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Biochemistry

स्तनधारी कोशिकाओं में एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग की जांच के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन

Published: June 30, 2021 doi: 10.3791/62621
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

इस पेपर का उद्देश्य सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं से रीसाइक्लिंग एंडोसोम तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करना है।

Abstract

एंडोसोमल तस्करी एक आवश्यक सेलुलर प्रक्रिया है जो जैविक घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को नियंत्रित करती है। प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली से आंतरिक होते हैं और फिर शुरुआती एंडोसोम्स में ले जाया जाता है। आंतरिक प्रोटीन को गिरावट के लिए लाइसोसोम में ले जाया जा सकता है या प्लाज्मा झिल्ली में वापस पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है। एंडोसाइटोसिस से झिल्ली सामग्री को हटाने को संतुलित करने के लिए एक मजबूत एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग मार्ग की आवश्यकता होती है। पाथवे को विनियमित करने के लिए विभिन्न प्रोटीन की सूचना दी जाती है, जिसमें एडीपी-रिबोसिलेशन फैक्टर 6 (ARF6) शामिल है । घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन कोशिका अंश के लिए एक शास्त्रीय विधि है। अपकेंद्रित्र के बाद, ऑर्गेनेल्स को उनकी आइसोपिक सतह पर तलछट किया जाता है। अंश एकत्र किए जाते हैं और अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाते हैं। यहां वर्णित घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं से रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। अलग अंशों को उनके प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण करने के लिए मानक पश्चिमी ब्लॉटिंग के अधीन किया गया था। इस विधि को नियोजित करके, हमने पहचान की कि चपेट और सेल मोटिविटी 1 (ELMO1), एक रास से संबंधित C3 बोटुलिनम टॉक्सिन सब्सट्रेट 1 (Rac1) ग्वानाइन न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर का प्लाज्मा झिल्ली लक्ष्यीकरण, ARF6-मध्यस्थता एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग के माध्यम से होता है।

Introduction

एंडोसोमल ट्रैफिकिंग एक आवश्यक शारीरिक प्रक्रिया है जो विभिन्न जैविक घटनाओं को फंसाती है1,उदाहरण के लिए, सिग्नलिंग रिसेप्टर्स, आयन चैनल और आसंजन अणुओं का परिवहन। प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीय प्रोटीन एंडोसाइटोसिस2द्वारा आंतरिक होते हैं। इसके बाद आंतरिक प्रोटीन को प्रारंभिक एंडोसोम 3 द्वारा छांटाजाताहै । कुछ प्रोटीन ों को4गिरावट के लिए लाइसोसोम्स करने का लक्ष्य रखा गया है । हालांकि, प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण राशि तेजी से रीसाइक्लिंग और धीमी रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं द्वारा सेल की सतह पर वापस पुनर्नवीनीकरण कर रहे हैं । फास्ट रीसाइक्लिंग में प्रोटीन शुरुआती एंडोसोम्स को छोड़ देते हैं और सीधे प्लाज्मा झिल्ली में लौट जाते हैं। इसके विपरीत, धीमी रीसाइक्लिंग में, प्रोटीन को पहले एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग डिब्बे में हल किया जाता है और फिर प्लाज्मा झिल्ली में वापस ले जाया जाता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न कार्गो प्रोटीन, क्लैथ्रिन, रेट्रोमर कॉम्प्लेक्स, कुत्ता जटिल और विस्कोट-एल्ड्रिच सिंड्रोम प्रोटीन, और निशान होमोलॉग (वॉश) परिसर, ऐसी झिल्ली रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं4,5,6,7,8,9। एंडोसाइटोसिस और रीसाइक्लिंग इवेंट का संतुलन सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है और विभिन्न सेलुलर घटनाओं10में योगदान देता है, उदाहरण के लिए, सेल आसंजन, सेल माइग्रेशन, सेल पोलरिटी और सिग्नल ट्रांसडक्शन।

ARF6, एक छोटा जीटीपीए,एंडोसाइटिक ट्रैफिकिंग7,11,12का एक सूचित नियामक है। रुचि के साथ, विभिन्न शोध समूहों ने एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग13 , 14, 15,16,17में ARF6केमहत्व को दर्शाया है। इस अध्ययन का उद्देश्य ARF6-मध्यस्थता न्यूराइट आउटग्रोथ और एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग के बीच संबंधों की जांच करना है । पिछली रिपोर्ट से पता चलता है कि ARF6 की सक्रियता CYTOkinesis 1 (DOCK180) जटिल 18 के ELMO1-समर्पित पर अभिनय के माध्यम सेRac1गतिविधि के लिए अपस्ट्रीम है । हालांकि, कैसे ARF6 ELMO1-DOCK180 मध्यस्थता Rac1 संकेत से चलाता है अस्पष्ट रहता है । इस तरह की प्रक्रिया में ARF6-मध्यस्थता एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग की भूमिका की जांच करने के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन नियोजित किया गया था। इसका उपयोग करके, रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश को सेल लाइसेट्स19से प्राप्त किया गया था। अंश प्रोटीन सामग्री विश्लेषण के लिए पश्चिमी दाग के अधीन था । इम्यूनोब्लॉट परिणामों से पता चला है कि FE65 की उपस्थिति के तहत, एक मस्तिष्क समृद्ध एडाप्टर प्रोटीन, सक्रिय ARF6 ने रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश में ELMO1 के स्तर को काफी बढ़ा दिया। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में स्तनधारी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने वाली (1) के लिए प्रक्रियाएं शामिल हैं; (2) नमूने और घनत्व ढाल कॉलम तैयार करना; और (3) रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश प्राप्त करना।

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Protocol

1. स्तनधारी सेल संस्कृति और ट्रांसफैक्शन

  1. प्लेट 2 x 106 कोशिकाओं में एक 100 मिमी संस्कृति पकवान. प्रत्येक ट्रांसफैक्शन के लिए चार व्यंजनों का उपयोग करें।
    नोट: आवश्यक कोशिकाओं की संख्या विभिन्न सेल लाइनों के लिए भिन्न हो सकती है। अलगाव कदम पर आगे बढ़ने से पहले अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।
  2. अगले दिन, निर्माता के निर्देशों के अनुसार लिपोफोक्टामाइन के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।

2. सेल हार्वेस्ट

  1. संस्कृति माध्यम 48 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन त्यागें।
  2. कोशिकाओं को बर्फ से ठंडे पीबीएस (10 एमएम सोडियम फॉस्फेट, 2.68 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 140 एमएम सोडियम क्लोराइड) से दो बार धोएं।
  3. प्रत्येक डिश में 1 मिलीएल बर्फ-ठंडे पीबीएस+ (पीबीएस 0.5x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल और 0.5x फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक) जोड़ें।
  4. कोशिका स्क्रैपर के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें और सेल निलंबन को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर स्विंग बाल्टी रोटर का उपयोग करके अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें।
  6. सुपरनैंट को त्यागें और होमोजेनाइजेशन बफर (एचबी; 250 mm सुक्रोज, 3 m imidazole पर पीएच 7.4, 1 m EDTA 0.03 m cycloheximide, 1x protease अवरोधक कॉकटेल, और 1xsphatase अवरोधक कॉकटेल) के 5 एमएल में धीरे सेल गोली को फिर से खर्च करें।
  7. 10 मिनट के लिए 1,300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए।
  8. एचबी के 1 एमएल में सेल पेलेट को रिस्पेंड करें।
  9. 15-20 स्ट्रोक के लिए एक Dounce समरूप के साथ कोशिकाओं को समरूप।
    नोट: अन्य समरूपता विधियों, उदाहरण के लिए, एक सिरिंज के माध्यम से नमूना पारित, इस्तेमाल किया जा सकता है । एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत समरूप देख कर समरूपता दक्षता प्रकट की जा सकती है।
  10. समरूप को 2 एमएल सेंट्रलाइजिंग ट्यूब में ट्रांसफर करें।
    नोट: 5x नमूना बफर के 12.5 माइक्रोन के साथ समरूप के 50 माइक्रोन की कटाई करें और इसे कुल lysate के रूप में लेबल करें।
  11. समरूप में एचबी का 0.7 एमएल जोड़ें।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर पतला समरूप स्पिन करें।
    नोट: गोली नाभिक और अटूट कोशिकाओं में शामिल हैं ।
  13. सुपरनेट के 1.5 एमएल ले लीजिए और एक बार चरण 2.12 दोहराएं।
  14. सुपरनैंट के 1.4 एमएल को इकट्ठा करें और इसे पोस्ट-न्यूक्लियर सुपरनेट (पीएनएस) के रूप में लेबल करें।

3. घनत्व ढाल स्तंभ तैयारी

  1. पीएन की 1.2 एमएल को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में ट्रांसफर करें।
  2. नमूने में 62% सुक्रोज समाधान (2.351 एम सुक्रोज, 3 m इमिडाजोल, पीएच 7.4 पर 3 m इमिडाजोल) का 1 एमएल जोड़ें और कोमल पिपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: परिणामी समाधान 40.6% सुक्रोज समाधान है।
  3. नमूने के शीर्ष पर ध्यान से 35% सुक्रोज समाधान (1.177 एम सुक्रोज, 3 m imidazole पर पीएच 7.4) के 3.3 एमएल जोड़ें।
  4. 35% सुक्रोज समाधान के शीर्ष पर ध्यान से 25% सुक्रोज समाधान (0.806 एम सुक्रोज, 3 m इमिडाजोल) के 2.2 एमएल जोड़ें।
    नोट: कमरे के तापमान पर 62%, 40.6%, 35%, और 25% सुक्रोज समाधान का अपवर्तक सूचकांक क्रमशः 1.44, 1.40, 1.39 और 1.37 है। सुक्रोज समाधानों के अपवर्तक अनुक्रमित को प्रयोग की सटीकता और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए अप्रेक्टोमीटर के साथ जांचा जा सकता है।
  5. अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन ट्यूब को एचबी से भरें।
    नोट: अस्थायी रूप से तैयार घनत्व ढाल स्तंभ को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. पुनर्वितरण और रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश की वसूली

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 210,000 x ग्राम पर कॉलम सेंट्रलाइज करें।
  2. ढाल के ऊपर से शुरू, ध्यान से 12 अंश (1 mL प्रत्येक) ले लीजिए।
    नोट: रीसाइक्लिंग एंडोसोम्स 35% और 25% सुक्रोज समाधानों के बीच इंटरफ़ेस पर पाए जाने चाहिए। एकत्र किए गए अंशों को तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रोजन किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. कमजोर पड़ने वाले बफर (पीएच 7.4, 1 एमएम ईडीटीए में 3 एमएम इमिडाजोल) के 1 एमएल के साथ सभी अंशों को पतला करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 100,000 x ग्राम पर पतला नमूना अपकेंद्रित्र करें।
  5. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और अंशों को फसल करने के लिए 1x नमूना बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  6. पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा अंशों में प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण करें।

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Representative Results

घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा असंक्रमित HEK293 कोशिकाओं को अलग करने के बाद, ढाल के ऊपर से शुरू 12 अंश एकत्र किए गए थे। काटे गए अंशों को 1:1 अनुपात में कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ पतला किया गया था और दूसरे दौर के अपकेंद्रित्र के अधीन किया गया था। इसके बाद नमूनों को उनकी प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग के अधीन किया गया । जैसा कि चित्र 1में दर्शाया गया है , रीसाइक्लिंग एंडोसोम मार्कर आरएबी 11 अंश 720में पाया गया है । β-सीओपी, कॉक्स चतुर्थ, गप्प, ईईए1, राब 7 और लैंप1 सहित अन्य उपकोशिकीय मार्कर की भी जांच की गई । एक सकारात्मक EEA1 संकेत भी अंश 7 में के रूप में अच्छी तरह से पता चला है । दोनों अंश 7 और PNS में GAPDH, कॉक्स चतुर्थ, और Rab11 के बैंड तीव्रता ImageLab सॉफ्टवेयर (बायो रेड) के साथ मापा गया । अंश 7 से पीएनएस में मार्कर के तीव्रता अनुपात की गणना की गई और एसडी ± एक बार चार्ट में व्यक्त किया गया।

पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि ARF6 और ELMO1 RAC1-मध्यस्थता न्यूराइट आउटग्रोथ21, 22को बढ़ावा देने के लिए FE65 के साथ बातचीत करते हैं । चूंकि ARF6 एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग का एक नियामक है और ELMO1 प्लाज्मा झिल्ली लक्ष्यीकरण बाद में Rac1 सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण है, यह परिकल्पना है कि FE65 प्लाज्मा झिल्ली के लिए ELMO1 की तस्करी मध्यस्थता करने के लिए ARF6 और ELMO1 जोड़ता है । इसलिए, इस विधि को अलग रीसाइक्लिंग एंडोसोम्स में ELMO1 स्तर की जांच करने के लिए नियोजित किया गया था। HEK293 कोशिकाओं को या तो ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, या ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 से संक्रमित थे । ARF6 Q67L और FE65 ओवरएक्सप्रेशन(चित्रा 2A)के साथ ELMO1 वितरण में कोई परिवर्तन नहीं पाया गया । इसके बाद, अंश 7 (Rab11-positive) में ELMO1 स्तर की तुलना विभिन्न ट्रांसफैक्शन के बीच की गई। अंश में ELMO1 की मात्रा ARF6 Q67L के सह-ट्रांसफैक्शन के बाद तरक्की करने के लिए पाया जाता है । ELMO1 के स्तर में और वृद्धि तब देखी जाती है जब ARF6 Q67L और FE65 दोनों सह-व्यक्त(चित्रा 2B)हैं। इसके विपरीत, FE65 के नॉकआउट अंश 7(चित्रा 2C)में ARF6-मध्यस्थता ELMO1 संवर्धन कम ।

Figure 1
चित्रा 1:घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के बाद 7 अंश में रीसाइक्लिंग एंडोसोम पाए जाते हैं। असंक्रमित HEK293 कोशिकाओं का आंशिक रूप से उपयोग किया गया था और प्राप्त अंशों में प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण पश्चिमी ब्लॉटिंग के साथ किया गया था। Rab11 एक विरोधी Rab11 एंटीबॉडी (1:500) के साथ अंश 7 में पाया जाता है । अन्य उपकोशिकीय मार्कर β-सीओपी (1:1000), कॉक्स चतुर्थ (1:1000), GAPDH (1:10,000), EEA1 (1:1000), Rab7 (1:500), और Lamp1 (1:1000) सहित उनके विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पता चला । अंश 1 कम घने शीर्ष अंश है, जबकि अंश 12 डेंजर नीचे अंश है। बार चार्ट PNS ± एसडी के लिए अंश 7 में GAPDH, कॉक्स चतुर्थ, और Rab11 के अनुपात से पता चलता है । इस आंकड़े को चान, डब्ल्यू डब्ल्यू आर एट अल22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:FE65 की अभिव्यक्ति ELMO1 के ARF6-मध्यस्थता एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग को बढ़ावा देता है । (ए)या तो ELMO1, ELMO1 + ARF6 Q67L, या ELMO1 + ARF6 Q67L + FE65 के साथ संक्रमित कोशिकाओं घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग कर अंशित किया गया । सभी अंशों को ELMO1, ARF6 Q67L, और FE65 के वितरण का विश्लेषण करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग के अधीन किया गया था। अंश 1 कम घने शीर्ष अंश है, जबकि अंश 12 डेंजर नीचे अंश है। (ख)विभिन्न ट्रांसफैक्शन से Rab11-सकारात्मक अंश 7 का विश्लेषण पश्चिमी ब्लॉटिंग के साथ ELMO1 और ARF6 Q67L के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । अंश 7 में ELMO1 की मात्रा तब बढ़ा दी गई थी जब कोशिकाएं ARF6 Q67L के साथ सह-ट्रांसफेक्टिंग थीं। ARF6 Q67L और FE65 की सह-अभिव्यक्ति अंश में ELMO1 की मात्रा को और बढ़ाती है। (C)वाइल्डटाइप HEK293 ELMO1 या ELMO1 + ARF6 Q67L से संक्रमित था, जबकि FE65 KO HEK293 ELMO1 + ARF6 Q67L से संक्रमित था । ARF6-मध्यस्थता ELMO1 अंश 7 में संवर्धन काफी FE65 KO कोशिकाओं में कम हो गया । (बी-सी) रीसाइक्लिंग एंडोसोम मार्कर Rab11 (1:500) और साइटोसोल मार्कर GAPDH (1:10,000) की जांच की गई । ELMO1, FE65, और ARF6 Q67L एंटी-ELMO1 B-7 (1:1000), एंटी-FE65 ई-20 (1:1000), और एंटी-माइक 9B11 (1:5000) के साथ क्रमशः पता चला । अंश 7 में ELMO1 के सापेक्ष स्तर अंश 7/कुल ELMO1 में ELMO1 के घनत्व अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया था । बार चार्ट के लिए डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे । बोनफेरोनी पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ वन-वे अर्नोवा को सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया था। * पी < 0.001। परिणाम एसडी22± गुना परिवर्तन का मतलब है । इस आंकड़े को चान, डब्ल्यू डब्ल्यू आर एट अल22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

उपरोक्त प्रोटोकॉल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा सुसंस्कृत कोशिकाओं से रीसाइक्लिंग एंडोसोम को अलग करने की प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। इस विधि की विश्वसनीयता को नवीनतम प्रकाशन22द्वारा प्रदर्शित किया गया है, जिससे यह साबित होता है कि रीसाइक्लिंग एंडोसोम्स को अन्य ऑर्गेनेल्स(चित्रा 1)जैसे गोलगी उपकरण और माइटोकॉन्ड्रिया से सफलतापूर्वक अलग किया जाता है। एक अच्छा पृथक्करण परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर ध्यान देने की आवश्यकता है । सुक्रोज समाधान तैयार करते समय, समाधानों के अपवर्तक अनुक्रमित को अपफ्रैक्टोमीटर के साथ मान्य करने की सिफारिश की जाती है। कमरे के तापमान पर 62%, 35%, और 25% सुक्रोज समाधान का अपवर्तक सूचकांक क्रमशः 1.44, 1.39 और 1.37 है। साथ ही एयर बबल्स को रेडिएंट से भी बचना चाहिए। कॉलम में बुलबुले की उपस्थिति ढाल की निरंतरता को बाधित कर सकती है। होमोजेनाइजेशन प्रक्रिया में डिटर्जेंट से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे ऑर्गेनेल्स की झिल्ली को नुकसान पहुंचाते हैं। इससे झिल्ली से बंधे ऑर्गेनेल्स से प्रोटीन रिलीज होता है और इसके परिणामस्वरूप गंभीर संदूषण हो सकता है । इसके अलावा, समरूपता के दौरान प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए उपयोग से पहले सभी समरूप उपकरणों को पूर्व-ठंडा किया जाना चाहिए। एक बार ढाल तैयार हो जाने के बाद, इसे जितनी जल्दी हो सके उपयोग किया जाना चाहिए। यद्यपि तैयार ढाल को अस्थायी रूप से 4 डिग्री सेल्सियस (1-2 घंटे) पर संग्रहीत किया जा सकता है, लंबे समय तक भंडारण प्रसार के कारण घनत्व ढाल में हस्तक्षेप कर सकता है।

सुक्रोज अपनी आसान उपलब्धता के कारण एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला ढाल माध्यम है। दरअसल, परकोल और फिकोल-40023, 24सहित कई अन्य विकल्प हैं। सुक्रोज की तुलना में इन मीडिया में अलग-अलग भौतिक गुण होते हैं। उदाहरण के लिए, परकोल में सुक्रोज की तुलना में कम ऑस्मोलैअरिटी और चिपचिपाहट होती है। ये कम अपकेंद्रित्र बलों का उपयोग कर कणों की तेजी से बैंडिंग की अनुमति देते हैं । फिकोल-400 में अपने उच्च आणविक वजन और डायलिज्यम सामग्री की कम सामग्री के कारण सुक्रोज की तुलना में झिल्ली की ओर कम पाररियता है। इसलिए, ढाल माध्यम बदलने से उच्च एंडोसोम आइसोलेशन दक्षता प्राप्त हो सकती है।

घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के अलावा, अन्य तरीकों का उपयोग सेल फ्रैक्शन के लिए किया जा सकता है, जिसमें फ्री-फ्लो इलेक्ट्रोफोरेसिस (एफएएफई)25,फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड ऑर्गेनेल सॉर्टिंग (एफएओएस)26और इम्यूनोिसोलेशन27शामिल हैं। एफएफई एक तरल चरण पृथक्करण विधि है। नमूना प्रवाह दिशा के लंबवत विद्युत क्षेत्र के प्रभाव में पृथक्करण बफर के माध्यम से बहता है। विभिन्न ऑर्गेनेल्स का विक्षेप स्तर उनके सतह के शुल्क25के आधार पर भिन्न होता है । एफएओएस आमतौर पर विशिष्ट ऑर्गेनेल लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट टैग या एंटीबॉडी का उपयोग करता है और फिरअलगाव 28,29के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के बाद। इम्यूनोिसोलेशन लक्षित ऑर्गेनेल की सतह पर विशिष्ट एंटीजन का पता लगाने और30एंटीबॉडी द्वारा बाद में वर्षा पर निर्भर करता है।

इन विकल्पों के साथ तुलना करते समय, घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के अपने फायदे हैं। सबसे पहले, इच्छुक प्रोटीन का एक वितरण प्रोफ़ाइल अलग अंशों(चित्रा 2A)के साथ पश्चिमी दाग प्रदर्शन करके प्राप्त किया जा सकता है । प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण में किसी भी परिवर्तन का आसानी से पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, अल्ट्रासेंट्रफ्यूज अधिकांश संस्थानों में एक मानक साधन है, और अपकेंद्रित्र के संचालन के लिए तकनीकी आवश्यकता कम है। इसके विपरीत, एफएओएस और एफएएफई की अलगाव प्रक्रिया के लिए क्रमशः एक प्रवाह साइटोमीटर और एक विशिष्ट इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रणाली की आवश्यकता होती है। इम्यूनोिसॉलेशन के लिए कोई विशिष्ट उपकरण की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, इसका उपयोग मुख्य रूप से कोशिकाओं की एक छोटी संख्या से एंडोसोम को अलग करने के लिए किया जाता है। अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन का तैयारी पैमाना इम्यूनोइसोलेशन की तुलना में बड़ा है। इसके अलावा, इम्यूनोिसोलेशन31के लिए उच्च विशिष्टता वाला एंटीबॉडी आवश्यक है। इसके अलावा, डिटर्जेंट और उच्च नमक युक्त बफर का उपयोग एंडोसोम्स की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए धोने के चरणों में नहीं किया जा सकता है। इससे पृष्ठभूमि अधिक हो सकती है और अलग - अलग ऑर्गेनेल31की शुद्धता कम हो सकती है .

चूंकि घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन घनत्व के आधार पर ऑर्गेनेल्स को अलग करता है, इसलिए इसकी सबसे महत्वपूर्ण सीमा समान घनत्व वाले ऑर्गेनेल्स की ओर शक्ति को हल करने की है। जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है, रीसाइक्लिंग और शुरुआती एंडोसोम के समान भौतिक गुणों के कारण आरए 11 और ईईए 1 दोनों अंश 7 में पाए जाते हैं। रीसाइक्लिंग एंडोसोम में लक्षित प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए आगे कीख की जरूरत है। पिछले अध्ययन में, ELMO1 और Rab11 पर सह-इम्यूनोस्टेटिंग22कोशिकाओं में किया गया था । अन्य परखों को करने के अलावा इस समस्या से निजात पाने के लिए कुछ उपाय अपनाए जा सकते हैं। एक निरंतर घनत्व ढाल छोटे घनत्व मतभेदों के साथ ऑर्गेनेल्स को हल कर सकता है32. हालांकि, एक निरंतर ढाल में उपज एक असतत ढाल की तुलना में काफी कम है। लेटेक्स मोतियों के साथ कोशिकाओं का पूर्व-इलाज करके एंडोसोम के घनत्व में हेरफेर करना संभव है33. मोतियों को एंडोसाइटोसिस के माध्यम से कोशिकाओं द्वारा आंतरिक किया जाता है। एंडोसोम युक्त मोतियों का घनत्व काफी कम हो जाता है और अन्य ऑर्गेनेल्स से अलग किया जा सकता है। आमतौर पर, अलगाव का एक और स्तर जोड़ने से समान घनत्व वाले ऑर्गेनेल्स के अलगाव में काफी सुधार हो सकता है। उदाहरण के लिए, अलग अंश34से इम्यूनोइसोलेशन करें। एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके, रीसाइक्लिंग एंडोसोम्स को संदूषकों से अलग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट-लेबल वाले एंटीबॉडी और प्रोब्स, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के साथ संयुक्त, सटीक एंडोसोम अलगाव28के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। एफएफई अपने सतह के प्रभार25के आधार पर समान घनत्व वाले ऑर्गेनेल्स को अलग करने के लिए भी लागू है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे इस लेख की सामग्री के साथ ब्याज का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को रिसर्च ग्रांट काउंसिल हांगकांग, सीयूएचके डायरेक्ट ग्रांट स्कीम, यूनाइटेड कॉलेज एंडोमेंट फंड और टीयूवाईएफ चैरिटेबल ट्रस्ट के फंड्स ने सपोर्ट किया । इस काम के आंकड़े हमारे पिछले प्रकाशन से अनुकूलित किए गए थे, "ARF6-Rac1 सिग्नलिंग-मध्यस्थता न्यूराइट आउटग्रोथ को अक्टूबर 2020 में फासेब जर्नल में प्रकाशित ARF6 और ELMO1 के माध्यम से न्यूरोनल एडाप्टर FE65 द्वारा शक्तिशाली है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm Beckman Coulter 347287
100 mm tissue culture dish SPL 20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm Beckman Coulter C14277
5x Sample Buffer GenScript MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 4850S Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide Sigma-Aldrich C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL DWK Life Sciences 357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose HyClone SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7) Santa Cruz Biotechnology SC-271519 Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
FE65 antibody (E-20) Santa Cruz Biotechnology SC-19751 Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade HyClone SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) Ambion AM4300 Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software Bio-Rad Measurement of band intensity
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody Sigma G6160 Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb Cell Signaling Technology 2276S Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Calbiochem 4010-OP
Optima L-100 XP Beckman Coulter 392050
Optima MAX-TL Beckman Coulter A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media Gibco 31985070
PBS Tablets Gibco 18912014
PhosSTOP Roche 4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody Proteintech 20229-1-AP Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose Affymetrix AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062

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References

  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).

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बायोकेमिस्ट्री अंक 172 ARF6 घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन फ्रैक्शन राब11 रीसाइक्लिंग एंडोसोम सुक्रोज
स्तनधारी कोशिकाओं में एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग की जांच के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन
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Chan, W. W. R., Zhai, Y. Q., Lau, K. … More

Chan, W. W. R., Zhai, Y. Q., Lau, K. F. Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (172), e62621, doi:10.3791/62621 (2021).

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