Summary
Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo para preparar endossóis de reciclagem de células mamíferas usando ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose.
Abstract
O tráfico endossomal é um processo celular essencial que regula uma ampla gama de eventos biológicos. As proteínas são internalizadas da membrana plasmática e depois transportadas para os endossómos iniciais. As proteínas internalizadas podem ser transitadas para o lysosome para degradação ou recicladas de volta à membrana plasmática. Uma via robusta de reciclagem endócítica é necessária para equilibrar a remoção de materiais de membrana da endocitose. Várias proteínas são relatadas para regular a via, incluindo o fator de ribossiation ADP 6 (ARF6). A ultracentrifugação gradiente de densidade é um método clássico para fracionamento celular. Após a centrifugação, organelas são sedimentadas em sua superfície isopécnica. As frações são coletadas e usadas para outras aplicações a jusante. Descrito aqui é um protocolo para obter uma fração contendo endosome de células de mamíferos transfectadas usando ultracentrifugação de gradiente de densidade. As frações isoladas foram submetidas à mancha ocidental padrão para analisar seu conteúdo proteico. Ao utilizar este método, identificamos que o direcionamento da membrana plasmática do engolfamento e da motilidade celular 1 (ELMO1), um substrato de toxina botulínica C3 relacionado a Ras 1 (Rac1) fator de troca de nucleotídeos de guanina, é através da reciclagem endocítica mediada por ARF6.
Introduction
O tráfico endossomal é um processo fisiológico essencial que implica vários eventos biológicos1, por exemplo, o transporte de receptores de sinalização, canais de íons e moléculas de adesão. Proteínas localizadas na membrana plasmática são internalizadas por endocitose2. As proteínas internalizadas são então classificadas pelo endosommaprecoce 3. Algumas das proteínas são direcionadas para lisesomos para degradação4. No entanto, uma quantidade significativa de proteínas são recicladas de volta à superfície celular por processos de reciclagem rápidos e lentas. Na reciclagem rápida, as proteínas deixam os endossos precoces e retornam diretamente à membrana plasmática. Por outro lado, na reciclagem lenta, as proteínas são primeiramente classificadas ao compartimento de reciclagem endóctico e depois transportadas de volta para a membrana plasmática. Várias proteínas de carga, por exemplo, clathrin, complexo retromer, complexo de recuperador e proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich, e complexo SCAR Homologue (WASH), participam desses processos de reciclagem demembranas 4,5,6,7,8,9. O equilíbrio do evento de endocitose e reciclagem é crucial para a sobrevivência celular e contribui para diversos eventos celulares10, por exemplo, adesão celular, migração celular, polaridade celular e transdução de sinais.
ARF6, um pequeno GTPase, é um regulador relatado de tráfico endocítico7,11,12. De interesse, diversos grupos de pesquisa ilustraram a importância da ARF6 na reciclagem endocítica13,14,15,16,17. O estudo tem como objetivo investigar a relação entre o crescimento de neurite mediado pela ARF6 e a reciclagem endócítica. O relatório anterior sugere que a ativação do ARF6 é upstream para a atividade Rac1 através da atuação no complexo18(DOCK180) do ELMO1 . No entanto, ainda não está claro como o ARF6 aciona a sinalização rac1 mediada do ELMO1-DOCK180. A ultracentrifugação de gradiente de densidade foi empregada para investigar o papel da reciclagem endocítica mediada por ARF6 nesse processo. Com isso, a fração contendo endosome de reciclagem foi obtida a partir de lises celulares19. A fração foi submetida à mancha ocidental para análise de teor de proteínas. Os resultados do imunoblot revelaram que sob a presença de FE65, uma proteína adaptadora enriquecida pelo cérebro, a ARF6 ativa aumentou substancialmente o nível de ELMO1 na fração contendo endosome de reciclagem. O protocolo a seguir inclui os procedimentos para (1) transfecção de células mamíferas; (2) elaboração das amostras e colunas gradientes de densidade; e (3) obtenção da fração contendo endosome de reciclagem.
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Protocol
1. Cultura e transfecção de células mamíferas
- Placa 2 x 106 células em um prato de cultura de 100 mm. Use quatro pratos para cada transfecção.
NOTA: O número de células necessárias pode variar para diferentes linhas celulares. A otimização pode ser necessária antes de prosseguir para a etapa de isolamento. - No dia seguinte, transfete as células com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante.
2. Colheita celular
- Descarte o meio de cultura 48 h pós-transfecção.
- Lave as células com PBS gelado (fosfatos de sódio de 10 mM, cloreto de potássio de 2,68 mM, cloreto de sódio de 140 mM) duas vezes.
- Adicione 1 mL de PBS gelado+ (PBS complementado com coquetel inibidor de protease 0,5x e coquetel inibidor de fosfatase de 0,5x) a cada prato.
- Colete as células com um raspador de células e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Pelota as células por centrifugação usando um rotor de balde de balanço a 400 x g por 5 min.
- Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular suavemente em 5 mL de tampão de homogeneização (HB; 250 mM de sacarose, 3 mM imidazol no pH 7.4, 1 mM EDTA complementado com 0,03 mM cicloheximida, coquetel inibidor de protefase 1xase e 1xxphosphatase inibidor).
- Colete as células por centrifugação a 1.300 x g por 10 min.
- Resuspense a pelota de célula em 1 mL de HB.
- Homogeneize as células com um homogeneizador do Dounce para 15-20 derrames.
NOTA: Outros métodos de homogeneização, por exemplo, passando a amostra através de uma seringa, poderiam ser utilizados. A eficiência de homogeneização poderia ser revelada observando o homogeneizado sob um microscópio de contraste de fase. - Transfira o homogeneizar para um tubo de centrifugação de 2 mL.
NOTA: Colher 50 μL de homogeneizar com 12,5 μL de tampão de amostra de 5x e rotulá-lo como total lysate. - Adicione 0,7 mL de HB ao homogeneizar.
- Gire o homogenate diluído a 2.000 x g por 10 min a 4 °C.
NOTA: A pelota contém núcleos e células ininterruptas. - Colete 1,5 mL do supernaspe e repita o passo 2.12 uma vez.
- Colete 1,4 mL do supernante e rotule-o como supernante pós-nuclear (PNS).
3. Preparação da coluna de gradiente de densidade
- Transfira 1,2 mL de PNS para um tubo ultracentrífuga.
- Adicione 1 mL de solução de sacarose de 62% (2,351 M de sacarose, 3 mM de imidazol no pH 7.4) à amostra e misture bem por tubulação suave.
NOTA: A solução resultante é uma solução de sacarose de 40,6%. - Adicione 3,3 mL de solução de sacarose de 35% (1,177 M de sacarose, 3 mM imidazol no pH 7.4) cuidadosamente em cima da amostra.
- Adicione 2,2 mL de solução de sacarose de 25% (0,806 M de sacarose, 3 mM imidazol no pH 7.4) cuidadosamente em cima da solução de 35% de sacarose.
NOTA: O índice refrativo das soluções de sacarose de 62%, 40,6%, 35% e 25% à temperatura ambiente são 1,44, 1,40, 1,39 e 1,37, respectivamente. Os índices refrativos das soluções de sacarose poderiam ser verificados com um refratômetro para garantir a precisão e consistência do experimento. - Encha o tubo de ultracentrifugação com HB.
NOTA: Armazene temporariamente a coluna de gradiente de densidade preparada a 4 °C.
4. Fracionamento e recuperação da fração contendo endosome de reciclagem
- Centrifugar a coluna a 210.000 x g por 3 h a 4 °C.
- Colete 12 frações (1 mL cada) cuidadosamente, começando a partir da parte superior do gradiente.
NOTA: Os endossomos de reciclagem devem ser encontrados na interface entre 35% e 25% de soluções de sacarose. As frações coletadas podem ser congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C. - Diluir todas as frações com 1 mL de tampão de diluição (3 mM imidazol em pH 7,4, 1 mM EDTA).
- Centrifugar a amostra diluída a 100.000 x g por 1 h a 4 °C.
- Aspire o supernasal e adicione 50 μL de tampão de amostra de 1x para colher as frações.
- Analise o conteúdo da proteína nas frações por manchas ocidentais.
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Representative Results
Após fracionar as células HEK293 não traduzidas por ultracentrifugação gradiente de densidade, 12 frações foram coletadas a partir do topo do gradiente. As frações colhidas foram diluídas com o tampão de diluição em uma razão de 1:1 e submetidas a uma segunda rodada de centrifugação. As amostras foram então submetidas a manchas ocidentais para análise de seu conteúdo proteico. Como mostrado na Figura 1,o marcador de reciclagem endosome Rab11 é detectado na fração 720. Outros marcadores subcelulares, incluindo β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 e Lamp1, também foram sondados. Um sinal EEE1 positivo também é detectado na fração 7. As intensidades da banda de GAPDH, COX IV e Rab11 na fração 7 e PNS foram medidas com o software ImageLab (Bio-Rad). As razões de intensidade dos marcadores na fração 7 para PNS foram calculadas e expressas em um gráfico de barras ± SD.
Os estudos anteriores sugerem que arf6 e a ELMO1 interagem com a FE65 para promover o crescimento de neurite mediado pela Rac121,22. Uma vez que a ARF6 é um regulador de reciclagem endocítica e a segmentação da membrana plasmática ELMO1 é fundamental para a ativação subsequente da Rac1, é a hipótese de que fe65 conecta ARF6 e ELMO1 para mediar o tráfico de ELMO1 para a membrana plasmática. Por isso, este método foi utilizado para investigar o nível ELMO1 nos endossolas de reciclagem isolados. As células HEK293 foram transfeinadas com ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, ou ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65. Não foram encontradas alterações na distribuição ELMO1 com superexpressão ARF6 Q67L e FE65(Figura 2A). Em seguida, o nível ELMO1 na fração 7 (Rab11-positivo) foi comparado entre diferentes transfecções. A quantidade de ELMO1 na fração é encontrada para elevar após a co-transfecção de ARF6 Q67L. Observa-se um aumento adicional no nível ELMO1 quando tanto a ARF6 Q67L quanto a FE65 são co-expressos(Figura 2B). Por outro lado, o nocaute do FE65 diminuiu o enriquecimento ELMO1 mediado por ARF6 na fração 7 (Figura 2C).
Figura 1: Os endosários de reciclagem são encontrados na fração 7 após a ultracentrifugação do gradiente de densidade. As células HEK293 não transtravadas foram fracionadas e os conteúdos proteicos nas frações obtidas foram analisados com manchas ocidentais. Rab11 é detectado na fração 7 com um anticorpo anti-Rab11 (1:500). Outros marcadores subcelulares foram detectados com seus anticorpos específicos, incluindo β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10.000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500) e Lamp1 (1:1000). A fração 1 é a fração superior menos densa, enquanto a fração 12 é a fração inferior mais densa. O gráfico de barras mostra a razão de GAPDH, COX IV e Rab11 na fração 7 para PNS ± SD. Este número foi modificado de Chan, W. W. R. et al.22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão de FE65 promove reciclagem endocítica mediada por ARF6 de ELMO1. (A) As células transfeinadas com ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L ou ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 foram fracionadas usando ultracentrização de gradiente de densidade. Todas as frações foram submetidas a manchas ocidentais para análise das distribuições de ELMO1, ARF6 Q67L e FE65. A fração 1 é a fração superior menos densa, enquanto a fração 12 é a fração inferior mais densa. (B) A fração Rab11-positiva 7 de diferentes transfecções foi analisada com manchas ocidentais para avaliar os níveis de ELMO1 e ARF6 Q67L. A quantidade de ELMO1 na fração 7 foi elevada quando as células estavam co-transfeitando com ARF6 Q67L. A co-expressão de ARF6 Q67L e FE65 aumenta ainda mais a quantidade de ELMO1 na fração. (C) O wildtype HEK293 foi transfeinado com ELMO1 ou ELMO1 + ARF6 Q67L, enquanto FE65 KO HEK293 foi transfeinado com ELMO1 + ARF6 Q67L. O enriquecimento ELMO1 mediado arf6 na fração 7 diminuiu significativamente nas células KO FE65. (B-C) Foram sondados o marcador de endossola de reciclagem Rab11 (1:500) e o marcador de citosol GAPDH (1:10.000). ELMO1, FE65 e ARF6 Q67L foram detectados com anti-ELMO1 B-7 (1:1000), anti-FE65 E-20 (1:1000) e anti-myc 9B11 (1:5000), respectivamente. O nível relativo de ELMO1 na fração 7 foi expresso como a razão densitométrica do ELMO1 na fração 7/total ELMO1. Os dados do gráfico de barras foram obtidos a partir de três experimentos independentes. Anova unidirecional com teste pós hoc Bonferroni foi empregado para análise estatística. *p < 0,001. Os resultados são mudanças médias de dobra ± SD22. Este número foi modificado de Chan, W. W. R. et al.22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo acima descreve os procedimentos para isolar a reciclagem de endossóis de células cultivadas por ultracentrifugação. A confiabilidade desse método foi demonstrada pela últimapublicação 22, comprovando que os endosários de reciclagem são isolados com sucesso de outras organelas (Figura 1),como o aparelho golgi e mitocôndrias. Alguns passos críticos precisam ser atentos para obter um bom resultado de separação. Ao preparar as soluções de sacarose, recomenda-se validar os índices refrativos das soluções com um refratômetro. O índice refrativo das soluções de sacarose de 62%, 35% e 25% à temperatura ambiente são 1,44, 1,39 e 1,37, respectivamente. Além disso, as bolhas de ar devem ser evitadas a partir do gradiente. A presença de bolhas na coluna pode interromper a continuidade do gradiente. Os detergentes devem ser evitados no processo de homogeneização, pois danificam a membrana das organelas. Isso leva à liberação de proteínas de organelas ligadas à membrana e pode resultar em contaminação severa. Além disso, todas as ferramentas de homogeneização devem ser pré-resfriadas antes de serem usada para evitar a degradação da proteína durante a homogeneização. Uma vez preparado o gradiente, ele deve ser usado o mais rápido possível. Embora o gradiente preparado possa ser armazenado temporariamente a 4 °C (1-2 h), o armazenamento prolongado pode interferir no gradiente de densidade devido à difusão.
Sacarose é um meio gradiente amplamente utilizado devido à sua fácil disponibilidade. Na verdade, existem muitas outras alternativas, incluindo Percoll e Ficoll-40023,24. Esses meios têm propriedades físicas diferentes quando comparadas com a sacarose. Por exemplo, Percoll tem menor osmolaridade e viscosidade do que sacarose. Estes permitem a rápida agrupamento de partículas usando forças centrífugas inferiores. Ficoll-400 tem uma menor permeabilidade em relação às membranas do que a sacarose devido ao seu alto peso molecular e baixo teor de material dialízível. Portanto, a alteração do gradiente médio pode alcançar uma maior eficiência de isolamento endosso.
Além da ultracentrifugação de gradiente de densidade, outros métodos podem ser usados para fracionamento celular, incluindo eletroforese de fluxo livre (FFE)25,classificação organela ativada por fluorescência (FAOS)26e imunosolação27. FFE é um método de separação de fase líquida. A amostra flui através do tampão de separação sob a influência de um campo elétrico perpendicular à direção de fluxo. Os níveis de deflexão de diferentes organelas variam de acordo com suas cargas superficiais25. A FAOS geralmente usa uma etiqueta fluorescente ou anticorpo para rotular organela específica e, em seguida, seguida por citometria de fluxo para o isolamento28,29. A imunosolação baseia-se na detecção de antígenos específicos na superfície da organela alvo e posterior precipitação por anticorpos30.
Ao comparar com essas alternativas, a ultracentrifugação gradiente de densidade tem suas próprias vantagens. Em primeiro lugar, um perfil de distribuição da proteína interessada pode ser obtido realizando manchas ocidentais com as frações isoladas (Figura 2A). Qualquer alteração na localização subcelular de proteínas poderia ser facilmente detectada. Além disso, a ultracentrifuge é um instrumento padrão na maioria dos institutos, e a exigência técnica para operar a centrífuga é baixa. Em contraste, um citómetro de fluxo e um sistema específico de eletroforese são necessários para o processo de isolamento da FAOS e da FFE, respectivamente. Não há equipamento específico necessário para a imunosolação. No entanto, é usado principalmente para isolar endossómos de um pequeno número de células. A escala de preparação da ultracentrifugação é maior que a da imunosolação. Além disso, um anticorpo com alta especificidade é necessário para a imunosolação31. Além disso, o tampão contendo detergente e alto sal não pode ser usado nas etapas de lavagem para garantir a integridade dos endósmosos. Isso pode levar a um alto fundo e reduzir a pureza da organela isolada31.
Uma vez que a ultracentrifugação de gradiente de densidade separa organelas baseadas na densidade, sua limitação mais significativa é a de resolver o poder em direção a organelas com densidade semelhante. Como mostrado na Figura 1,tanto Rab11 quanto EEE1 são detectados na fração 7 devido às propriedades físicas similares da reciclagem e dos endossários precoces. Outros ensaios são necessários para confirmar as mudanças no nível da proteína alvo no endosomhável de reciclagem. No estudo anterior, a co-imunossumamento em ELMO1 e Rab11 foi realizada nas células22. Além de realizar outros ensaios, algumas medidas podem ser adotadas para superar esse problema. Um gradiente de densidade contínua pode resolver organelas com pequenas diferenças de densidade32. No entanto, o rendimento em um gradiente contínuo é significativamente menor do que o de um gradiente descontínuo. É possível manipular a densidade do endosome pré-tratamento das células com contas de látex33. As contas são internalizadas pelas células através da endocitose. A densidade das contas contendo endósmosos é significativamente reduzida e pode ser separada de outras organelas. Normalmente, adicionar outro nível de isolamento poderia melhorar significativamente o isolamento de organelas com densidades semelhantes. Por exemplo, realize a imunosolação da fração isolada34. Usando um anticorpo específico, os endosses de reciclagem podem ser separados dos contaminantes. Anticorpos e sondas com rótulo fluorescente, combinados com análise de citometria de fluxo, também podem ser usados para um isolamento endosomado preciso28. FFE também é aplicável para separar organelas com densidades semelhantes com base em sua carga superficial25.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por fundos do Research Grants Council Hong Kong, cuhk direct grant scheme, United College endowment fund, e tuyf Charitable Trust. Os números deste trabalho foram adaptados de nossa publicação anterior, "ARF6-Rac1- a propagação de neurite mediada por sinalização é potencializado pelo adaptador neuronal FE65 através da orquestração ARF6 e ELMO1" publicada no FASEB Journal em outubro de 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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