Summary
Целью данной статьи является представление протокола подготовки рециркулирующих эндосом из клеток млекопитающих с использованием ультрацентрифугирования ультрацентрифугирования градиента плотности сахарозы.
Abstract
Эндосомальный трафик является важным клеточным процессом, который регулирует широкий спектр биологических событий. Белки интернализуются из плазматической мембраны, а затем транспортируются в ранние эндосомы. Интернализованные белки могут быть переданы в лизосому для деградации или переработаны обратно в плазматическую мембрану. Надежный эндоцитарный путь рециркуляции необходим для балансировки удаления мембранных материалов от эндоцитоза. Сообщается, что различные белки регулируют этот путь, включая фактор АДФ-рибозилирования 6 (ARF6). Ультрацентрифугирование градиента плотности является классическим методом фракционирования клеток. После центрифугирования органеллы оседают на их изопикновой поверхности. Фракции собираются и используются для других последующих применений. Здесь описан протокол получения рециркулирующей эндосомной фракции из трансфектированных клеток млекопитающих с использованием ультрацентрифугирования градиента плотности. Выделенные фракции подвергали стандартному вестерн-блоттингу для анализа их белкового содержания. Используя этот метод, мы определили, что плазматическая мембрана, нацеленная на поглощение и подвижность клеток 1 (ELMO1), связанный с Ras субстрат ботулинического токсина C3 1 (Rac1) фактор обмена гуанина нуклеотида, осуществляется через ARF6-опосредованную эндоцитарную рециркуляцию.
Introduction
Эндосомальный трафик является важным физиологическим процессом, который включает в себя различные биологические события1,например, транспортировку сигнальных рецепторов, ионных каналов и молекул адгезии. Белки, локализованные на плазматической мембране, интернализуются эндоцитозом2. Интернализованные белки затем сортируются ранней эндосомой3. Некоторые из белков нацелены на лизосомы для деградации4. Тем не менее, значительное количество белков перерабатывается обратно на поверхность клетки путем быстрой переработки и медленных процессов переработки. При быстрой рециркуляции белки покидают ранние эндосомы и непосредственно возвращаются в плазматическую мембрану. И наоборот, при медленной рециркуляции белки сначала сортируются в эндоцитарный рециркуляционный отсек, а затем транспортируются обратно в плазматическую мембрану. Различные грузовые белки, например, клатрин, ретромерный комплекс, комплекс ретривера и белок синдрома Вискотта-Олдрича, а также комплекс SCAR Homologue (WASH), участвуют в таких процессах рециркуляции мембран4,5,6,7,8,9. Баланс эндоцитоза и события рециркуляции имеет решающее значение для выживания клеток и способствует различным клеточным событиям10,например, клеточной адгезии, миграции клеток, полярности клеток и трансдукции сигнала.
ARF6, небольшая ГТФаза, является зарегистрированным регулятором эндоцитарного оборота7,11,12. Различные исследовательские группы проиллюстрировали важность ARF6 в эндоцитарной рециркуляции13,14,15,16,17. Исследование направлено на изучение взаимосвязи между ARF6-опосредованным ростом нейритов и эндоцитарной рециркуляцией. В предыдущем отчете предполагается, что активация ARF6 происходит вверх по течению до активности Rac1 через действие на ELMO1-дедикатор комплекса цитокинеза 1 (DOCK180)18. Однако остается неясным, как ARF6 запускает опосредованную сигнализацию Rac1 ELMO1-DOCK180. Ультрацентрифугирование градиента плотности было использовано для исследования роли эндоцитарной рециркуляции, опосредованной ARF6, в таком процессе. Используя это, рециркулирующая эндосомсодержащая фракция была получена из клеточных лизатов19. Фракцию подвергали вестерн-блоттингу для анализа содержания белка. Результаты иммуноблота показали, что в присутствии FE65, обогащенного мозгом адапторного белка, активный ARF6 существенно повышал уровень ELMO1 в рециркулирующей эндосомной фракции. Следующий протокол включает процедуры для (1) трансфекции клеток млекопитающих; 2) подготовка образцов и колонок градиента плотности; и 3) получение рециркулирующей эндосомосодержащей фракции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура и трансфекция клеток млекопитающих
- Пластина 2 х 106 клеток в 100 мм культуральной посуде. Используйте по четыре блюда для каждой трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимых ячеек может варьироваться для разных клеточных линий. Оптимизация может потребоваться, прежде чем перейти к этапу изоляции. - На следующий день трансфектируют клетки липофектамином согласно инструкции производителя.
2. Сбор клеток
- Выбрасывают культуральную среду через 48 ч после трансфекции.
- Дважды промыть ячейки ледяным PBS (10 мМ фосфатов натрия, 2,68 мМ калия хлорида, 140 мМ хлорида натрия).
- Добавьте 1 мл ледяного PBS+ (PBS, дополненный коктейлем ингибитора протеазы 0,5x и коктейлем ингибитора фосфатазы 0,5x).
- Соберите ячейки с помощью клеточного скребка и перенесите клеточную суспензию в центрифужную трубку объемом 15 мл.
- Гранулируйте ячейки центрифугированием с помощью поворотного ротора ковша при 400 х г в течение 5 мин.
- Откажитесь от супернатанта и осторожно повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл буфера гомогенизации (HB; 250 мМ сахарозы, 3 мМ имидазола при рН 7,4, 1 мМ ЭДТА с добавлением циклогексимида 0,03 мМ, коктейля ингибитора протеазы и 1 коктейля ингибитора фосфатазы).
- Соберите клетки путем центрифугирования при 1 300 х г в течение 10 мин.
- Повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл ГВ.
- Гомогенизируйте клетки гомогенизатором Dounce в течение 15-20 ударов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другие методы гомогенизации, например, пропускание образца через шприц. Эффективность гомогенизации может быть выявлена путем наблюдения гомогената под фазово-контрастным микроскопом. - Перенесите гомогенат в центрифугированную трубку объемом 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите 50 мкл гомогената с 12,5 мкл 5-кратного буфера образца и пометьте его как общий лизат. - Добавьте 0,7 мл HB к гомогенату.
- Раскрутите разбавленный гомогенат при 2 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула содержит ядра и неповрежденные клетки. - Соберите 1,5 мл супернатанта и повторите шаг 2,12 один раз.
- Соберите 1,4 мл супернатанта и пометьте его как постядерный супернатант (PNS).
3. Подготовка колонны градиента плотности
- Переведите 1,2 мл ПНС в ультрацентрифужную трубку.
- Добавьте к образцу 1 мл 62% раствора сахарозы (2,351 М сахарозы, 3 мМ имидазола при рН 7,4) и хорошо перемешайте путем бережного пипетирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный раствор представляет собой 40,6% раствор сахарозы. - Добавьте 3,3 мл 35% раствора сахарозы (1,177 М сахарозы, 3 мМ имидазола при рН 7,4) осторожно поверх образца.
- Добавьте 2,2 мл 25% раствора сахарозы (0,806 М сахарозы, 3 мМ имидазола при рН 7,4) осторожно поверх 35% раствора сахарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Показатель преломления 62%, 40,6%, 35% и 25% растворов сахарозы при комнатной температуре составляет 1,44, 1,40, 1,39 и 1,37 соответственно. Показатели преломления растворов сахарозы могут быть проверены с помощью рефрактометра для обеспечения точности и последовательности эксперимента. - Заполните ультрацентрифугированную трубку HB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Временно хранить подготовленную колонку градиента плотности при 4 °C.
4. Фракционирование и рекуперация рециркуляционной эндосомосодержащей фракции
- Центрифугировать колонну при 210 000 х г в течение 3 ч при 4 °C.
- Тщательно соберите 12 фракций (по 1 мл каждая), начиная с вершины градиента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рециркулирующие эндосомы должны находиться на границе между 35% и 25% растворами сахарозы. Собранные фракции могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 °C. - Разбавить все фракции 1 мл буфера разбавления (3 мМ имидазола при рН 7,4, 1 мМ ЭДТА).
- Центрифугировать разбавленный образец при 100 000 х г в течение 1 ч при 4°С.
- Аспирируйте супернатант и добавьте 50 мкл 1x буфера образца для сбора фракций.
- Проанализируйте содержание белка во фракциях методом вестерн-блоттинга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После фракционирования нетрансфектированных клеток HEK293 ультрацентрифугированием градиента плотности собирали 12 фракций, начиная с вершины градиента. Собранные фракции разбавляли буфером разбавления в соотношении 1:1 и подвергали второму раунду центрифугирования. Затем образцы были подвергнуты западному блоттингу для анализа содержания их белка. Как показано на фиг.1,рециркулирующий эндосомный маркер Rab11 обнаруживается во фракции 720. Другие субклеточные маркеры, включая β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 и Lamp1, также были исследованы. Положительный сигнал EEA1 также обнаруживается во фракции 7. Диапазонные интенсивности GAPDH, COX IV и Rab11 как в фракции 7, так и в PNS были измерены с помощью программного обеспечения ImageLab (Bio-Rad). Коэффициенты интенсивности маркеров во фракции 7 к ПНС были рассчитаны и выражены в линейчатой диаграмме ± SD.
Предыдущие исследования показывают, что ARF6 и ELMO1 взаимодействуют с FE65 для стимулирования Rac1-опосредованного роста нейритов21,22. Поскольку ARF6 является регулятором эндоцитарной рециркуляции, а нацеливание плазматической мембраны ELMO1 имеет решающее значение для последующей активации Rac1, предполагается, что FE65 соединяет ARF6 и ELMO1 для опосредования трафика ELMO1 в плазматическую мембрану. Поэтому этот метод был использован для исследования уровня ELMO1 в изолированных эндосомах рециркуляции. Клетки HEK293 трансфектировали либо ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, либо ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. Не было обнаружено никаких изменений в распределении ELMO1 с гиперэкспрессией ARF6 Q67L и FE65(рисунок 2A). Затем уровень ELMO1 во фракции 7 (Rab11-положительный) сравнивали между различными трансфекциями. Установлено, что количество ELMO1 во фракции повышается после котрансфекции ARF6 Q67L. Дальнейшее повышение уровня ELMO1 наблюдается при совместной экспрессии ARF6 Q67L и FE65(рисунок 2B). И наоборот, нокаут FE65 уменьшал Опосредованное ARF6 обогащение ELMO1 во фракции 7(рисунок 2C).
Рисунок 1:Рециркулирующие эндосомы обнаруживаются во фракции 7 после ультрацентрифугирования градиента плотности. Нетрансфектированные клетки HEK293 фракционировали и анализировали содержание белка в полученных фракциях с помощью вестерн-блоттинга. Rab11 обнаруживается во фракции 7 с антителом против Rab11 (1:500). Другие субклеточные маркеры были обнаружены с их специфическими антителами, включая β-COP (1: 1000), COX IV (1: 1000), GAPDH (1: 10 000), EEA1 (1: 1000), Rab7 (1: 500) и Lamp1 (1: 1000). Фракция 1 является менее плотной верхней фракцией, в то время как фракция 12 является более плотной нижней фракцией. На линейчатой диаграмме показано отношение GAPDH, COX IV и Rab11 во фракции 7 к PNS ± SD. Эта цифра была изменена с Chan, W. W. R. et al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Экспрессия FE65 способствует ARF6-опосредованной эндоцитарной рециркуляции ELMO1. (A)Клетки, трансфектированные либо ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, либо ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65, были фракционированы с использованием ультрацентрифугирования градиента плотности. Все фракции были подвергнуты вестерн-блоттингу для анализа распределений ELMO1, ARF6 Q67L и FE65. Фракция 1 является менее плотной верхней фракцией, в то время как фракция 12 является более плотной нижней фракцией. (B)Rab11-положительная фракция 7 из различных трансфекций была проанализирована с помощью вестерн-блоттинга для оценки уровней ELMO1 и ARF6 Q67L. Количество ELMO1 во фракции 7 было повышено, когда клетки котрансфектировались с ARF6 Q67L. Коэкспрессия ARF6 Q67L и FE65 еще больше увеличивает количество ELMO1 во фракции. (C)Дикий тип HEK293 был трансфектирован ELMO1 или ELMO1 + ARF6 Q67L, тогда как FE65 KO HEK293 был трансфектирован ELMO1 + ARF6 Q67L. ARF6-опосредованное обогащение ELMO1 фракцией 7 значительно уменьшилось в клетках FE65 KO. (B-C) Исследовали рециркуляцию эндосомного маркера Rab11 (1:500) и маркера цитозола GAPDH (1:10 000). ELMO1, FE65 и ARF6 Q67L были обнаружены с анти-ELMO1 B-7 (1:1000), анти-FE65 E-20 (1:1000) и анти-myc 9B11 (1:5000) соответственно. Относительный уровень ELMO1 во фракции 7 был выражен как денситометрическое отношение ELMO1 в фракции 7/общий ELMO1. Данные для линейчатой диаграммы были получены из трех независимых экспериментов. Для статистического анализа использовался односторонний ANOVA с пост-специальным тестом Bonferroni. *p < 0,001. Результатом является среднее изменение сгиба ± SD22. Эта цифра была изменена с Chan, W. W. R. et al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В приведенном выше протоколе описываются процедуры выделения эндосом рециркуляции из культивируемых клеток путем ультрацентрифугирования. Надежность этого метода была продемонстрирована последней публикацией22,доказывающей, что рециркулирующие эндосомы успешно выделяются из других органелл(рисунок 1),таких как аппарат Гольджи и митохондрии. На некоторые критические шаги необходимо обратить внимание для получения хорошего результата разделения. При приготовлении растворов сахарозы рекомендуется проверять показатели преломления растворов рефрактометром. Показатель преломления 62%, 35% и 25% растворов сахарозы при комнатной температуре составляет 1,44, 1,39 и 1,37 соответственно. Кроме того, следует избегать пузырьков воздуха с градиента. Наличие пузырьков в колонке может нарушить непрерывность градиента. Следует избегать моющих средств в процессе гомогенизации, поскольку они повреждают мембрану органелл. Это приводит к высвобождению белков из мембранно-связанных органелл и может привести к серьезному загрязнению. Кроме того, все гомогенизирующие инструменты должны быть предварительно охлаждены перед использованием, чтобы избежать деградации белка во время гомогенизации. После того, как градиент подготовлен, его следует использовать как можно скорее. Хотя подготовленный градиент может временно храниться при 4°С (1-2 ч), длительное хранение может мешать градиенту плотности из-за диффузии.
Сахароза является широко используемой градиентной средой из-за ее легкой доступности. На самом деле существует множество других альтернатив, в том числе Percoll и Ficoll-40023,24. Эти среды имеют различные физические свойства по сравнению с сахарозой. Например, Перколл имеет более низкую осмолярность и вязкость, чем сахароза. Они позволяют быстро полосировать частицы с использованием более низких центробежных сил. Ficoll-400 имеет более низкую проницаемость по отношению к мембранам, чем сахароза, из-за его высокой молекулярной массы и низкого содержания диализуемого материала. Таким образом, изменение градиентной среды может привести к более высокой эффективности изоляции эндосом.
Помимо ультрацентрифугирования градиента плотности, для фракционирования клеток могут быть использованы другие методы, включая электрофорез свободного потока (FFE)25,флуоресцентно-активированную сортировку органелл (FAOS)26и иммуноизоляцию27. FFE - это метод разделения жидкой фазы. Образец протекает через разделительный буфер под воздействием электрического поля, перпендикулярного направлению потока. Уровни отклонения различных органелл варьируются в зависимости от их поверхностных зарядов25. FAOS обычно использует флуоресцентную метку или антитело для маркировки конкретных органелл, а затем последующую проточную цитометрию для выделения28,29. Иммуноизоляция основывается на обнаружении специфических антигенов на поверхности целевой органеллы и последующем осаждении антителами30.
По сравнению с этими альтернативами ультрацентрифугирование с градиентом плотности имеет свои преимущества. Прежде всего, профиль распределения интересующего белка можно получить, выполнив вестерн-блоттинг с выделенными фракциями(фиг.2А). Любые изменения в белковой субклеточной локализации могут быть легко обнаружены. Кроме того, ультрацентрифуга является стандартным инструментом в большинстве институтов, и технические требования к эксплуатации центрифуги низкие. Напротив, для процесса изоляции FAOS и FFE, соответственно, требуется проточный цитометр и специальная система электрофореза. Специального оборудования, необходимого для иммуноизоляции, не существует. Однако он в основном используется для выделения эндосом из небольшого количества клеток. Шкала препарата ультрацентрифугирования больше, чем у иммуноизоляционного. Кроме того, для иммуноизоляции необходимо антитело с высокой специфичностью31. Кроме того, моющий и солисодержащий буфер не может быть использован на этапах промывки для обеспечения целостности эндосом. Это может привести к высокому фону и снижению чистоты выделенной органеллы31.
Поскольку ультрацентрифугирование градиента плотности разделяет органеллы на основе плотности, его наиболее значительным ограничением является способность разрешать органеллы с аналогичной плотностью. Как показано на рисунке 1,как Rab11, так и EEA1 обнаруживаются во фракции 7 из-за сходных физических свойств рециркуляции и ранних эндосом. Необходимы дальнейшие анализы для подтверждения изменений уровня целевого белка в рециркулирующей эндосоме. В предыдущем исследовании коиммуноразмножение на ELMO1 и Rab11 проводилось в клетках22. В дополнение к выполнению других анализов могут быть приняты некоторые меры для преодоления этой проблемы. Непрерывный градиент плотности может разрешать органеллы с незначительными перепадами плотности32. Однако выход в непрерывном градиенте значительно ниже, чем у прерывистого градиента. Манипулировать плотностью эндосомы можно путем предварительной обработки клеток латексными шариками33. Шарики интернализуются клетками через эндоцитоз. Плотность шариков, содержащих эндосомы, значительно снижена и может быть отделена от других органелл. Обычно добавление еще одного уровня изоляции может значительно улучшить выделение органелл с аналогичной плотностью. Например, выполняют иммуноизоляцию из выделенной фракции34. Используя специфическое антитело, рециркулирующие эндосомы могут быть отделены от загрязняющих веществ. Флуоресцентно-меченые антитела и зонды в сочетании с анализом проточной цитометрии также могут быть использованы для точного выделения эндосом28. FFE также применим для разделения органелл с аналогичной плотностью на основе их поверхностного заряда25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием данной статьи.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана средствами Совета по исследовательским грантам Гонконга, схемы прямых грантов CUHK, эндаумент-фонда United College и благотворительного фонда TUYF. Цифры в этой работе были адаптированы из нашей предыдущей публикации «ARF6-Rac1 сигнально-опосредованный рост нейритов потенцируется нейронным адаптером FE65 посредством оркестровки ARF6 и ELMO1», опубликованной в журнале FASEB в октябре 2020 года.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).
