Summary
Cet article vise à présenter un protocole de préparation d’endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose.
Abstract
Le trafic endosomal est un processus cellulaire essentiel qui régule un large éventail d’événements biologiques. Les protéines sont internalisées à partir de la membrane plasmique, puis transportées vers les premiers endosomes. Les protéines internalisées pourraient être transitées vers le lysosome pour être dégradées ou recyclées vers la membrane plasmique. Une voie de recyclage endocytaire robuste est nécessaire pour équilibrer l’élimination des matériaux membranaires de l’endocytose. Diverses protéines régulent la voie, y compris le facteur ADP-ribosylation 6 (ARF6). L’ultracentrifugation par gradient de densité est une méthode classique de fractionnement cellulaire. Après la centrifugation, les organites sont sédimentés à leur surface isopycnique. Les fractions sont collectées et utilisées pour d’autres applications en aval. Décrit ici est un protocole pour obtenir une fraction contenant des endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères transfectées en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité. Les fractions isolées ont été soumises à un transfert Western standard pour analyser leur teneur en protéines. En utilisant cette méthode, nous avons identifié que le ciblage de la membrane plasmique de l’engloutissement et de la motilité cellulaire 1 (ELMO1), un facteur d’échange de nucléotides de guanine substrat 1 de la toxine botulique C3 (Rac1) lié à Ras, se fait par recyclage endocytaire médié par ARF6.
Introduction
Le trafic endosomal est un processus physiologique essentiel qui implique divers événements biologiques1,par exemple, le transport des récepteurs de signalisation, des canaux ioniques et des molécules d’adhésion. Les protéines localisées au niveau de la membrane plasmique sont internalisées par endocytose2. Les protéines internalisées sont ensuite triées par l’endosomeprécoce 3. Certaines des protéines sont ciblées sur les lysosomes pour la dégradation4. Cependant, une quantité importante de protéines est recyclée à la surface de la cellule par des processus de recyclage rapides et lents. Lors d’un recyclage rapide, les protéines quittent les premiers endosomes et retournent directement à la membrane plasmique. Inversement, en cas de recyclage lent, les protéines sont d’abord triées dans le compartiment de recyclage endocytaire, puis transportées vers la membrane plasmique. Diverses protéines de cargaison, par exemple la clathrine, le complexe rétromère, le complexe retriever et la protéine du syndrome de Wiskott-Aldrich, et le complexe SCAR Homologue (WASH), participent à de tels processus de recyclage membranaire4,5,6,7,8,9. L’équilibre de l’endocytose et de l’événement de recyclage est crucial pour la survie cellulaire et contribue à divers événements cellulaires10, par exemple, l’adhésion cellulaire, la migration cellulaire, la polarité cellulaire et la transduction du signal.
ARF6, une petite GTPase, est un régulateur signalé du trafic endocytaire7,11,12. Fait intéressant, divers groupes de recherche ont illustré l’importance de l’ARF6 dans le recyclage endocytaire13,14,15,16,17. L’étude vise à étudier la relation entre l’excroissance de neurites médiée par ARF6 et le recyclage endocytaire. Le rapport précédent suggère que l’activation d’ARF6 se fait en amont de l’activité rac1 en agissant sur ELMO1-dédicace du complexe de cytocinèse 1 (DOCK180)18. Cependant, la façon dont ARF6 déclenche la signalisation Rac1 médiée par ELMO1-DOCK180 reste incertaine. L’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour étudier le rôle du recyclage endocytaire médié par ARF6 dans un tel processus. En utilisant cela, la fraction contenant des endosomes de recyclage a été obtenue à partir de lysats cellulaires19. La fraction a été soumise à un transfert western pour l’analyse de la teneur en protéines. Les résultats de l’immunoblot ont révélé que sous la présence de FE65, une protéine adaptatrice enrichie en cerveau, l’ARF6 actif augmentait considérablement le niveau d’ELMO1 dans la fraction contenant des endosomes de recyclage. Le protocole suivant comprend les procédures pour (1) transfecter les cellules de mammifères; 2° la préparation des échantillons et des colonnes de gradient de densité; et (3) l’obtention de la fraction contenant des endosomes de recyclage.
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Protocol
1. Culture et transfection de cellules de mammifères
- Plaque 2 x 106 cellules dans un plat de culture de 100 mm. Utilisez quatre plats pour chaque transfection.
REMARQUE : Le nombre de cellules requises peut varier selon les lignées cellulaires. L’optimisation peut être nécessaire avant de passer à l’étape d’isolement. - Le lendemain, transfectez les cellules avec de la lipofectamine selon les instructions du fabricant.
2. Récolte cellulaire
- Jeter le milieu de culture 48 h après la transfection.
- Lavez les cellules avec du PBS glacé (phosphates de sodium de 10 mM, chlorure de potassium de 2,68 mM, chlorure de sodium de 140 mM) deux fois.
- Ajouter 1 mL dePBS+ glacé (PBS complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,5x et un cocktail d’inhibiteurs de phosphatase 0,5x) à chaque plat.
- Recueillir les cellules avec un grattoir à cellules et transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
- Abattez les cellules par centrifugation à l’aide d’un rotor à godet oscillant à 400 x g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement la pastille cellulaire dans 5 mL de tampon d’homogénéisation (HB; 250 mM de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4, 1 mM d’EDTA complété par 0,03 mM de cycloheximide, 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase et 1x cocktail d’inhibiteurs de phosphatase).
- Prélever les cellules par centrifugation à 1 300 x g pendant 10 min.
- Remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de HB.
- Homogénéiser les cellules avec un homogénéisateur Dounce pendant 15 à 20 coups.
REMARQUE: D’autres méthodes d’homogénéisation, par exemple, le passage de l’échantillon à travers une seringue, pourraient être utilisées. L’efficacité de l’homogénéisation pourrait être révélée en observant l’homogénat sous un microscope à contraste de phase. - Transférer l’homogénat dans un tube de centrifugation de 2 mL.
REMARQUE: Récoltez 50 μL d’homogénat avec 12,5 μL de tampon d’échantillon 5x et étiquetez-le comme lysat total. - Ajouter 0,7 mL de HB à l’homogénat.
- Faire tourner l’homogénat dilué à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
REMARQUE: La pastille contient des noyaux et des cellules ininterrompues. - Recueillir 1,5 mL du surnageant et répéter l’étape 2,12 une fois.
- Recueillir 1,4 mL du surnageant et l’étiqueter comme surnageant post-nucléaire (SNP).
3. Préparation de la colonne de gradient de densité
- Transférer 1,2 mL de PNS dans un tube ultracentrifuge.
- Ajouter 1 mL de solution de saccharose à 62 % (2,351 M de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4) à l’échantillon et bien mélanger par pipetage doux.
REMARQUE: La solution résultante est une solution de saccharose à 40,6%. - Ajouter soigneusement 3,3 mL de solution de saccharose à 35 % (1,177 M de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4) sur l’échantillon.
- Ajouter soigneusement 2,2 mL de solution de saccharose à 25 % (0,806 M de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4) sur la solution de saccharose à 35 %.
NOTE: L’indice de réfraction des solutions de saccharose à 62%, 40,6%, 35% et 25% à température ambiante est de 1,44, 1,40, 1,39 et 1,37, respectivement. Les indices de réfraction des solutions de saccharose pourraient être vérifiés à l’aide d’un réfractomètre pour assurer la précision et la cohérence de l’expérience. - Remplissez le tube d’ultracentrifugation avec HB.
REMARQUE : Stocker temporairement la colonne de gradient de densité préparée à 4 °C.
4. Fractionnement et récupération de la fraction contenant des endosomes recyclés
- Centrifuger la colonne à 210 000 x g pendant 3 h à 4 °C.
- Collectez 12 fractions (1 mL chacune) avec soin, en commençant par le haut du gradient.
REMARQUE: Les endosomes de recyclage doivent être trouvés à l’interface entre 35% et 25% de solutions de saccharose. Les fractions collectées peuvent être congelées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C. - Diluer toutes les fractions avec 1 mL de tampon de dilution (3 mM d’imidazole à pH 7,4, 1 mM d’EDTA).
- Centrifuger l’échantillon dilué à 100 000 x g pendant 1 h à 4 °C.
- Aspirer le surnageant et ajouter 50 μL de tampon d’échantillon 1x pour récolter les fractions.
- Analyser la teneur en protéines dans les fractions par western blotting.
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Representative Results
Après avoir fractionné les cellules HEK293 non transfectées par ultracentrifugation du gradient de densité, 12 fractions ont été collectées à partir du haut du gradient. Les fractions récoltées ont été diluées avec le tampon de dilution dans un rapport de 1:1 et soumises à une deuxième série de centrifugation. Les échantillons ont ensuite été soumis à un transfert Western pour analyser leur teneur en protéines. Comme le montre la figure 1,le marqueur d’endosomes de recyclage Rab11 est détecté dans la fraction 720. D’autres marqueurs subcellulaires, notamment β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 et Lamp1, ont également été sondés. Un signal EEA1 positif est également détecté dans la fraction 7. Les intensités de bande de GAPDH, COX IV et Rab11 dans la fraction 7 et le PNS ont été mesurées avec le logiciel ImageLab (Bio-Rad). Les rapports d’intensité des marqueurs de la fraction 7 par rapport au SNP ont été calculés et exprimés dans un graphique à barres ± SD.
Les études précédentes suggèrent que ARF6 et ELMO1 interagissent avec FE65 pour favoriser l’excroissance de neurites médiées par Rac121,22. Étant donné que l’ARF6 est un régulateur du recyclage endocytaire et que le ciblage de la membrane plasmique ELMO1 est essentiel pour l’activation ultérieure de Rac1, il est supposé que FE65 connecte ARF6 et ELMO1 pour arbitrer le trafic d’ELMO1 vers la membrane plasmique. Par conséquent, cette méthode a été utilisée pour étudier le niveau d’ELMO1 dans les endosomes de recyclage isolés. Les cellules HEK293 ont été transfectées avec ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L ou ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. Aucun changement n’a été observé dans la distribution ELMO1 avec surexpression ARF6 Q67L et FE65 (Figure 2A). Ensuite, le niveau d’ELMO1 dans la fraction 7 (Rab11-positif) a été comparé entre différentes transfections. La quantité d’ELMO1 dans la fraction s’élève après la co-transfection d’ARF6 Q67L. Une nouvelle augmentation du niveau d’ELMO1 est observée lorsque aRF6 Q67L et FE65 sont co-exprimés(Figure 2B). Inversement, le knockout de FE65 a diminué l’enrichissement ELMO1 médié par ARF6 en fraction 7(Figure 2C).
Figure 1: Les endosomes de recyclage se retrouvent en fraction 7 après ultracentrifugation par gradient de densité. Les cellules HEK293 non transfectées ont été fractionnées et la teneur en protéines des fractions obtenues a été analysée par transfert western. Rab11 est détecté en fraction 7 avec un anticorps anti-Rab11 (1:500). D’autres marqueurs subcellulaires ont été détectés avec leurs anticorps spécifiques, notamment β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10 000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500) et Lamp1 (1:1000). La fraction 1 est la fraction supérieure la moins dense, tandis que la fraction 12 est la fraction inférieure la plus dense. Le graphique à barres montre le rapport de GAPDH, COX IV et Rab11 en fraction 7 à PNS ± SD. Cette figure a été modifiée à partir de Chan, W. W. R. et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: L’expression de FE65 favorise le recyclage endocytaire d’ELMO1 médié par ARF6. (A) Les cellules transfectées avec ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L ou ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 ont été fractionnées à l’aide de l’ultracentrifugation par gradient de densité. Toutes les fractions ont été soumises à un transfert de Western pour analyser les distributions d’ELMO1, ARF6 Q67L et FE65. La fraction 1 est la fraction supérieure la moins dense, tandis que la fraction 12 est la fraction inférieure la plus dense. (B) La fraction Rab11-positive 7 de différentes transfections a été analysée avec Western blotting pour évaluer les niveaux d’ELMO1 et d’ARF6 Q67L. La quantité d’ELMO1 dans la fraction 7 était élevée lorsque les cellules co-transfectaient avec ARF6 Q67L. La co-expression d’ARF6 Q67L et de FE65 augmente encore la quantité d’ELMO1 dans la fraction. (C) Wildtype HEK293 a été transfecté avec ELMO1 ou ELMO1 + ARF6 Q67L, tandis que FE65 KO HEK293 a été transfecté avec ELMO1 + ARF6 Q67L. L’enrichissement en ELMO1 médié par ARF6 en fraction 7 a significativement diminué dans les cellules FE65 KO. (B-C) Le marqueur endosome de recyclage Rab11 (1:500) et le marqueur cytosol GAPDH (1:10 000) ont été sondés. ELMO1, FE65 et ARF6 Q67L ont été détectés avec l’anti-ELMO1 B-7 (1:1000), l’anti-FE65 E-20 (1:1000) et l’anti-myc 9B11 (1:5000), respectivement. Le niveau relatif d’ELMO1 dans la fraction 7 a été exprimé comme le rapport densitométrique de l’ELMO1 dans la fraction 7/ELMO1 total. Les données du graphique à barres ont été obtenues à partir de trois expériences indépendantes. L’ANOVA unidirectionnelle avec test post-hoc de Bonferroni a été utilisée pour l’analyse statistique. *p < 0,001. Les résultats sont un changement moyen de pli ± SD22. Cette figure a été modifiée à partir de Chan, W. W. R. et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole ci-dessus décrit les procédures d’isolement des endosomes de recyclage des cellules cultivées par ultracentrifugation. La fiabilité de cette méthode a été démontrée par la dernière publication22, prouvant que les endosomes de recyclage sont isolés avec succès d’autres organites(Figure 1),tels que l’appareil de Golgi et les mitochondries. Certaines étapes critiques doivent être prises en compte pour obtenir un bon résultat de séparation. Lors de la préparation des solutions de saccharose, il est recommandé de valider les indices de réfraction des solutions avec un réfractomètre. L’indice de réfraction des solutions de saccharose à 62%, 35% et 25% à température ambiante est de 1,44, 1,39 et 1,37, respectivement. En outre, les bulles d’air doivent être évitées du gradient. La présence de bulles dans la colonne peut perturber la continuité du gradient. Les détergents doivent être évités dans le processus d’homogénéisation car ils endommagent la membrane des organites. Cela conduit à la libération de protéines à partir d’organites liés à la membrane et pourrait entraîner une contamination grave. De plus, tous les outils d’homogénéisation doivent être pré-refroidis avant utilisation pour éviter la dégradation des protéines pendant l’homogénéisation. Une fois le dégradé préparé, il doit être utilisé dès que possible. Bien que le gradient préparé puisse être stocké temporairement à 4 °C (1-2 h), un stockage prolongé peut interférer avec le gradient de densité en raison de la diffusion.
Le saccharose est un milieu de gradient largement utilisé en raison de sa disponibilité facile. En fait, il existe de nombreuses autres alternatives, y compris Percoll et Ficoll-40023,24. Ces milieux ont des propriétés physiques différentes par rapport au saccharose. Par exemple, Percoll a une osmolarité et une viscosité inférieures à celles du saccharose. Ceux-ci permettent une bande rapide des particules en utilisant des forces centrifuges plus faibles. Le Ficoll-400 a une perméabilité plus faible aux membranes que le saccharose en raison de son poids moléculaire élevé et de sa faible teneur en matériau dialysable. Par conséquent, la modification du milieu de gradient peut permettre d’obtenir une efficacité d’isolement des endosomes plus élevée.
Outre l’ultracentrifugation par gradient de densité, d’autres méthodes peuvent être utilisées pour le fractionnement cellulaire, notamment l’électrophorèse en flux libre(FFE) 25,le tri des organites activés par fluorescence (FAOS)26et l’immunoisolation27. FFE est une méthode de séparation de phase liquide. L’échantillon s’écoule à travers le tampon de séparation sous l’influence d’un champ électrique perpendiculaire à la direction de l’écoulement. Les niveaux de déviation des différents organites varient en fonction de leurs charges superficielles25. FAOS utilise généralement une étiquette fluorescente ou un anticorps pour marquer un organite spécifique, puis suivi d’une cytométrie en flux pour l’isolement28,29. L’immunoisolation repose sur la détection d’antigènes spécifiques à la surface de l’organite ciblé et la précipitation ultérieure par des anticorps30.
En comparaison avec ces alternatives, l’ultracentrifugation à gradient de densité présente ses propres avantages. Tout d’abord, un profil de distribution de la protéine intéressée peut être obtenu en effectuant un Western blotting avec les fractions isolées (Figure 2A). Tout changement dans la localisation subcellulaire des protéines pourrait être facilement détecté. En outre, l’ultracentrifugeuse est un instrument standard dans la plupart des instituts et les exigences techniques pour faire fonctionner la centrifugeuse sont faibles. En revanche, un cytomètre en flux et un système d’électrophorèse spécifique sont nécessaires pour le processus d’isolement du FAOS et du FFE, respectivement. Aucun équipement spécifique n’est requis pour l’immunoisolation. Cependant, il est principalement utilisé pour isoler les endosomes d’un petit nombre de cellules. L’échelle de préparation de l’ultracentrifugation est plus grande que celle de l’immunoisolation. En outre, un anticorps à haute spécificité est nécessaire pour l’immunoisolation31. De plus, un tampon contenant du détergent et du sel ne peut pas être utilisé dans les étapes de lavage pour assurer l’intégrité des endosomes. Cela peut conduire à un fond élevé et réduire la pureté de l’organiteisolé 31.
Étant donné que l’ultracentrifugation par gradient de densité sépare les organites en fonction de la densité, sa limitation la plus importante est celle du pouvoir de résolution vers les organites de densité similaire. Comme le montre la figure 1,Rab11 et EEA1 sont détectés dans la fraction 7 en raison des propriétés physiques similaires du recyclage et des endosomes précoces. D’autres tests sont nécessaires pour confirmer les changements dans le niveau de la protéine ciblée dans l’endosome de recyclage. Dans l’étude précédente, une co-immunocoloration sur ELMO1 et Rab11 a été réalisée dans les cellules22. En plus d’effectuer d’autres tests, certaines mesures peuvent être adoptées pour surmonter ce problème. Un gradient de densité continu peut résoudre des organites avec des différences de densité mineures32. Cependant, le rendement dans un gradient continu est nettement inférieur à celui d’un gradient discontinu. Il est possible de manipuler la densité de l’endosome en prétraitant les cellules avec des perles de latex33. Les perles sont internalisées par les cellules via l’endocytose. La densité des perles contenant des endosomes est considérablement réduite et peut être séparée des autres organites. Habituellement, l’ajout d’un autre niveau d’isolement pourrait améliorer considérablement l’isolement des organites ayant des densités similaires. Par exemple, effectuer une immunoisolation à partir de la fraction isolée34. En utilisant un anticorps spécifique, les endosomes de recyclage peuvent être séparés des contaminants. Des anticorps et des sondes marqués par fluorescence, combinés à une analyse par cytométrie en flux, pourraient également être utilisés pour isoler avec précision les endosomes28. FFE est également applicable pour séparer des organites de densités similaires en fonction de leur charge de surface25.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds du Research Grants Council Hong Kong, du programme de subventions directes CUHK, du fonds de dotation United College et du TUYF Charitable Trust. Les chiffres de ce travail ont été adaptés de notre publication précédente, « ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentialiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1 » publié dans le FASEB Journal en octobre 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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