanligvis en fluorescerende tag eller antistoff for å merke spesifikke organeller og deretter etterfulgt av strømningscytometri for isolasjonen28,29. Immunisolasjon er avhengig av å oppdage spesifikke antigener på overflaten av den målrettede organellen og etterfølgende nedbør av antistoffer30.
Når du sammenligner med disse alternativene, har tetthet gradient ultracentrifugation sine egne fordeler. Først av alt kan en distribusjonsprofil av det interesserte proteinet oppnås ved å utføre vestlig blotting med de isolerte fraksjonene (Figur 2A). Eventuelle endringer i protein subcellulær lokalisering kan lett oppdages. Ultracentrifuge er også et standardinstrument i de fleste institutter, og det tekniske kravet for drift av sentrifugen er lavt. I motsetning er det nødvendig med et strømningscytometer og et spesifikt elektroforesesystem for isolasjonsprosessen til henholdsvis FAOS og FFE. Det er ikke nødvendig med spesifikt utstyr for immunisolasjon. Det brukes imidlertid hovedsakelig til å isolere endosomer fra et lite antall celler. Forberedelsesskalaen for ultracentrifugation er større enn for immunisolasjon. Dessuten er et antistoff med høy spesifisitet nødvendig for immunisolasjon31. Videre kan ikke vaskemiddel- og høy saltholdig buffer brukes i vasketrinnene for å sikre endosomenes integritet. Dette kan føre til høy bakgrunn og redusere renheten til den isolerte organelle31.
Siden tetthet gradient ultracentrifugation skiller organeller basert på tetthet, er den viktigste begrensningen å løse makt mot organeller med lignende tetthet. Som vist i figur 1,oppdages både Rab11 og EØS1 i brøkdel 7 på grunn av de lignende fysiske egenskapene til resirkulering og tidlige endosomer. Ytterligere analyser er nødvendig for å bekrefte endringene i nivået av det målrettede proteinet i resirkuleringen. I den forrige studien ble co-immunostaining på ELMO1 og Rab11 utført i celle22. I tillegg til å utføre andre analyser, kan noen tiltak vedtas for å overvinne dette problemet. En gradering med kontinuerlig tetthet kan løse organeller med mindre tetthetsforskjeller32. Avkastningen i en kontinuerlig gradering er imidlertid betydelig lavere enn for en diskontinuerlig gradient. Det er mulig å manipulere endosomets tetthet ved å forhåndsbehandle cellene med latexperler33. Perlene internaliseres av cellene via endokytose. Tettheten av perlene som inneholder endosomer er betydelig redusert og kan skilles fra andre organeller. Vanligvis kan det å legge til et annet isolasjonsnivå forbedre isolasjonen av organeller med lignende tettheter betydelig. For eksempel, utfør immunisolasjon fra den isolertebrøkdelen 34. Ved å bruke et bestemt antistoff kan resirkulering av endosomer skilles fra forurensningene. Fluorescerende merkede antistoffer og sonder, kombinert med strømningscytometrianalyse, kan også brukes til presis endosomisolasjon28. FFE gjelder også for separering av organeller med lignende tettheter basert på overflateladning25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter med innholdet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Research Grants Council Hong Kong, CUHK direkte tilskuddsordning, United College legatfond og TUYF Charitable Trust. Tallene i dette arbeidet ble tilpasset fra vår forrige publikasjon, "ARF6-Rac1 signalmediert nevrittutvekst forsterkes av nevronadapteren FE65 gjennom orkestrering av ARF6 og ELMO1" publisert i FASEB Journal i oktober 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).
