Summary
Dieser Beitrag zielt darauf ab, ein Protokoll zur Herstellung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen unter Verwendung der Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation vorzustellen.
Abstract
Der endosomale Transport ist ein essentieller zellulärer Prozess, der eine breite Palette biologischer Ereignisse reguliert. Proteine werden aus der Plasmamembran internalisiert und dann zu den frühen Endosomen transportiert. Die internalisierten Proteine könnten zum Abbau in das Lysosom überführt oder zur Plasmamembran zurückgeführt werden. Ein robuster endozytärer Recyclingweg ist erforderlich, um die Entfernung von Membranmaterialien aus der Endozytose auszugleichen. Es wird berichtet, dass verschiedene Proteine den Signalweg regulieren, einschließlich ADP-Ribosylierungsfaktor 6 (ARF6). Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ist eine klassische Methode zur Zellfraktionierung. Nach der Zentrifugation werden Organellen an ihrer isopyknen Oberfläche sedimentiert. Die Fraktionen werden gesammelt und für andere nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschrieben ist ein Protokoll zur Gewinnung einer Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion aus transfizierten Säugetierzellen mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Die isolierten Fraktionen wurden zur Analyse ihres Proteingehalts einem Standard-Western-Blotting unterzogen. Durch die Anwendung dieser Methode identifizierten wir, dass die Plasmamembran, die auf Engulfment und Zellmotilität 1 (ELMO1), einen Ras-verwandten C3-Botulinumtoxin-Substrat 1 (Rac1) Guanin-Nukleotidaustauschfaktor, abzielt, durch ARF6-vermitteltes endozytäres Recycling erfolgt.
Introduction
Der endosomale Transport ist ein essentieller physiologischer Prozess, der verschiedene biologische Ereignisse1impliziert, z. B. den Transport von Signalrezeptoren, Ionenkanälen und Adhäsionsmolekülen. Proteine, die an der Plasmamembran lokalisiert sind, werden durch Endozytoseinternalisiert 2. Die internalisierten Proteine werden dann nach dem frühen Endosom3sortiert. Einige der Proteine zielen auf Lysosomen zum Abbau ab4. Eine beträchtliche Menge an Proteinen wird jedoch durch schnelles Recycling und langsame Recyclingprozesse wieder auf die Zelloberfläche zurückgeführt. Beim schnellen Recycling verlassen Proteine die frühen Endosomen und kehren direkt zur Plasmamembran zurück. Umgekehrt werden beim langsamen Recycling Proteine zunächst in das endozytäre Recyclingkompartiment sortiert und dann zurück zur Plasmamembran transportiert. Verschiedene Frachtproteine, zum Beispiel Clathrin, Retromerkomplex, Retrieverkomplex und Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein sowie SCAR Homologue (WASH) -Komplex, nehmen an solchen Membranrecyclingprozessenteil 4,5,6,7,8,9. Das Gleichgewicht der Endozytose und des Recyclingereignisses ist entscheidend für das Überleben der Zelle und trägt zu verschiedenen zellulären Ereignissen10bei, z. B. Zelladhäsion, Zellmigration, Zellpolarität und Signaltransduktion.
ARF6, eine kleine GTPase, ist ein berichteter Regulator des endozytären Transports7,11,12. Interessant ist, dass verschiedene Forschungsgruppen die Bedeutung von ARF6 für das endozytäre Recycling13,14,15,16,17aufgezeigthaben. Die Studie zielt darauf ab, den Zusammenhang zwischen ARF6-vermitteltem Neuritenauswuchs und endozytärem Recycling zu untersuchen. Der vorherige Bericht legt nahe, dass die Aktivierung von ARF6 der Rac1-Aktivität vorgelagert ist, indem sie auf den ELMO1-Dedikator des Zytokinese-1-Komplexes (DOCK180)18einwirkt. Wie ARF6 jedoch die ELMO1-DOCK180-vermittelte Rac1-Signalisierung auslöst, bleibt unklar. Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurde eingesetzt, um die Rolle des ARF6-vermittelten endozytären Recyclings in einem solchen Prozess zu untersuchen. Auf diese Weise wurde die Recycling-Endosomen-haltige Fraktion aus Zelllysaten19erhalten. Die Fraktion wurde für die Proteingehaltsanalyse einem Western Blotting unterzogen. Die Immunoblot-Ergebnisse zeigten, dass unter Der Anwesenheit von FE65, einem mit dem Gehirn angereicherten Adapterprotein, aktives ARF6 den Gehalt an ELMO1 in der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion erheblich erhöhte. Das folgende Protokoll enthält die Verfahren für (1) die Transfektionierung von Säugetierzellen; (2) Vorbereitung der Proben und Dichtegradientensäulen; und (3) Gewinnung der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion.
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Protocol
1. Zellkultur und Transfektion von Säugetieren
- Platte 2 x 106 Zellen in einer 100 mm Kulturschale. Verwenden Sie vier Gerichte für jede Transfektion.
HINWEIS: Die Anzahl der benötigten Zellen kann für verschiedene Zelllinien variieren. Möglicherweise ist eine Optimierung erforderlich, bevor Sie mit dem Isolationsschritt fortfahren. - Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit Lipofektamin gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Zellernte
- Entsorgen Sie das Kulturmedium 48 h nach der Transfektion.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS (10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid).
- Fügen Sie 1 ml eiskaltes PBS+ (PBS ergänzt mit 0,5x Protease-Inhibitor-Cocktail und 0,5x Phosphatase-Inhibitor-Cocktail) zu jedem Gericht hinzu.
- Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation mit einem Schwenklöffelrotor bei 400 x g für 5 min.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 5 ml Homogenisierungspuffer (HB; 250 mM Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4, 1 mM EDTA ergänzt mit 0,03 mM Cycloheximid, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail und 1x Phosphatase-Inhibitor-Cocktail).
- Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.300 x g für 10 min.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml HB.
- Homogenisieren Sie die Zellen mit einem Dounce-Homogenisator für 15-20 Hübe.
ANMERKUNG: Andere Homogenisierungsmethoden, z. B. das Durchlaufen der Probe durch eine Spritze, könnten verwendet werden. Die Homogenisierungseffizienz konnte durch die Beobachtung des Homogenats unter einem Phasenkontrastmikroskop aufgedeckt werden. - Das Homogenat wird in ein 2 ml Zentrifugationsröhrchen überführt.
HINWEIS: Ernten Sie 50 μL Homogenat mit 12,5 μL 5x Probenpuffer und markieren Sie es als Gesamtlysat. - Dem Homogenat werden 0,7 ml HB zugegeben.
- Das verdünnte Homogenat bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C drehen.
HINWEIS: Das Pellet enthält Kerne und ungebrochene Zellen. - Sammeln Sie 1,5 ml des Überstandes und wiederholen Sie Schritt 2.12 einmal.
- Sammeln Sie 1,4 ml des Überstandes und kennzeichnen Sie ihn als postnuklearen Überstand (PNS).
3. Vorbereitung der Dichtegradientensäule
- Übertragen Sie 1,2 ml PNS in ein Ultrazentrifugenröhrchen.
- 1 mL 62%ige Saccharoselösung (2,351 M Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4) in die Probe geben und durch schonendes Pipettieren gut mischen.
HINWEIS: Die resultierende Lösung ist eine 40,6% ige Saccharoselösung. - 3,3 ml 35%ige Saccharoselösung (1,177 M Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4) vorsichtig auf die Probe geben.
- 2,2 ml 25%ige Saccharoselösung (0,806 M Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4) vorsichtig auf die 35%ige Saccharoselösung geben.
ANMERKUNG: Der Brechungsindex der 62%, 40,6%, 35% und 25% Saccharoselösungen bei Raumtemperatur beträgt 1,44, 1,40, 1,39 bzw. 1,37. Die Brechungsindizes der Saccharoselösungen konnten mit einem Refraktometer überprüft werden, um die Präzision und Konsistenz des Experiments sicherzustellen. - Füllen Sie das Ultrazentrifugationsrohr mit HB auf.
HINWEIS: Die vorbereitete Dichtegradientensäule wird bei 4 °C zwischengespeichert.
4. Fraktionierung und Rückgewinnung von Recycling-Endosomen-haltigen Fraktionen
- Zentrifugieren Sie die Säule bei 210.000 x g für 3 h bei 4 °C.
- Sammeln Sie 12 Fraktionen (je 1 ml) sorgfältig, beginnend von der Spitze des Gradienten.
HINWEIS: Die Recycling-Endosomen sollten an der Grenzfläche zwischen 35% und 25% Saccharoselösungen gefunden werden. Die gesammelten Fraktionen können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert werden. - Verdünnen Sie alle Fraktionen mit 1 ml Verdünnungspuffer (3 mM Imidazol bei pH 7,4, 1 mM EDTA).
- Zentrifugieren Sie die verdünnte Probe bei 100.000 x g für 1 h bei 4 °C.
- Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 50 μL 1x Probenpuffer hinzu, um die Fraktionen zu ernten.
- Analysieren Sie den Proteingehalt in den Fraktionen durch Western Blotting.
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Representative Results
Nach der Fraktionierung der nicht transfizierten HEK293-Zellen durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurden 12 Brüche von der Spitze des Gradienten gesammelt. Die geernteten Fraktionen wurden mit dem Verdünnungspuffer im Verhältnis 1:1 verdünnt und einer zweiten Zentrifugationsrunde unterzogen. Die Proben wurden dann einem Western Blotting unterzogen, um ihren Proteingehalt zu analysieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt,wird der Recycling-Endosomenmarker Rab11 in Fraktion 720nachgewiesen. Andere subzelluläre Marker, darunter β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 und Lamp1, wurden ebenfalls untersucht. Ein positives EEA1-Signal wird auch in Fraktion 7 erkannt. Die Bandintensitäten von GAPDH, COX IV und Rab11 sowohl in Fraktion 7 als auch in PNS wurden mit der ImageLab-Software (Bio-Rad) gemessen. Die Intensitätsverhältnisse der Marker in Fraktion 7 zu PNS wurden berechnet und in einem Balkendiagramm ± SD ausgedrückt.
Die früheren Studien deuten darauf hin, dass ARF6 und ELMO1 mit FE65 interagieren, um rac1-vermitteltes Neuritenwachstum zu fördern21,22. Da ARF6 ein Regulator des endozytären Recyclings ist und das ElMO1-Plasmamembran-Targeting für die nachfolgende Rac1-Aktivierung entscheidend ist, wird angenommen, dass FE65 ARF6 und ELMO1 verbindet, um den Transport von ELMO1 zur Plasmamembran zu vermitteln. Daher wurde diese Methode verwendet, um den ELMO1-Spiegel in den isolierten Recycling-Endosomen zu untersuchen. HEK293-Zellen wurden entweder mit ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L oder ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 transfiziert. Es wurden keine Veränderungen in der ELMO1-Verteilung mit ARF6 Q67L- und FE65-Überexpression gefunden (Abbildung 2A). Als nächstes wurde der ELMO1-Spiegel in Fraktion 7 (Rab11-positiv) zwischen verschiedenen Transfektionen verglichen. Es wird festgestellt, dass die Menge an ELMO1 in der Fraktion nach der Co-Transfektion von ARF6 Q67L erhöht ist. Ein weiterer Anstieg des ELMO1-Spiegels wird beobachtet, wenn sowohl ARF6 Q67L als auch FE65 koexprimiert werden (Abbildung 2B). Umgekehrt verringerte der Knockout von FE65 die ARF6-vermittelte ELMO1-Anreicherung in Fraktion 7 (Abbildung 2C).
Abbildung 1: Recycling-Endosomen finden sich in Fraktion 7 nach Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Nicht transfizierte HEK293-Zellen wurden fraktioniert und die Proteingehalte in den erhaltenen Fraktionen mit Western Blotting analysiert. Rab11 wird in Fraktion 7 mit einem Anti-Rab11-Antikörper (1:500) nachgewiesen. Andere subzelluläre Marker wurden mit ihren spezifischen Antikörpern nachgewiesen, darunter β-COP (1:1000), COX IV (1:1000), GAPDH (1:10.000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500) und Lamp1 (1:1000). Bruch 1 ist die weniger dichte obere Fraktion, während Fraktion 12 die dichtere untere Fraktion ist. Das Balkendiagramm zeigt das Verhältnis von GAPDH, COX IV und Rab11 in Fraktion 7 zu PNS ± SD. Diese Zahl wurde modifiziert von Chan, W. W. R. et al.22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Expression von FE65 fördert das ARF6-vermittelte endozytäre Recycling von ELMO1. (A) Die Zellen, die entweder mit ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L oder ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 transfiziert wurden, wurden mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation fraktioniert. Alle Fraktionen wurden einem Western Blotting unterzogen, um die Verteilungen von ELMO1, ARF6 Q67L und FE65 zu analysieren. Bruch 1 ist die weniger dichte obere Fraktion, während Fraktion 12 die dichtere untere Fraktion ist. (B) Die Rab11-positive Fraktion 7 aus verschiedenen Transfektionen wurde mit Western Blotting analysiert, um die Spiegel von ELMO1 und ARF6 Q67L zu bewerten. Die Menge an ELMO1 in Fraktion 7 war erhöht, als die Zellen mit ARF6 Q67L kotransfizierten. Die Co-Expression von ARF6 Q67L und FE65 erhöht die Menge an ELMO1 in der Fraktion weiter. (C) Der Wildtyp HEK293 wurde mit ELMO1 oder ELMO1 + ARF6 Q67L transfiziert, während FE65 KO HEK293 mit ELMO1 + ARF6 Q67L transfiziert wurde. Die ARF6-vermittelte ELMO1-Anreicherung in Fraktion 7 nahm in FE65-KO-Zellen signifikant ab. (B-C) Der Recycling-Endosomenmarker Rab11 (1:500) und der Zytosolmarker GAPDH (1:10.000) wurden untersucht. ELMO1, FE65 und ARF6 Q67L wurden mit Anti-ELMO1 B-7 (1:1000), Anti-FE65 E-20 (1:1000) bzw. Anti-Myc 9B11 (1:5000) nachgewiesen. Das relative Niveau von ELMO1 in Fraktion 7 wurde als densitometrisches Verhältnis des ELMO1 in Fraktion 7/Gesamt-ELMO1 ausgedrückt. Die Daten für das Balkendiagramm wurden aus drei unabhängigen Experimenten gewonnen. Für die statistische Analyse wurde eine Einweg-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test verwendet. *p < 0,001. Die Ergebnisse sind der mittlere Faltenwechsel ± SD22. Diese Zahl wurde modifiziert von Chan, W. W. R. et al.22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das obige Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung von Recycling-Endosomen aus kultivierten Zellen durch Ultrazentrifugation. Die Zuverlässigkeit dieser Methode wurde durch die neueste Veröffentlichung22nachgewiesen, die beweist, dass Recycling-Endosomen erfolgreich aus anderen Organellen (Abbildung 1) wie dem Golgi-Apparat und den Mitochondrien isoliert werden. Einige kritische Schritte müssen beachtet werden, um ein gutes Trennergebnis zu erzielen. Bei der Herstellung der Saccharoselösungen wird empfohlen, die Brechungsindizes der Lösungen mit einem Refraktometer zu validieren. Der Brechungsindex der 62%, 35% und 25% Saccharoselösungen bei Raumtemperatur beträgt 1,44, 1,39 bzw. 1,37. Auch Luftblasen sollten durch das Gefälle vermieden werden. Das Vorhandensein von Blasen in der Säule kann die Kontinuität des Gradienten stören. Detergenzien sollten im Homogenisierungsprozess vermieden werden, da sie die Membran von Organellen schädigen. Dies führt zur Freisetzung von Proteinen aus membrangebundenen Organellen und könnte zu einer schweren Kontamination führen. Außerdem sollten alle Homogenisierungswerkzeuge vor dem Gebrauch vorgekühlt werden, um einen Proteinabbau während der Homogenisierung zu vermeiden. Sobald der Gradient vorbereitet ist, sollte er so schnell wie möglich verwendet werden. Obwohl der hergestellte Gradient bei 4 °C (1-2 h) zwischengespeichert werden konnte, kann eine längere Lagerung den Dichtegradienten aufgrund der Diffusion stören.
Saccharose ist aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit ein weit verbreitetes Gradientenmedium. In der Tat gibt es viele andere Alternativen, einschließlich Percoll und Ficoll-40023,24. Diese Medien haben im Vergleich zu Saccharose unterschiedliche physikalische Eigenschaften. Zum Beispiel hat Percoll eine niedrigere Osmolarität und Viskosität als Saccharose. Diese ermöglichen eine schnelle Banderolierung von Partikeln mit geringeren Fliehkräften. Ficoll-400 hat aufgrund seines hohen Molekulargewichts und seines geringen Gehalts an dialysierbarem Material eine geringere Permeabilität gegenüber Membranen als Saccharose. Daher kann durch den Wechsel des Gradientenmediums eine höhere Endosomenisolationseffizienz erreicht werden.
Neben der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation können andere Methoden zur Zellfraktionierung verwendet werden, einschließlich der Free-Flow-Elektrophorese (FFE)25,der fluoreszenzaktivierten Organellensortierung (FAOS)26und der Immunisolation27. FFE ist ein Flüssigphasentrennverfahren. Die Probe durchströmt den Trennpuffer unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes senkrecht zur Strömungsrichtung. Die Auslenkungsgrade verschiedener Organellen variieren je nach ihren Oberflächenladungen25. FAOS verwendet normalerweise einen fluoreszierenden Tag oder Antikörper, um spezifische Organelle zu markieren, und gefolgt von einer Durchflusszytometrie für die Isolierung28,29. Die Immunisolation beruht auf dem Nachweis spezifischer Antigene auf der Oberfläche der Zielorganelle und der anschließenden Fällung durch Antikörper30.
Im Vergleich zu diesen Alternativen hat die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ihre eigenen Vorteile. Zunächst kann ein Verteilungsprofil des interessierten Proteins durch Western Blotting mit den isolierten Fraktionen erhalten werden (Abbildung 2A). Alle Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Proteinen konnten leicht nachgewiesen werden. Auch die Ultrazentrifuge ist in den meisten Instituten ein Standardinstrument, und die technischen Anforderungen für den Betrieb der Zentrifuge sind gering. Im Gegensatz dazu werden für den Isolationsprozess von FAOS bzw. FFE ein Durchflusszytometer und ein spezifisches Elektrophoresesystem benötigt. Für die Immunisolation ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich. Es wird jedoch hauptsächlich zur Isolierung von Endosomen aus einer kleinen Anzahl von Zellen verwendet. Die Vorbereitungsskala der Ultrazentrifugation ist größer als die der Immunisolation. Außerdem ist ein Antikörper mit hoher Spezifität für die Immunisolierung31notwendig. Des Weiteren können in den Waschschritten kein waschmittel- und salzhaltiger Puffer verwendet werden, um die Integrität der Endosomen zu gewährleisten. Dies kann zu einem hohen Hintergrund führen und die Reinheit der isolierten Organelleverringern 31.
Da die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation Organellen basierend auf der Dichte trennt, besteht ihre bedeutendste Einschränkung darin, das Auflösungsvermögen in Richtung Organellen mit ähnlicher Dichte aufzulösen. Wie in Abbildung 1gezeigt, werden sowohl Rab11 als auch EEA1 aufgrund der ähnlichen physikalischen Eigenschaften von Recycling und frühen Endosomen in Fraktion 7 nachgewiesen. Weitere Assays sind erforderlich, um die Veränderungen des Gehalts des Zielproteins im Recycling-Endosom zu bestätigen. In der vorherigen Studie wurde die Co-Immunfärbung auf ELMO1 und Rab11 in den Zellen22durchgeführt. Zusätzlich zur Durchführung anderer Assays können einige Maßnahmen ergriffen werden, um dieses Problem zu lösen. Ein kontinuierlicher Dichtegradient kann Organellen mit geringfügigen Dichteunterschieden auflösen32. Die Ausbeute bei einem kontinuierlichen Gradienten ist jedoch deutlich geringer als bei einem diskontinuierlichen Gradienten. Es ist möglich, die Dichte des Endosoms zu manipulieren, indem die Zellen mit Latexperlen vorbehandelt werden33. Die Kügelchen werden von den Zellen über Endozytose verinnerlicht. Die Dichte der Endosomen enthaltenden Kügelchen ist deutlich reduziert und kann von anderen Organellen getrennt werden. Normalerweise könnte das Hinzufügen einer weiteren Isolationsebene die Isolierung von Organellen mit ähnlichen Dichten signifikant verbessern. Führen Sie beispielsweise eine Immunisolation aus der isolierten Fraktion34durch. Durch den Einsatz eines spezifischen Antikörpers können Recycling-Endosomen von den Verunreinigungen getrennt werden. Fluoreszenzmarkierte Antikörper und Sonden in Kombination mit einer Durchflusszytometrie-Analyse könnten auch für die präzise Endosomenisolierung verwendet werden28. FFE ist auch anwendbar für die Trennung von Organellen mit ähnlichen Dichten basierend auf ihrer Oberflächenladung25.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Research Grants Council Hong Kong, des CUHK Direct Grant Scheme, des United College Endowment Fund und des TUYF Charitable Trust unterstützt. Die Zahlen in dieser Arbeit wurden aus unserer früheren Publikation "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" übernommen, die im Oktober 2020 im FASEB Journal veröffentlicht wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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