Summary
أمراض الكبد هي الناجمة عن العديد من الأسباب التي تعزز التليف أو تليف الكبد. زرع هو الخيار الوحيد لاستعادة الصحة. ومع ذلك، ونظرا لندرة الأعضاء القابلة للزراعة، يجب استكشاف البدائل. تقترح أبحاثنا زرع سقالات الكولاجين في أنسجة الكبد من نموذج حيواني.
Abstract
أمراض الكبد هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. الإفراط في استهلاك الكحول، واتباع نظام غذائي عالي الدهون، والتهاب الكبد الوبائي C فيروس تعزيز التليف، تليف الكبد، و / أو سرطان الكبد. زرع الكبد هو الإجراء الموصى به سريريا لتحسين وإطالة العمر الافتراضي للمرضى في مراحل المرض المتقدمة. ومع ذلك، فإن 10٪ فقط من عمليات الزرع ناجحة، مع توافر الأعضاء، والإجراءات السابقة للجراحة وما بعد الجراحة، وارتفاع التكاليف يرتبط مباشرة مع تلك النتيجة. ظهرت سقالات المصفوفة خارج الخلية (ECM) كبديل لاستعادة الأنسجة. التوافق البيولوجي وقبول الكسب غير المشروع هي الخصائص المفيدة الرئيسية لتلك المواد الحيوية. على الرغم من أن القدرة على استعادة حجم ووظيفة الصحيح للكبد قد تم تقييمها في نماذج استئصال الكبد الكبد, لم يتم تقييم استخدام السقالات أو نوع من الدعم لتحل محل حجم كتلة الكبد extirpated.
تم إجراء استئصال الكبد الجزئي في كبد الفئران مع زراعة سقالة مصفوفة الكولاجين (CMS) من كوندل البقري. تمت إزالة أنسجة فص الكبد الأيسر (حوالي 40٪)، وزرعت نسبة متساوية من CMS جراحيا. تم تقييم اختبارات وظائف الكبد قبل وبعد العملية الجراحية. بعد أيام 3 و 14 و 21 ، تم قتل الحيوانات ، وأجريت تقييمات العيان والهسولوجيا. في اليومين 3 و 14 ، لوحظت الأنسجة الدهنية المحيطة ب CMS ، مع عدم وجود دليل سريري على الرفض أو العدوى ، وكذلك الشكل الجديد للأوعية وإعادة امتصاص CMS في اليوم 21. كان هناك دليل الهلوسة من عملية التهاب ضئيلة والهجرة من الخلايا المجاورة لCMS، لوحظ مع hematoxylin وeosin (H &؛ E) وتلطيخ ماسون ثلاثي الألوان. وقد ثبت أن CMS أداء جيدا في أنسجة الكبد ويمكن أن يكون بديلا مفيدا لدراسة تجديد الأنسجة وإصلاحها في أمراض الكبد المزمنة.
Introduction
الكبد هو واحد من أهم الأجهزة المشاركة في الحفاظ على التوازن وإنتاج البروتين1. لسوء الحظ، أمراض الكبد هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. في مراحل متقدمة من تلف الكبد، والتي تشمل تليف الكبد وسرطان الكبد الخلوي، زرع الكبد هو الإجراء الموصى به سريريا. ومع ذلك ، نظرا لندرة المتبرعين وانخفاض معدل عمليات الزرع الناجحة ، تم تطوير تقنيات جديدة في هندسة الأنسجة (TE) والطب التجديدي (RM)2،3.
TE ينطوي على استخدام الخلايا الجذعية، السقالات، وعوامل النمو4 لتعزيز استعادة الأعضاء الملتهبة، الليفية، والأنسجة1،5،6. المواد الحيوية المستخدمة في السقالات تحاكي ECM الأصلي ، وتوفير الإشارات الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية لإعادة عرض الخلوية الموجهة7. الكولاجين هو واحد من البروتينات الأكثر وفرة التي تم الحصول عليها من الأدمة والأوتار والأمعاء، وتوالف8،9. وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على الكولاجين باعتباره البوليمر الحيوي لإنتاج السقالات ثنائي وثلاثي الأبعاد من خلال الطباعة الحيوية أو electrospinning10،11. هذه المجموعة هي أول من أبلغ عن استخدام الكولاجين من مصدر العظام لتجديد أنسجة الكبد. وتفيد دراسة أخرى عن استخدام السقالات المركبة من الكولاجين البقري، والتي تم الحصول عليها من الجلد، مع المسام متجانسة وقريبة، دون أي اتصال بينهما12.
Decellularization يحافظ على ECM الأصلي، مما يسمح لدمج لاحق من الخلايا مع الخلايا الجذعيةالمحتملة 13،14. ومع ذلك ، لا يزال هذا الإجراء في المرحلة التجريبية في الكبد والقلب والكلى والأمعاء الدقيقة والمثانة البولية من الفئران والجرذان والأرانب والخنازير والأغنام والماشية والخيول3و14. حاليا، لا يتم استبدال حجم كتلة الكبد استئصالها في أي من نماذج استئصال الكبد الحيواني. ومع ذلك، فإن استخدام دعم إضافي أو شبكة (المواد الحيوية) التي تمكن من انتشار الخلايا وتولد الأوعية يمكن أن تكون ضرورية لاستعادة سريعة من وظائف الكبد parenchymal. وهكذا، يمكن استخدام السقالات كنهج بديلة لتجديد أو إصلاح الأنسجة في أمراض الكبد المزمنة، وبالتالي، القضاء على القيود الناجمة عن التبرع والمضاعفات السريرية لزرع الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة الأخلاقيات التابعة لكلية الطب (DI/115/2015) على هذا البحث في الجامعة الوطنية للطب ولجنة الأخلاقيات التابعة للمستشفى العام في المكسيك (CI/314/15). وتفي المؤسسة بجميع المواصفات التقنية لإنتاج الحيوانات المختبرية ورعايتها واستخدامها، وهي معتمدة قانونا بموجب القانون الوطني (NOM-062-ZOO-1999). تم الحصول على فئران الويستار الذكور التي يتراوح وزنها بين 150 و 250 جراما (6-8 أسابيع) من مرفق الحيوانات المختبري التابع لكلية الطب، UNAM، لهذه الدراسة.
1. الحصول على سقالات مصفوفة الكولاجين من عظم الفخذ البقري
- الحصول على condyle من عظم الفخذ البقري من مسلخ معتمد من قبل السلطات الصحية والزراعية في المكسيك.
- تشريح بعناية الدهون condyle, العضلات, والغضاريف مع أداة جراحية. قطع شظايا condyle إلى شظايا 3 سم × 3 سم باستخدام قاطع المنشار وتنظيف الدهون والدم بمنشفة. غسل شظايا كونديل بالماء.
- يغلي (92 درجة مئوية) شظايا مع 1 لتر من المنظفات أنيوني (10 غرام / لتر) لمدة 30 دقيقة. غسل شظايا كونديل مرتين لإزالة أي بقايا من المنظفات الأنيونية.
- جفف شظايا الكوندل لمدة 3 ساعات باستخدام ورق الفلتر (0.5 مم).
- إعداد مثلث (1 سم × 1 سم × 1 سم) CMS من سمك 0.5 سم من شظايا المذكورة في الخطوة 1.1(الشكل 1A).
- إزالة الألغام شظايا في 100 مل من 0.5 M HCl لمدة 10 دقيقة مع التحريض المستمر. إزالة HCl.
ملاحظة: تحييد HCl مع هيدروكسيد الصوديوم (10 م). - شطف شظايا ثلاث مرات مع 100 مل من الماء المقطر، 15 دقيقة في كل مرة، مع التحريض المستمر. قم بتجفيف نظام إدارة المحتوى بورق فلتر (0.5 مم) لمدة ساعة واحدة.
- استخدام مجهر ستيريو15 لتحليل الخصائص الهيكلية للCMS (حجم المسام، وتشكيل المسام، والترابط المسامية)(الشكل 1B).
- استخدام المجهر الإلكتروني المسحالضوئي 16 لتحليل السطح الخشن من trabeculae CMS (الشكل 1C).
- استخدام أداة تشريح لمزج وتمتد لتقييم التغيرات الميكانيكية (اللدونة والمرونة) من CMS(الشكل 1D).
- حزمة CMS في الحقيبة التعقيم وتعقيمها مع بلازما بيروكسيد الهيدروجين لمدة 38 دقيقة. تخزين CMS العقيمة في حزمة الأصلي في منطقة جافة في 20-25 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إزالة الألغام شظايا في 100 مل من 0.5 M HCl لمدة 10 دقيقة مع التحريض المستمر. إزالة HCl.
2. إعداد المنطقة الجراحية والتعامل مع وإعداد النموذج الحيواني
- تعقيم المنطقة الجراحية، قابلة للتطبيق، المجهر microsurgery، ومقعد مع محلول الكلورهيكسيدين 2٪. تعقيم جميع الأدوات الجراحية والإسفنج الجراحي ومسحات والستائر الجراحية القابلة للتصرف من خلال التعقيم الحراري (121 درجة مئوية / 30 دقيقة / 100 كيلو باسكال)
- تعيين الفئران (ن = 5) في ثلاث مجموعات من خمسة فئران لكل مجموعة: 1. صورية، 2. استئصال الهيباتيك، و 3. استئصال الهيباتيك بالإضافة إلى CMS، واتبع جميع المجموعات في الأيام 3 و 14 و 21 يوما.
- إعطاء الكيتامين (35 ملغم/كغ) والزيلازين (2.5 ملغم/كغ) عضليا في الطرف الخلفي.
ملاحظة: تستمر فترة المهدئات عادة لمدة 30-40 دقيقة. - حلق جلد البطن (5 سم × 2 سم) باستخدام الصابون الجراحي وشفرة ذات حدين ، وتطهير الجلد باستخدام محلول povidone-iodine الموضعي بنسبة 10٪ في ثلاث جولات17.
- وضع الحيوان على لوحة دافئة في موقف الظهر decubitus، مع فرط الرقبة للحفاظ على مجرى الهواء نفاذية(الشكل 2).
- تقييم عمق التخدير من خلال نمط الجهاز التنفسي وفقدان منعكس الانسحاب في الأطراف.
- ضع ستارة جراحية قابلة للتصرف حول الجلد الحليق واصنع شقا (2.5 سم) على خط البو مع مشرط ، باستخدام عملية xiphoid كنقطة مرجعية. تجنب الأوعية الدموية جدار البطن لمنع النزيف.
- وضع متراجع البطن في مكانه ومراقبة تجويف البطن. باستخدام ملقط تشريح، استخراج فص الكبد الأيسر ووضعه على لوحة معدنية(الشكل 3A).
ملاحظة: في المجموعة الصورية، فقط استخراج فص الكبد الأيسر ومن ثم إعادة الكبد إلى تجويف البطن. خياطة جدار البطن والجلد مع خياطة النايلون 3-0. - في المجموعات التجريبية مع وبدون CMS، استخدم شفرة مشرط وشفرة مشرط معقمة (#15) لإجراء استئصال الهيباتيك (حوالي 40٪) مع اثنين من التخفيضات. استخدم قالب معدني مثلث (1 سم × 1 سم × 1 سم) لإجراء عملية استئصال الهيباتيك(الشكل 3B).
- لمنع نزيف الكبد، حافظ على الضغط الجراحي مع مسحة على حافة الكبد لمدة 5 دقائق.
- هيدرات CMS في محلول ملحي معقم لمدة 20 دقيقة قبل العملية الجراحية. زرع CMS في موقع استئصال الكبد مع أربع غرز الغرز بين أنسجة الكبد وCMS لمنع تشريد المواد الحيوية. استخدام 7-0 غير قابل للامتصاص خيوط البولي بروبلين (الشكل 3C).
ملاحظة: لا تقم بإزالة الغرز في عملية جراحية ثانية; يمكن استخدام الغرز كمرجع لتحديد موقع زرع CMS. - أعد الكبد إلى تجويف البطن وخياطة جدار البطن والجلد مع خياطة نايلون 3-0. تنظيف الشق الجراحي مع اسفنجة جراحية غارقة في اليود في جولتين. مراقبة ورصد العلامات الحيوية للحيوانات.
- إعطاء الكيتامين (35 ملغم/كغ) والزيلازين (2.5 ملغم/كغ) عضليا في الطرف الخلفي.
3. الرعاية بعد الجراحة
- إدارة meglumine flunixin (2.5 ملغ / كغ) عضلي في الطرف الخلفي. إدارة المسكنات كما وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
- للتعافي من التخدير، ضع الحيوانات في صناديق البولي الفردية مع الفراش الحيواني المختبري في منطقة خالية من الضوضاء مع التحكم في درجة الحرارة (23 درجة مئوية).
- مراقبة انتعاش الحيوانات ورصد استهلاكها من المياه والغذاء لمدة 2 ساعة. مراقبة الحيوانات وظيفة المنطوق كما وافقت عليها لجنة الرعاية والاستخدام الحيواني المؤسسية.
4. تقييم وظائف الكبد في المصل
- جمع عينات الدم (500 ميكرولتر) من الأوردة الجانبية الذيل للحيوانات تخدير قبل العملية الجراحية (القيم الأساسية) وفي أيام التقييم 3, 14, و 21.
- الطرد المركزي عينات الدم في 850 × غرام/ 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية)؛ فصل المصل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إجراء لوحة من اختبارات وظائف الكبد: الألبومين المصل (ALB), الفوسفاتاز القلوية (ALP), ألانين أمينوتانسيراز (ALT), أسبارتات أمينوتانسيراز (AST), مجموع البيليروبين (السل), والبيليروبين المباشر (DB) (الجدول 1).
5. القتل الرحيم وإدارة الأنسجة
- تخدير الحيوانات لكل تقييم (أيام 3 و 14 و 21) باتباع البروتوكول المذكور أعلاه.
- القتل الرحيم عن طريق أساليب الموافقة من قبل لجنة الرعاية والاستخدام الحيواني المؤسسية.
- إجراء شق (5-6 سم) على خط البوس مع مشرط لمراقبة أعضاء تجويف البطن والتقاط صور لمنطقة استئصال الهيباتيك من الصور والمجموعات التجريبية، مع وبدون CMS.
- أخذ عينات الكبد (2 سم × 2 سم؛ 0.40-0.45 غرام) من جميع مجموعة الدراسة ووضعها في محلول الفورمالديهايد 4٪ لمدة 24 ساعة للتقييم النسيجي اللاحق.
6. التحليل النسيجي
- الحفاظ على أنسجة الكبد في 4٪ الفورمالديهايد وتجفيف الأنسجة باستخدام سلسلة من تركيزات الكحول (60٪، 70٪، 80٪، 90٪، 100٪). وضعها في xylene (1h) وجزءا لا يتجزأ منها في البارافين16.
- قطع كتل البارافين مع microtome إلى 4 أجزاء ميكرومتر سميكة لإعداد ثماني شرائح.
- أداء H &؛ E وماسون ثلاثي الألوانتلطيخ 16.
- مراقبة المقاطع الملطخة تحت المجهر الخفيفة لتحديد المناطق التمثيلية للكبد، مع وبدون CMS. الحصول على التصوير الضوئي في 4x و 10x و 40x التكبير ومعالجة الصور باستخدام البرامج المناسبة18 (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إزالة الألغام العظام يؤثر على الخصائص الميكانيكية للCMS دون تغيير الشكل الأصلي أو الربط بينالمسام. يمكن أن يكون CMS أي شكل، وبالتالي، يمكن تعديلها لحجم وشكل الجهاز أو الأنسجة المختارة19. في هذا البروتوكول، استخدمنا CMS الثلاثي(الشكل 1A-D). تم استخدام نموذج الفئران لتقييم القدرة التجديدية للزينومبلانت CMS في الكبد. على الرغم من أن الكبد هو عضو قابل للتفتيت والناعمة، فإن الإجراء الجراحي الذي تم إجراؤه في هذا البروتوكول يضمن بقاء CMS في مكانه(الشكل 2 والشكل 3A-C). مكن استئصال الكبد الجزئي من 40٪ من الفص الأيسر من تقييم جزء من الجهاز ، مع الحفاظ على بقية الكبد سليما ، بحيث يمكن مقارنة التغيرات في الزرع والبارينشيما الأصلية. بالإضافة إلى ذلك، حصلنا على عينات دم لتقييم وظائف الكبد قبل وبعد زرع CMS.
ولم تكن هناك اختلافات في التركيزات الأساسية للمعلمات الكيميائية الحيوية بين المجموعة الصورية والمجموعة التجريبية مع زرع CMS وبدونه في 3 و 14 يوما؛ بقيت ضمن القيم المرجعية (ALB: 0.43-2.41 g/dL; ALP: 134-357.3 U/L; ALT: 41-83.1 واجهة المستخدم/L; AST: 61.4-276.2 واجهة المستخدم / L; السل: 0.01-0.43 ملغم/ديسيلت; DB: 0.1 ملغ / ديسيلت)20. بالإضافة إلى ذلك، لم تكن هناك اختلافات في مستويات الألبومين، ALP، ALT، AST، السل، وDB بين المجموعة الصورية والمجموعات التجريبية في 21 يوما، مما يشير إلى أن CMS لا يعطل وظائف الكبد(الجدول 1).
خلال القتل الرحيم، كشف استئصال البطن الاستكشافي عن اللون النموذجي والحجم والشكل الصحيحين للكبد. لم يلاحظ أي التهاب أو عدوى في موقع الزرع في أي من الحالات. في اليوم الثالث، لم تحدث أي تغييرات في العضو فيما يتعلق تجويف البطن(الشكل 4A). في جزء يحتوي على أنسجة الكبد وCMS ، لوحظ أن الدم قد تسلل إلى CMS ، مع الدهون النهمة الملتصقة الأولية(الشكل 4B). في اليوم 14، زادت كمية الدهون. كان هناك إعادة تشكيل الأوعية الدموية ودمج CMS في أنسجة الكبد المتلقي ولكن لا تغييرات في الأمعاء الدقيقة أو أعضاء تجويف البطن(الشكل 5A). كانت الدهون النهمة أعلى في المنطقة الأمامية(الشكل 5B)مقارنة بالمنطقة الحشوية(الشكل 5C)في موقع زرع CMS. في يوم التقييم 21، كان إدماج CMS في الكبد أكثر وضوحا(الشكل 6A). ويمكن استخدام الزيادة في الدهون النهمة كمؤشر على تقدم التجديد، كما هو مصدر للخلايا الجذعيةالمتوسطة 21. وعلاوة على ذلك، في 21 يوما، قدم الكبد المناطق الكثيفة التي تتوافق مع التدهور والامتصاص، وتغيير حجم والشكل الأصلي(الشكل 6B).
لتحليل البنية المجهرية للكبد مع زرع CMS ، قمنا بإجراء تحليل النسيجي لشظايا تمثيلية من الأنسجة من موقع الزرع ، والتي تمت مقارنتها مع الأنسجة من فص الكبد الأيمن (التحكم). تم معالجة الخزعات التي أجريت في الأيام 3 و 14 و 21 وتعرضت لتلطيخ ثلاثي الألوان في H &؛ E وماسون. لوحظ الهيكل الطبيعي للبارنشيما الكبد في المجموعة صورية في اليوم 21(الشكل 7A والشكل 7E). في اليوم الثالث، أظهر التحليل النسيجي أن وجود CMS في الكبد لم يعزز رد فعل جسم غريب، ولوحظ وجود واضح للأنسجة الضامة المتراخية(الشكل 7B والشكل 7F). في اليومين 14 و 21 ، كان النسيج الضام المتراخية أكثر وفرة ، مع ترابيكولا CMS محاطة خلايا الكبد ، مما يشير إلى أن خلايا الكبد قد هاجرت إلى CMS (الشكل 7C والشكل 7G؛ الشكل 7D والشكل 7H). وأظهرت النتائج أيضا مناطق خلايا الكبد التي كانت تروى بواسطة وعاء(الشكل 8A). وكشف فحص دقيق أن خلايا الكبد التي التزمت trabeculae CMS كانت محاطة في بعض الأحيان من النسيج الضام التراخي(الشكل 8B-D). أجرى اثنان من أخصائيي علم الأمراض المستقلين مزدوجي التعمية التحليل النسيجي. ويجري حاليا إجراء فحوصات للكيمياء المناعية والبوليميراز المستندة إلى سلسلة التفاعل لتقييم البروتينات والجينات المختلفة المتعلقة بعملية تجديد الكبد.
وبالتالي ، فإن الملاحظات العيانية والمجهرية والقيم الكيميائية الحيوية تدعم اقتراحنا بأن CMS هو مادة حيوية مثالية لدعم وتعزيز تجديد الكبد. ومع ذلك، يجب تقييم زرع CMS لأكثر من 21 يوما لتحديد وقت امتصاصه واستعادة أنسجة الكبد كاملة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إجراء الدراسات التي تقيم البروتينات والجينات المختلفة المتعلقة بالتجديد الكبدي في وجود نظام الإدارة الوظيفية.
الشكل 1: عينة العظام وCMS. (أ) تم استخدام عينة مثلثة من عينة العظام لإعداد CMS. (ب)عرض مفصل للمسام والترابط أو الاتصال الطري لنظام الإدارة الوظيفية، كما لوحظ من خلال المجهر الإلكتروني. (ج)نظام الإدارة الوظيفية، كما رأينا تحت مجهر ستيريو. (د)تم التلاعب CMS مع أداة للتحقق من تعديل الخصائص الميكانيكية. اختصار: CMS = سقالة مصفوفة الكولاجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد الحيوان للجراحة. الحيوان هو في موقف الظهرية decubitus، وتبين منطقة البطن حلق، أعدت لاستئصال الهيباتيك وزرع CMS. اختصار: CMS = سقالة مصفوفة الكولاجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: استئصال الكبد من الفص الأيسر من الكبد. (أ)تم استخراج الفص الأيسر ووضعه على لوحة معدنية لإجراء استئصال الهيباتيك. (ب)تم إجراء استئصال الهيباتيك من 40٪ من الفص الأيسر في شكل مثلث، مثل CMS. (ج) يتم استبدال منطقة استئصال الهيباتيك من قبل CMS. اختصار: CMS = سقالة مصفوفة الكولاجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اليوم الثالث للتقييم. (أ) المراقبة العيانية لموقع الزرع في يوم التقييم الثالث. لم الكبد المزروعة مع (نجمة مليئة) CMS (خط منقط) لم تتغير في اللون أو الحجم. لم تظهر الأمعاء الدقيقة (النجمة الفارغة) وبقية هياكل البطن أي تعديلات. (ب)عينة من الكبد (نجمة مملوءة) وCMS (السهم الأبيض) مغطاة الدهون النهم (السهم الأحمر). اختصار: CMS = سقالة مصفوفة الكولاجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: اليوم الرابع عشر للتقييم. (أ) المراقبة العيانية لموقع الزرع في يوم التقييم 14. لم يتغير نسيج الكبد (نجمة مملوءة) مع CMS في اللون أو الحجم. لم تظهر الأمعاء الدقيقة (النجمة الفارغة) وبقية هياكل وأعضاء تجويف البطن أي تعديلات. عينة من الكبد مع CMS المزروعة: (ب) عرض الأمامية; (ج) عرض الخلفي / الحشوية. الدهون النهمة (السهم الأحمر) التي تغطي المنطقة. تم دمج CMS في أنسجة الكبد. الدهون النهمة (السهم الأحمر) يغطي أساسا المنطقة في المنظر الأمامي. يشير الخط المنقط إلى موقع زرع CMS؛ الغرز (الخيط الأزرق). اختصار: CMS = سقالة مصفوفة الكولاجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: اليوم الحادي والعشرون للتقييم. (أ) المراقبة العيانية لموقع الزرع في يوم التقييم 21. لم يغير الكبد المتلقي (النجم المملوء) المزروع ب CMS (الخط المنقط) اللون أو الحجم. لم تظهر الأمعاء الدقيقة (النجمة الفارغة) وبقية هياكل البطن أي تعديلات. (ب)عينة من الكبد مع CMS المزروعة (خط منقط) تظهر تغييرات في الحجم والشكل. اختصار: CMS = سقالة مصفوفة الكولاجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الأنسجة من الكبد والكبد مع CMS. أ)الكبد الطبيعي (SHAM) الذي يظهر بنية الأنسجة المميزة. (ب) اليوم الثالث من زرع CMS يظهر الأنسجة الضامة التراخي في trabeculae من CMS (البيضاوي متقطعة). (ج) منطقة الانتقال بين الكبد الأصلي (الجانب الأيمن) وCMS (الجانب الأيسر)، مع trabeculae من CMS (السهم). (د) الكبد الأصلي في اتصال مع CMS (خطوط منقط) في اليوم 21. (ه) الكبد الطبيعي مع بقعة ماسون ثلاثية الألوان. (F) وCMS زرع في الكبد; غزو النسيج الضام التراخي في اليوم 3 (البيضاوي متقطعة). (G)في اليوم 14، الكبد الأصلي مع trabeculae CMS، تبين مساحة من خلايا الكبد (نجمة مليئة) خارج الكبد الأصلي، مما يدل على أن خلايا الكبد الأصلي قد هاجرت من خلال CMS. (H)في اليوم 21، هاجرت خلايا الكبد الأصلية نحو CMS (السهم). A و E: أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر: 4x، B-D و F-H: أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر: 10x. A-D: H & E تلطيخ؛ E-H: تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان. الاختصارات: CMS = سقالة مصفوفة الكولاجين. H &؛ E = هيماتوكسيلين و إيوسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: الأنسجة من الكبد وCMS. (أ) تجمع من خلايا الكبد (السهم الأبيض) موجودة في trabeculae من CMS (السهم الأسود). يتم ري خلايا الكبد بواسطة وعاء (نجم مملوء). (ب)هاجرت خلايا الكبد (السهم الأبيض) وتمسكت trabeculae من CMS (السهم الأسود). (ج)لوحظ وجود مجموعة من خلايا الكبد (دائرة متقطعة) بين اثنين من trabeculae (السهام السوداء) من CMS. (د)وقد التزمت خلايا الكبد إلى trabeculae (السهام السوداء) من CMS في وجود النسيج الضام التراخي (البيضاوي متقطعة). A و C: أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر: 10x. B و D: أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر: 40x. اختصار: CMS = سقالة مصفوفة الكولاجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أيام | الشام | استئصال الهيباتيك | زرع CMS | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1.7± 0 | |
| ALT (وحدة IU/L) | 3 | 73±1.4 | 3.5±0.7 | 54.6±6.4 |
| 14 | 84±0 | 59.5±4.9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±0 | 73.5±14.8 | 73.5±14.8 | |
| AST (IU/L) | 3 | 106±1.4 | 80±6.6 | 90±1.4 |
| 14 | 127±5.5 | 94±21.2 | 83.5±17.6 | |
| 21 | 123.7±27.3 | 92.5±24.7 | 101±31.1 | |
| السل (ملغم/ديسيلت) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0.3±0 |
| 14 | 0.5±0 | 0.2±0 | 0.15±0 | |
| 21 | 0.3±0 | 0.4±0 | 0.4±0.14 | |
| DB (ملغ / ديسيلت) | 3 | 0.1±0 | 0.05±0.07 | 0.1±0 |
| 14 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 | |
| 21 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 |
الجدول 1: وظائف الكبد. تم إجراء اختبارات وظائف الكبد للمجموعات الصورية والتجريبية مع وبدون CMS في 3 و 14 و 21 يوما. الاختصارات: CMS = سقالة مصفوفة الكولاجين. ALB = الألبومين; ALP = فوسفاتاز قلوية؛ ALT = ألانين أمينوتانسفيراز; AST = أسبارتات أمينوتانسفيراز; السل = البيليروبين الكلي؛ DB = البيليروبين المباشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
زرع الأعضاء هو الدعامة الأساسية للعلاج في المرضى الذين يعانون من تليف الكبد أو تليف الكبد. يستفيد عدد قليل من المرضى من هذا الإجراء ، مما يجعل من الضروري توفير بدائل علاجية للمرضى على قائمة الانتظار. هندسة الأنسجة هي استراتيجية واعدة توظف السقالات والخلايا ذات الإمكانات التجديدية2و4و13. إزالة جزء من الكبد هو خطوة حاسمة في هذا الإجراء بسبب النزيف الغزير لهذا الجهاز الأوعية الدموية. لذلك ، يجب إجراء الهموستاسي في السرير الجراحي لمنع هذه المضاعفات. وعلاوة على ذلك، يتم تسهيل ربط أنسجة الكبد إلى CMS، وهو أمر ضروري لضمان التفاعل بين الأنسجة والمواد الحيوية، من خلال استخدام الغرز. ومع ذلك، يجب أن يتم ذلك بعناية لتجنب تمزق الكبد والتسبب في نزيف في وقت لاحق.
على الرغم من أن المادة الحيوية المقترحة هنا هي من أصل بقري (زينوجينيك)، لا توجد بيانات عن تفاعل المواد الحيوية في الفئران، مما يجعل استئصال الهيباتيك الانتقائي ممكنا. في المقابل ، تبين أن نموذج استئصال الكبد 2 /3 يسبب موت الحيوانات بسبب إزالة كمية كبيرة من أنسجة الكبد14. وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير قالب معدني الفولاذ المقاوم للصدأ لأننا كنا صعوبة في توحيد حجم في استئصال الهيباتيك وCMS. كان تعقيم CMS صعبا لأن التقنيات الحالية عدلت بنية الكولاجين وخصائصه الكيميائية الحيوية. وبالتالي، تم استكشاف التعقيم بالحرارة، وأشعة غاما، وأكسيد الإيثيلين كطرق تعقيم قبل تحديد أن بلازما بيروكسيد الهيدروجين هي التقنية المثلى13.
من الضروري تحديد الحجم الأقصى ل CMS التي يمكن زرعها في الكبد وتقييم الاستجابة البيولوجية على المستوى الجهازي. علاوة على ذلك ، من الضروري تحسين والتحقيق في فعالية هذه التقنية في أنواع الحيوانات الأكبر. وعلاوة على ذلك، من المهم التحقيق في آثار زرع CMS في الكبد لفترة أطول (>30 يوما)، والتي سوف تسمح بتقييم مدى الامتصاص البيولوجي لنظام الإدارة الوظيفية وتجديد الأنسجة الكبدية. وعلاوة على ذلك، يجب فحص آثار زرع CMS في النماذج الحيوانية مع تلف الكبد. وقد فتحت هذه الطريقة زرع الباب أمام استراتيجيات استكشاف استعادة شكل وحجم الأنسجة التي تم استئصالها، وبالتالي الحد من التخدير، ومدة الجراحية، ووقت الانتعاش4،13.
تم الحصول على CMS من مصدر طبيعي والحفاظ على خصائصه الفيزيائية والكيميائية مقارنة مع المواد الحيوية الاصطناعية المصنوعة باستخدام منهجيات معقدة، مثل الطباعة الحيوية أو الكهروسبينينج، والتي لا تضاهى بيولوجيا أو الاباسوربابلالحيوية 2،3. المكون الأساسي لهذا CMS هو نوع الكولاجين الأول، وهو البروتين الرئيسي في ECM الذي يمكن من التصاق الخلايا وانتشار22. بالإضافة إلى ذلك ، فإن trabeculae من مسام CMS تمكين هجرة الخلايا والتدفق المستمر لعوامل النمو والدم والوسطاء الآخرين لعملية التجديد. وفقا للأنسجة التي سيتم إصلاحها ، فإن هذه المجموعة البحثية لديها خبرة في تصميم CMS في أشكال مختلفة ، والحفاظ على بنيتها ثلاثية الأبعاد. على سبيل المثال ، تم زرع CMS أسطواني في مجرى البول الكلب والقناة الصفراوية في الخنازير وأسفرت عن نتائج واعدة في تجديد الأنسجة23،24.
زرع هذا CMS يمكن أن يكون علاجا بديلا لتحفيز تجديد الأنسجة واستعادة التوازن الليفي الليفي الليفي في تليف الكبد بسبب اشتدادات مختلفة (على سبيل المثال، الفيروس والكحول والعوامل الأيضية). يجب إجراء فحوصات الانتشار والهجرة والالتهاب لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية التي تسببها CMS. في الختام، تصف هذه الورقة إجراء قابل للاستنساخ لاستئصال الهيباتيك وكذلك فحص عملية التجديد من خلال زراعة المواد الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة. بينجامين ليون- مانسيلا هو طالب دكتوراه من برنامج الدكتوراه في العلوم الحيوية، الجامعة الوطنية للميكاسيكو وحصل على زمالة DGAPA-UNAM.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن يشكرا موظفي مرفق الحيوانات المختبري التابع لوحدة الطب التجريبي، والممرضة كارولينا بانيوس ج. على الدعم التقني والجراحي، وماركو غودينيو ز. على دعمهم في التصوير الدقيق، وإريك آبو على الدعم في علم أنسجة الكبد. دعم المجلس الوطني هذا البحث للعلوم والتكنولوجيا(كوناسيت)،رقم المنحة SALUD-2016-272579 وPAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
