Summary
Leversjukdomar framkallas av många orsaker som främjar fibros eller cirros. Transplantation är det enda alternativet för att återställa hälsan. Med tanke på bristen på transplanterbara organ måste dock alternativ undersökas. Vår forskning föreslår implantation av kollagenställningar i levervävnad från en djurmodell.
Abstract
Leversjukdomar är den främsta dödsorsaken i världen. Överdriven alkoholkonsumtion, en fettrik kost och hepatit C virusinfektion främjar fibros, cirros och/eller hepatocellulärt carcinom. Levertransplantation är det kliniskt rekommenderade förfarandet för att förbättra och förlänga livslängden för patienter i avancerade sjukdomsstadier. Endast 10% av transplantationerna är dock framgångsrika, med organtillgänglighet, presurgical och postsurgical förfaranden och förhöjda kostnader direkt korrelerade med det resultatet. Extracellulär matris (ECM) byggnadsställningar har dykt upp som ett alternativ för vävnad restaurering. Biokompatibilitet och ympningsacceptans är de viktigaste fördelaktiga egenskaperna hos dessa biomaterial. Även om förmågan att återställa storleken och korrekt funktion av levern har utvärderats i lever hepatectomy modeller, har användningen av byggnadsställningar eller någon form av stöd för att ersätta volymen av extirpated lever massa inte bedömts.
Partiell hepatectomy utfördes i en råtta lever med xenoimplantation av en kollagen matris byggnadsställning (CMS) från en bovin condyle. Vänster leverlob vävnad togs bort (cirka 40%), och en lika stor andel av CMS implanterades kirurgiskt. Lever funktion tester utvärderades före och efter kirurgiska ingreppet. Efter dagar 3, 14 och 21 avlivades djuren och makroskopiska och histologic utvärderingar utfördes. På dag 3 och 14 observerades fettvävnad runt CMS, utan kliniska tecken på avstötning eller infektion, liksom kärl neoformation och CMS reabsorption dag 21. det fanns histologic bevis på en obetydlig inflammation process och migration av intilliggande celler till CMS, observerade med hematoxylin och eosin (H&E) och Massons trichrome färgning. CMS visade sig fungera bra i levervävnad och kan vara ett användbart alternativ för att studera vävnadsregenerering och reparation i kroniska leversjukdomar.
Introduction
Levern är ett av de viktigaste organen som är involverade i att upprätthålla homeostas och proteinproduktion1. Tyvärr är leversjukdom den främsta dödsorsaken i världen. I avancerade stadier av leverskador, som inkluderar cirros och hepatocellulär carcinom, är levertransplantation det kliniskt rekommenderade förfarandet. Men på grund av bristen på donatorer och den låga andelen framgångsrika transplantationer har nya tekniker inom vävnadsteknik (TE) och regenerativ medicin (RM) utvecklats2,3.
TE innebär användning av stamceller, byggnadsställningar och tillväxtfaktorer4 för att främja restaurering av inflammerade, fibrotiska och edematösa organ och vävnader1,5,6. De biomaterial som används i byggnadsställningar efterliknar den inhemska ECM, vilket ger de fysiska, kemiska och biologiska ledtrådarna för guidad cellulär ombyggnad7. Kollagen är ett av de mest rikliga proteinerna som erhålls från dermis, sena, tarm och perikardium8,9. Dessutom kan kollagen erhållas som biopolymer för att producera två- och tredimensionella byggnadsställningar genom bioprinting eller elektrospinning10,11. Denna grupp är den första att rapportera användningen av kollagen från en benkälla för regenerering av levervävnad. En annan studie rapporterar användningen av byggnadsställningar syntetiserade från nötkreatur kollagen, som erhölls från huden, med homogena och nära belägna porer, utan någon kommunikation mellan dem12.
Decellularisering bevarar den ursprungliga ECM, vilket möjliggör efterföljande införlivande av celler med stamcellspotential13,14. Denna procedur är dock fortfarande i experimentfasen i lever, hjärta, njure, tunntarmen och urinblåsan från möss, råttor, kaniner, grisar, får, nötkreatur och hästar3,14. För närvarande ersätts inte den resected levermassavolymen i någon av djur hepatectomy-modellerna. Användning av ytterligare stöd eller nätverk (biomaterial) som möjliggör cellproliferation och angiogenes kan dock vara avgörande för snabb restaurering av lever parenkymal funktioner. Således kan byggnadsställningar användas som alternativa metoder för att regenerera eller reparera vävnad i kroniska leversjukdomar, vilket i sin tur eliminerar begränsningar på grund av donation och de kliniska komplikationerna av levertransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den aktuella forskningen godkändes av etikkommittén vid School of Medicine (DI/115/2015) vid Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) och etikkommittén för Hospital General de Mexico (CI/314/15). Institutionen uppfyller alla tekniska specifikationer för produktion, vård och användning av försöksdjur och är lagligt certifierad enligt nationell lagstiftning (NOM-062-ZOO-1999). Hanråttor från Hanen som väger 150-250 g (6-8 veckor) erhölls från Laboratoriedjuranläggningen vid School of Medicine, UNAM, för denna studie.
1. Erhålla kollagenmatrisställningar från bovin lårben
- Få condyle från bovin lårben från ett slakteri certifierat av hälso- och jordbruksmyndigheter i Mexiko.
- Dissekera försiktigt condyle fett, muskel och brosk med ett kirurgiskt instrument. Skär condylefragmenten i 3 cm x3 cm fragment med en sågskärare och rengör fettet och blodet med en handduk. Tvätta kondylfragmenten med vatten.
- Koka (92 °C) fragmenten med 1 L av ett anjoniskt rengöringsmedel (10 g/L) i 30 minuter. Tvätta condylefragmenten två gånger för att avlägsna eventuella rester av det anjoniska tvättmedlet.
- Torka kondylfragmenten i 3 timmar med filterpapper (0,5 mm).
- Förbered ett triangulärt (1 cm x1 cm x1 cm) CMS med tjocklek 0,5 cm från de fragment som nämns i steg 1.1 (figur 1A).
- Demineralisera fragmenten i 100 ml 0,5 M HCl i 10 minuter med konstant agitation. Ta bort HCl.
OBS: Neutralisera HCl med natriumhydroxid (10 M). - Skölj fragmenten tre gånger med 100 ml destillerat vatten, 15 min varje gång, med konstant omrörning. Torka CMS med filterpapper (0,5 mm) i 1 tim.
- Använd ett stereomikroskop15 för att analysera CMS strukturella egenskaper (porernas storlek, porbildning och porös sammanlänkning) (figur 1B).
- Använd ett scanningelektronmikroskop16 för att analysera den grova ytan av CMS trabeculae (figur 1C).
- Använd dissekeringsinstrumentet för blandning och sträckning för att utvärdera de mekaniska förändringarna (plasticitet och flexibilitet) i CMS(figur 1D).
- Packa CMS i steriliseringspåsen och sterilisera den med väteperoxidplasma i 38 minuter. Förvara det sterila CMS i originalförpackningen i ett torrt område vid 20-25 °C tills det används.
- Demineralisera fragmenten i 100 ml 0,5 M HCl i 10 minuter med konstant agitation. Ta bort HCl.
2. Förberedelse av operationsområdet samt hantering och beredning av djurmodellen
- Sanera operationsområdet, arbetsbord, mikrokirurgimikroskop och säte med 2% klorhexidinlösning. Sterilisera alla kirurgiska instrument, kirurgisk svamp, svabbprover och engångskirurgiskt draperi genom värmesterilisering (121 °C/30 min/100 kPa)
- Tilldela råttorna (n=5) i tre grupper om fem råttor per grupp: 1. sham, 2. hepatectomy och 3. hepatectomy plus CMS, och följ alla grupper på dag 3, 14 och 21 dagar.
- Administrera ketamin (35 mg/kg) och xylazin (2,5 mg/kg) intramuskulärt i bakbenet.
OBS: Den lugnande perioden varar vanligtvis i 30-40 min. - Raka bukhuden (5 cm x 2 cm) med kirurgisk tvål och ett dubbelsidigt blad och desinficera huden med utvärtes 10% povidone-jodlösning i tre omgångar17.
- Placera djuret på en varm tallrik i decilubitus dorsala läge, med nacken hyperextended för att upprätthålla en genomsläpplig luftväg (figur 2).
- Utvärdera anestesins djup genom andningsmönstret och förlust av abstinensreflexen i benen.
- Placera ett engångskirurgiskt draperi runt den rakade huden och gör ett snitt (2,5 cm) på albouslinjen med en skalpell, med xiphoidprocessen som referenspunkt. Undvik blodkärlet i bukväggen för att förhindra blödning.
- Sätt bukupprullningsdonet på plats och observera bukhålan. Använd dissekeringstångarna, extrahera den vänstra leverloben och placera den på metallplattan(figur 3A).
OBS: I sham gruppen, extrahera endast den vänstra leverloben och sedan återför levern till bukhålan. Suturera bukväggen och huden med en 3-0 nylon sutur. - I de experimentella grupperna med och utan CMS, använd ett skalpellblad och sterilt skalpellblad (#15) för att utföra hepatektomi (cirka 40%) med två skärsår. Använd en triangulär metallmall (1 cm x 1 cm x 1 cm) för att utföra hepatektomin (figur 3B).
- För att förhindra blödning i levern, upprätthålla kirurgisk komprimering med en bomullspinne på kanten av levern i 5 min.
- Återfukta CMS i steril saltlösning i 20 minuter före det kirurgiska ingreppet. Implantera CMS i hepatectomy platsen med fyra stygn suturer mellan levervävnaden och CMS för att förhindra förskjutning av biomaterialet. Använd 7-0 icke-absorberbara polypropylen suturer(figur 3C).
OBS: Ta inte bort suturerna vid en andra operation; suturer kan användas som referens för att identifiera platsen för CMS-implantation. - Sätt tillbaka levern i bukhålan och suturera bukväggen och huden med en 3-0 nylon sutur. Rengör det kirurgiska snittet med en kirurgisk jodddränkt svamp i två rundor. Observera och övervaka djurens vitala tecken.
- Administrera ketamin (35 mg/kg) och xylazin (2,5 mg/kg) intramuskulärt i bakbenet.
3. Postoperativ vård
- Administrera meglumin flunixin (2,5 mg/kg) intramuskulärt i bakbenet. Administrera smärtstillande medel som godkänts av den institutionella djurvårds- och användningskommittén.
- För anestesiåterhämtning, placera djuren i enskilda polykarbonatlådor med laboratoriedjurssängkläder i ett ljudfritt område med temperaturkontroll (23 °C).
- Observera djurens återhämtning och övervaka deras vatten- och matförbrukning i 2 timmar. Övervaka djur som är godkända av den institutionella djurvårds- och användningskommittén.
4. Utvärdering av leverfunktionen i serum
- Samla blodprover (500 μL) från de sövda djurens laterala svansvener före det kirurgiska ingreppet (utgångsvärden) och vid utvärderingsdagarna 3, 14 och 21.
- Centrifugera blodproverna vid 850 × g/10 min vid rumstemperatur (23 °C); separera serumet och förvara det vid -80°C tills det används.
- Utför en panel av leverfunktionstester: serumalbumin (ALB), alkalisk fosfatas (ALP), alanin aminotransferas (ALT), aspartat aminotransferas (AST), total bilirubin (TB) och direkt bilirubin (DB) (tabell 1).
5. Dödshjälp och vävnadshantering
- Bedöva djuren för varje utvärdering (dag 3, 14 och 21) genom att följa protokollet som beskrivs ovan.
- Avlivas med metoder som godkänts av den institutionella djurvårds- och användningskommittén.
- Utför ett snitt (5-6 cm) på albouslinjen med en skalpell för att observera organen i bukhålan och ta fotografier av hepatectomyområdet i bluffen och de experimentella grupperna, med och utan CMS.
- Ta leverprover (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) från alla försöksdjur i studiegruppen och placera dem i en 4% formaldehydlösning i 24 timmar för efterföljande histologisk utvärdering.
6. Histologisk analys
- Bevara levervävnaderna i 4% formaldehyd och dehydrera vävnaden med en serie alkoholkoncentrationer (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); placera dem i xylen (1h) och inbäddade dem i paraffin16.
- Skär paraffinblocken med en mikrotom i 4 μm tjocka sektioner för beredning av åtta diabilder.
- Utför H&E och Massons trichrome färgning16.
- Observera de färgade sektionerna under ett ljusmikroskop för att välja de representativa områdena i levern, med och utan CMS. Skaffa fotomikrografer vid 4x, 10x och 40x förstoring och bearbeta bilderna med lämplig programvara18 (se tabellen över material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Benavmineralisering påverkar cms mekaniska egenskaper utan att ändra den ursprungliga formen eller sammankopplingen av dess porer. CMS kan ha vilken form som helst och kan därför justeras till storleken och formen på det valda organet eller vävnaden19. I det här protokollet använde vi ett triangulärt CMS (figur 1A-D). En råtta modell användes för att utvärdera den regenerativa kapaciteten av CMS xenoimplant i levern. Även om levern är ett sprödt och mjukt organ, säkerställde det kirurgiska ingreppet som utfördes i detta protokoll att CMS förblev på plats (figur 2 och figur 3A-C). Den partiella hepatectomy av 40% av den vänstra loben gjorde det möjligt att bedöma en del av organet, hålla resten av levern intakt, så att förändringarna i implantatet och den inhemska parenkym kunde jämföras. Dessutom erhöll vi blodprover för att utvärdera leverfunktionen före och efter CMS implantation.
Det fanns inga skillnader i koncentrationer vid baslinjen av de biokemiska parametrarna mellan shamgruppen och den experimentella gruppen med och utan CMS implantation vid 3 och 14 dagar. De låg kvar inom referensvärdena(ALB:0,43-2,41 g/dL. ALP: 134-357.3 U/L; ALT: 41-83.1 UI/L; AST: 61.4-276.2 UI/L; TB: 0,01-0,43 mg/dL; DB: 0,1 mg/dL)20. Dessutom fanns det inga skillnader i nivåerna albumin, ALP, ALT, AST, TB och DB mellan shamgruppen och försöksgrupperna vid 21 dagar, vilket tyder på att CMS inte stör leverfunktionen(tabell 1).
Under dödshjälp, utforskande laparotomy visade den typiska färgen och rätt storlek och form av levern. Ingen inflammation eller infektion observerades vid implantationsstället i något av fallen. På dag 3 fanns det inga förändringar i organet i förhållande till bukhålan (figur 4A). I en del som innehöll levervävnad och CMS observerades blod ha infiltrerat CMS, med begynnande vidhäftande omentalt fett (figur 4B). På dag 14 ökade mängden fett; det fanns blodkärl neoformation och integrering av CMS i mottagar levervävnad men inga förändringar i tunntarmen eller organen i bukhålan (figur 5A). Omentalt fett var högre i den främre zonen (figur 5B) jämfört med visceralzonen (figur 5C) i CMS-implantationsstället. På utvärderingsdag 21 var CMS-inkorporering i levern tydligare (figur 6A). Ökningen av omentalt fett kan användas som en indikator på regenereringens framsteg, eftersom det är en källa till mesenkymala stamceller21. Dessutom, vid 21 dagar, presenterade levern täta områden som motsvarade nedbrytning och absorption, ändra storlek och originalform (figur 6B).
För att analysera leverns mikrostruktur med CMS-implantatet utförde vi histologisk analys av ett representativt fragment av vävnad från implantationsstället, som jämfördes med vävnad från rätt leverlob (kontroll). Tarmbiopsier som utfördes på dag 3, 14 och 21 bearbetades och utsattes för H&E och Massons trikroma färgning. Den normala strukturen hos leverparenkym observerades i skengruppen dag 21 (figur 7A och figur 7E). På dag 3 visade den histologiska analysen att närvaron av CMS i levern inte främjade en främmande kroppsreaktion, och den iögonfallande närvaron av slapp bindväv observerades (figur 7B och figur 7F). På dag 14 och 21 var den slappa bindväven rikligare, med CMS trabeculae omgiven av hepatocyter, vilket tyder på att hepatocyter hade migrerat till CMS (figur 7C och figur 7G; Figur 7D och figur 7H). Resultaten visade också områden av hepatocyter som bevattnades av ett fartyg (figur 8A). En noggrann inspektion visade att de hepatocyter som hade följt CMS trabeculae ibland var omgivna av slapp bindväv(figur 8B-D). Två dubbelblindade oberoende patologer utförde histopatologiska analysen. Immunohistokemi och polymeraskedjereaktionsbaserade analyser pågår för att utvärdera de olika proteiner och gener relaterade till leverregenereringsprocessen.
Således stöder makroskopiska och mikroskopiska observationer och de biokemiska värdena vårt förslag att CMS är ett idealiskt biomaterial för att stödja och främja leverregenerering. CMS implantation måste dock utvärderas i mer än 21 dagar för att bestämma dess absorptionstid och slutföra återställning av levervävnad. Dessutom bör studier som utvärderar de olika proteiner och gener relaterade till leverregenerering i närvaro av CMS genomföras.
Figur 1: Benprov och CMS. (A) Ett triangulärt prov av benprovet användes för att förbereda CMS. b)En detaljerad vy över cms porer och sammanlänkning eller trabekulära anslutning, enligt elektronmikroskopi. (C)CMS, sett under ett stereomikroskop. ( D) CMS-manipulering med ett instrument utfördes för att kontrollera modifieringen av mekaniska egenskaper. Förkortning: CMS = kollagenmatrisställning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Förbereda djuret för operation. Djuret är i decubitus dorsala position, visar rakade buken området, förberedd för hepatectomy och CMS implantation. Förkortning: CMS = kollagenmatrisställning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Hepatectomy av leverns vänstra lob. (A) Den vänstra loben extraherades och placerades på metallplattan för att utföra hepatectomy. (B) Hepatectomy av 40% av den vänstra loben utfördes i en triangulär form, som CMS. c) Området för hepatektomin ersätts av CMS. Förkortning: CMS = kollagenmatrisställning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Utvärderingsdag 3. (A) Makroskopisk observation av implantationsstället på utvärderingsdag 3. Levern implanterad med (fylld stjärna) CMS (prickad linje) ändrades inte i färg eller storlek. Tunntarmen (tom stjärna) och resten av buken strukturer visade inga förändringar. b)Prov av levern (fylld stjärna) och CMS (vit pil) täckt med omentalt fett (röd pil). Förkortning: CMS = kollagenmatrisställning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Dag 14 av utvärderingen. (A) Makroskopisk observation av implantationsstället på utvärderingsdag 14. Levervävnaden (fylld stjärna) med CMS ändrades inte i färg eller storlek. Tunntarmen (tom stjärna) och resten av strukturerna och organen i bukhålan visade inga förändringar. Prov av levern med det implanterade CMS: (B) främre vyn; C)bakre/visceral vy. Omentalt fett (röd pil) som täcker området. CMS integrerades i levervävnaden. Det omentala fettet (röd pil) täcker huvudsakligen området i den främre vyn. Den prickade linjen indikerar platsen för CMS-implantation; suturer (blå tråd). Förkortning: CMS = kollagenmatrisställning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Utvärderingsdag 21. A)Makroskopisk observation av implantationsstället vid utvärderingsdag 21. Mottagarlevern (fylld stjärna) implanterad med CMS (prickad linje) ändrade inte färg eller storlek. Tunntarmen (tom stjärna) och resten av buken strukturer visade inga förändringar. (B) Prov av levern med den implanterade CMS (prickad linje) som visar förändringar i storlek och form. Förkortning: CMS = kollagenmatrisställning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Leverens och leverns histologi med CMS. (A) Normal lever (SHAM) som visar den karakteristiska vävnadsarkitekturen. (B) Dag 3 av CMS-implantation som visar slapp bindväv i cms trabeculae (streckade ovaler). c)Övergångszon mellan den ursprungliga levern (höger sida) och CMS (vänster sida), med cms (pilens trabeculae). ( D) Inbyggd lever i kontakt med CMS (prickade linjer) på dag 21. (E) Normal lever med Massons trikroma fläck. f)CMS som implanteras i levern. invasion av slapp bindväv på dag 3 (streckad oval). ( G) På dag 14, inhemsk lever med CMS trabeculae, som visar ett område av hepatocyter (fylld stjärna) utanför den inhemska levern, vilket indikerar att de inhemska hepatocyterna hade migrerat genom CMS. (H) På dag 21 har de inhemska hepatocyterna migrerat mot CMS (pil). A och E: Skalstänger = 200 μm: 4x, B-D och F-H: Skalstänger = 100 μm: 10x. A-D: H&E färgning; E-H: Massons trikroma färgning. Förkortningar: CMS = kollagenmatrisställning; H&E = hematoxylin och eosin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Lever histologi och CMS. (A) Pool av hepatocyter (vit pil) som finns i cms trabeculae (svart pil). Hepatocyterna bevattnas av ett kärl (fylld stjärna). b)Hepatocyter (vit pil) har migrerat och hållit sig till CMS (svart pil). c)En grupp hepatocyter (streckad cirkel) observeras mellan två trabeculae (svarta pilar) i CMS. (D)Hepatocyter har hållit sig till trabeculae (svarta pilar) av CMS i närvaro av slapp bindväv (streckad oval). A och C: Skalstänger = 100 μm: 10x. B och D: Skalstänger = 20 μm: 40x. Förkortning: CMS = kollagenmatrisställning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Dagar | BLUFF | Hepatektomi | Implantation CMS | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1,7± 0 | |
| ALT (IU/L) | 3 | 73±1.4 | 3.5±0.7 | 54.6±6.4 |
| 14 | 84±0 | 59.5±4.9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±0 | 73.5±14.8 | 73.5±14.8 | |
| AST (IU/L) | 3 | 106±1.4 | 80±6.6 | 90±1.4 |
| 14 | 127±5.5 | 94±21.2 | 83,5±17,6 | |
| 21 | 123,7±27,3 | 92,5±24,7 | 101±31.1 | |
| TB (mg/dL) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0.3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0.2±0 | 0.15±0 | |
| 21 | 0.3±0 | 0,4±0 | 0.4±0.14 | |
| DB (mg/dL) | 3 | 0.1±0 | 0,05±0,07 | 0.1±0 |
| 14 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 | |
| 21 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 |
Tabell 1: Leverfunktion. Lever funktion tester utfördes för bluff och experimentella grupper med och utan CMS på 3, 14 och 21 dagar. Förkortningar: CMS = kollagenmatrisställning; ALB = Albumin; ALP = Alkalisk fosfatas; ALT= Alanin aminotransferas; AST = Aspartat aminotransferas; TB = Totalt bilirubin; DB = Direkt bilirubin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organtransplantation är stöttepelaren för behandling hos patienter med leverfibros eller cirros. Några patienter drar nytta av denna procedur, vilket gör det nödvändigt att tillhandahålla terapeutiska alternativ för patienter på väntelistan. Vävnadsteknik är en lovande strategi som använder byggnadsställningar och celler med regenerativ potential2,4,13. Avlägsnandet av en del av levern är ett kritiskt steg i detta förfarande på grund av den ymniga blödningen av detta vaskulariserade organ. Därför måste hemostas av den kirurgiska sängen utföras för att förhindra denna komplikation. Dessutom underlättas bindningen av levervävnaden till CMS, som är avgörande för att säkerställa vävnad-biomaterialinteraktion, genom användning av suturer. Det måste dock göras noggrant för att undvika att riva levern och orsaka senare blödning.
Även om det biomaterial som föreslås häri är av nötkreaturs ursprung (xenogena), finns det inga data om biomaterial reaktion hos råttor, vilket gör selektiv hepatectomy möjligt. Däremot har 2/3 hepatectomy-modellen visat sig orsaka djurens död på grund av avlägsnandet av en stor mängd levervävnad14. Dessutom utvecklade vi en metallmall i rostfritt stål eftersom vi hade svårt att standardisera storleken i hepatektomin och CMS. Sterilisering av CMS var utmanande eftersom de befintliga teknikerna modifierade kollagenstrukturen och dess biokemiska egenskaper. Sterilisering genom värme, gammastrålning och etylenoxid undersöktes därför som steriliseringsmetoder innan man fastställde att plasma av väteperoxid var den optimala tekniken13.
Det är viktigt att bestämma den maximala storleken på CMS som kan implanteras i levern och utvärdera det biologiska svaret på systemisk nivå. Vidare är det nödvändigt att optimera och undersöka effektiviteten av denna teknik hos en större djurart. Dessutom är det viktigt att undersöka effekterna av CMS-implantationen i levern under en längre period (>30 dagar), vilket gör det möjligt att bedöma omfattningen av CMS biosorption och regenerering av levervävnaden. Vidare måste effekterna av CMS-implantationen undersökas i djurmodeller med leverskador. Denna implantationsmetod har öppnat dörren till strategier som utforskar restaureringen av formen och volymen av resected vävnad, vilket minskar anestesi, kirurgisk varaktighet och återhämtningstid4,13.
CMS erhölls från en naturlig källa och bevarade dess fysikaliska och kemiska egenskaper jämfört med syntetiska biomaterial som tillverkats med hjälp av komplexa metoder, såsom bioprintning eller elektrospinning, som inte är biokompatibla eller bioabsorberbara2,3. Den primära komponenten i detta CMS är kollagen typ I, som är det viktigaste proteinet i ECM som möjliggör cell vidhäftning och spridning22. Dessutom möjliggör trabeculae av CMS porer cellmigration och det kontinuerliga flödet av tillväxtfaktorer, blod och andra medlare i regenereringsprocessen. Enligt den vävnad som ska repareras har denna forskargrupp erfarenhet av att designa CMS i olika former och bevara dess 3D-struktur. Till exempel implanterades cylindrisk CMS i hund urinrör och gallgång hos grisar och gav lovande resultat i vävnadsregenerering23,24.
Implantationen av detta CMS kan vara en alternativ behandling för att stimulera vävnadsregenerering och återställa fibrogenes-fibrolysbalansen i levercirros på grund av olika etiologier (t.ex. virus, alkohol, metabola faktorer). Spridning, migration och inflammation analyser måste utföras för att identifiera de molekylära och cellulära mekanismer som utlöses av CMS. Sammanfattningsvis beskriver detta dokument ett reproducerbart förfarande för hepatectomy samt undersökning av regenereringsprocessen genom xenoimplantation av biomaterial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Benjamín León-Mancilla är doktorand vid Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) och han fick DGAPA-UNAM-stipendium.
Acknowledgments
Författarna vill tacka personalen vid laboratoriedjursanläggningen vid enheten för experimentell medicin, sjuksköterska Carolina Baños G. för tekniskt och kirurgiskt stöd, Marco E. Gudiño Z. för stöd i mikrofotografier och Erick Apo för stöd i lever histologi. Det nationella rådet stödde denna forskning för vetenskap och teknik(CONACyT),bidragsnummer SALUD-2016-272579 och PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
